EHP、SHIV雙重TaqMan實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的構(gòu)建及應(yīng)用

侯月娥，曾俊霞，藍(lán)間媛，許棗珠，廖秀云，羅寶正

（1.珠?？扑嚻諜z測科技有限公司，珠海 51900；2.拱北海關(guān)技術(shù)中心，珠海 519015）

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）是2009年于泰國養(yǎng)殖池塘生長遲緩的斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）中發(fā)現(xiàn)的專門寄生于細(xì)胞內(nèi)的原生生物[1-2]。主要感染凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對蝦（Penaeusm onodon）等重要養(yǎng)殖蝦類[3]，F(xiàn)legel（2012）報道，EHP在泰國和越南出現(xiàn)白便綜合征（white feces syndrome，WFS）的斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦中有較高的檢出率，且嚴(yán)重感染蝦肝腸胞蟲。對蝦血細(xì)胞虹彩病毒最早于1993年在靠近厄瓜多爾的對蝦養(yǎng)殖場中的原糙對蝦（Protrachypene precipua burkenroad）中被發(fā)現(xiàn)的，病蝦癥狀活力較差，肝胰腺明顯萎縮，肌肉發(fā)白，腸道發(fā)紅、斷裂，空腸空胃，鰓、步足及游泳足發(fā)黑。2017年，我國第一次在南美白對蝦上發(fā)現(xiàn)蝦血細(xì)胞虹彩病毒，根據(jù)蝦感染該病毒后的臨床癥狀和病理癥狀，命名為蝦血細(xì)胞虹彩病毒（Shrimp hemocyte iridovirus,SHIV）[4]。SHIV和EHP是我國對蝦養(yǎng)殖過程中的兩種新發(fā)疫病，前者導(dǎo)致對蝦大量的死亡，后者導(dǎo)致對蝦生長緩慢，參差不齊，甚至生長停滯，僅偶爾伴隨有白便或者在應(yīng)激條件下才出現(xiàn)大量死亡，所以養(yǎng)殖投入高但收獲甚微，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，對蝦病害種類較多，診斷手段主要包括病理學(xué)和生物學(xué)方法、免疫診斷法分子雜交[2,5-6]、電鏡觀察及PCR技術(shù)。已建立的常規(guī)PCR技術(shù)，靈敏性較高，多為一次檢測一種病原，但是其耗時較長，需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，容易對環(huán)境造成污染。而雙重實(shí)時熒光定量PCR不僅可以同時檢測兩種病原，并且耗時較少，病原核酸添加以后整個過程無需開蓋操作，檢測結(jié)果可以直接呈現(xiàn)在電腦或檢測儀器上，靈敏度為普通PCR的100倍，大大提高了檢測結(jié)果的敏感性和準(zhǔn)確性。更利于對病原的早期診斷，便于及時采取有效的防治措施。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 蝦肝腸胞蟲（EHP）、SHIV、白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus,W S S V）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV）、高致病性副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）以及桃拉綜合征病毒（Tauras syndrome virus,TSV）陽性樣品均為本實(shí)驗(yàn)室采自珠海南美白對蝦患有該病的樣品，經(jīng)PCR檢測并測序后確認(rèn)為陽性。

1.2 主要試劑 病毒DNA/RNA小量制備試劑盒購自廣州吉瑞基因科技有限公司；AceQ qPCR Probe Master Mix購自Vazyme公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒以及普通質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自O(shè)mega。

1.3 雙重?zé)晒舛縋CR引物和探針的設(shè)計 通過對EHP和SHIV所有已知序列利用MegAlign進(jìn)行同源性分析，確定其保守序列，然后根據(jù)EHP（GenBank登錄號：FJ496356.1）和SHIV（GenBank登錄號：KY681040.1）的保守核酸序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo7設(shè)計軟件設(shè)計特異性引物和熒光探針（表1），引物探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 總核酸的提取及模板的制備

1.4.1 組織樣品的處理 先在2 mL勻漿管中加入約3粒鋼珠，大鋼珠1粒（直徑4.5 mm），小鋼珠2粒（直徑2.5 mm）；取發(fā)病蝦組織（肝胰腺、腮、腸道、肌肉）約100 mg病料至管中，加入500 μL PBS；將勻漿管置于組織勻漿器中勻漿1 min，-40℃凍存至少30 min，再放回常溫溶解，反復(fù)凍融2～3次，每次凍融均置于組織勻漿器勻漿1次；10 000×g離心5 min，取約200 μL上清液于1.5 mL離心管中，編號備用。

1.4.2 核酸提取 依據(jù)Mabio病毒DNA/RNA提取試劑盒的說明書操作，陽性對照也需要同時提取的核酸保存于-20℃?zhèn)錂z。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 取1.4.2中提取的總核酸。分別進(jìn)行SHIV和EHP目的基因擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)；72℃延伸8 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出SHIV（114 bp）和EHP（92 bp）目的基因。將獲得的兩種PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化，分別克隆至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆重組質(zhì)粒，送上海輝睿生物科技有限公司測序鑒定。對于鑒定正確的重組質(zhì)粒，分別命名為pMD-SHIV和pMD-EHP。對陽性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測定，拷貝數(shù)計算，分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增 以提取的SHIV和EHP的核酸DNA為模板，反應(yīng)體系如下：AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，將引物SHIV-F、SHIV-R、EHP-F、EHP-R和探針稀釋至終濃度為0.1～0.6 μmol/mL，模板DNA為2 μL，無RNase的ddH2O補(bǔ)足20 μL。實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，55℃～65℃退火30 s，40個循環(huán)，按照不同體系，不同濃度配比，不同的退火溫度進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，篩選出最好的體系、引物、探針濃度及退火溫度

1.7 實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將1.5制備的SHIV和EHP的DNA標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，用不同稀釋梯度的RNA作為模板，每個梯度的DNA設(shè)立3個重復(fù)。使用優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，退火溫度根據(jù)1.6摸索出來的最適溫度，40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時進(jìn)行熒光信號采集。

1.8 雙重實(shí)時熒光定量PCR

1.8.1 敏感性試驗(yàn) 將測定好DNA濃度的模板進(jìn)行10倍系列稀釋，用本研究建立的雙重實(shí)時熒光定量PCR測定其敏感性。

1.8.2 特異性試驗(yàn) 以提取的SHIV、EHP、IHHNV、WSSV核酸為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性。

1.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對已知濃度的質(zhì)粒107copies/μL進(jìn)行10倍梯度稀釋，用已構(gòu)建的SHIV和EHP雙重?zé)晒舛糠椒ㄟM(jìn)行批次間的重復(fù)試驗(yàn)。將上述的同一樣品放置1個月，用相同條件對其進(jìn)行批次間的重復(fù)試驗(yàn)。

1.8.4 樣品檢測試驗(yàn) 選取已知的SHIV和EHP陽性、陰性的樣品共37份，用本研究建立的SHIV和EHP雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法進(jìn)行臨床檢測。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 重組質(zhì)粒的PCR檢測結(jié)果顯示，SHIV和EHP的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分別為114 bp和92 bp，與預(yù)期大小一致（圖1、圖2）。測序結(jié)果表明，克隆的蝦肝腸胞蟲目的基因序列、蝦血細(xì)胞虹彩病毒目的基因序列分別與蝦肝腸胞蟲參考序列（GenBank登錄號：FJ496356.1）、蝦血細(xì)胞虹彩病毒參考序列（GenBank登錄號：KY681040.1）的相似性達(dá)100%。證明目的基因被成功插入載體中。

圖1 pMD-EHP PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification of pMD-SHIV

圖2 pMD-EHP PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification of pMD-EHP

2.2 雙重實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增 通過對SHIV和EHP單項(xiàng)和雙重實(shí)時熒光定量PCR的條件優(yōu)化，SHIV-F/SHIV-R的終濃度為0.4 μmoL/mL，探針終濃度為0.2 μmol/mL，EHP-F/EHP-R的終濃度為0.35 μmoL/mL，探針終濃度為0.25 μmoL/mL，退火溫度為60℃時，對同一標(biāo)準(zhǔn)品的檢測信號值最強(qiáng)，Ct值最小。

2.3 雙重實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 SHIV和EHP的熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，其DNA混合液的梯度濃度從1×107copies/μL～1×101copies/μL的7個線性梯度的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線呈等距性和平行性，具有較好的梯度性（圖3）。

圖3 SHIV（A）和EHP（B）的real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Real-time PCR standard curve of SHIV（A） and EHP（B）

2.4 雙重實(shí)時熒光定量PCR特異性、敏感性以及穩(wěn)定性

2.4.1 特異性試驗(yàn) 以SHIV、EHP、IHHNV、WSSV的基因組為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，僅有SHIV、EHP二者相應(yīng)的熒光信號為陽性，其他病毒的檢測均為陰性，說明此次構(gòu)建的雙重實(shí)時熒光定量PCR方法的特異性較強(qiáng)（圖4）。

圖4 雙重實(shí)時熒光PCR體系的特異性檢測Fig.4 Specific test of the real-time PCR system for SHIV and EHP

2.4.2 敏感性試驗(yàn) 將體外轉(zhuǎn)錄純化后的SHIV和EHP的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸蛋白檢測儀測定其濃度，計算其拷貝數(shù)，然后10倍系列梯度稀釋為1×107copies/μL～1×101copies/μL，利用本研究建立的SHIV和EHP雙重實(shí)時熒光定量進(jìn)行擴(kuò)增，得到SHIVV和EHP探針法實(shí)時熒光定量PCR的動力學(xué)擴(kuò)增曲線（圖5），在Ct＜40范圍內(nèi)可以檢出的最低DNA量為10 copies/μL，因此建立的此方法敏感性可以達(dá)到10 copies/μL。與本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的檢測SHIV和EHP普通PCR及SYBR Green real-time PCR法相比較，是SYBR green real-time PCR敏感性的10倍（圖6、7）、普通PCR法敏感性的100倍（圖8）

圖5 熒光定量 RT-PCR體系的敏感性檢測Fig.5 Sensitivity test of the real-time PCR for SHIV and EHP

圖6 SHIV SYBR Green real-time PCR敏感性檢測（A）和SHIV熔解曲線（B）Fig.46 Se nsitivity test of the SYBR real-time PCR for SHIV（A） and melting curve for SHIV（B）

圖7 EHP SYBR Green real-time PCR敏感性檢測（A） 和EHP熔解曲線 （B）Fig.7 Sensitivity test of the SYBR real-time PCR for EHP （A） and melting curve for EHP （B）

圖8 SHIV （a） 和EHP （b）普通PCR敏感性檢測Fig.8 Sensitivity test of the PCR for SHIV and EHP

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 由實(shí)驗(yàn)室不同試驗(yàn)操作人員批內(nèi)、批間的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的變異系數(shù)均小于4%（表2），具有良好的穩(wěn)定性。

表2 EHP和SHIV雙重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 Re petitive and stability verification of EHP and SHIV duplux real-time PCR

2.4.4 樣品檢測試驗(yàn) 對37份已知臨床病料樣品進(jìn)行檢測結(jié)果顯示，EHP和SHIV共同陽性2份，EHP拷貝數(shù)約為3.1×103copies/μL和5.6×104copies/μL，S H I V的拷貝數(shù)約為4.1×1 04c o p i e s/μ L和6.1×105copies/μL；單EHP陽性的11份，拷貝數(shù)為5.2×102copies/μL～3.2×106copies/μL；單SHIV陽性7 份，拷貝數(shù)為1.1×102copies/μL ～ 4.4×106copies/μL；其余樣品為陰性，與已知樣品結(jié)果的符合率為100%。

3 討論

EHP不會在的感染前期引起蝦的大面積死亡，因此往往不會受到重視，使得EHP在南美白對蝦養(yǎng)殖中廣泛傳播，造成的經(jīng)濟(jì)損失也越來越嚴(yán)重，直接或間接威脅著整個對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[7]。目前EHP已在越南、中國、印尼、馬來西亞和泰國等國家流行。SHIV主要感染體長5～6 cm的蝦，傳染性較強(qiáng)，能夠引起蝦的大面積死亡，魚類[8]和蝦蟹類[9-10]均可攜帶SHIV，由于尚缺乏特效的藥物和有效的控制方法，造成養(yǎng)殖投入高但收獲甚微，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

實(shí)時熒光定量PCR由于能在很寬的動態(tài)范圍內(nèi)特異性地準(zhǔn)確測定核酸的含量，近年來已逐漸成為檢測各種DNA或RNA病原的主流技術(shù)，SYBR GreenⅠ[11]和TaqMan探針實(shí)時定量PCR檢測，其中TaqMan探針通過采用不同的熒光基團(tuán)，在實(shí)時熒光定量中的應(yīng)用使擴(kuò)增產(chǎn)物特異性地發(fā)出熒光信號，該技術(shù)在畜牧獸醫(yī)和水產(chǎn)領(lǐng)域的病原檢測中得到了廣泛應(yīng)用[12-14]。

根據(jù)該兩種病在南美白對蝦上的發(fā)病狀況，從源頭對病原進(jìn)行監(jiān)測，本實(shí)驗(yàn)室研究建立了一種快速、準(zhǔn)確的雙重實(shí)時熒光定量PCR方法，該方法從引物和探針的設(shè)計上有效的避免了自身二聚體內(nèi)耗以及非特異性擴(kuò)增，通過調(diào)整各引物和探針的濃度實(shí)現(xiàn)二者擴(kuò)增效率的平衡。與單項(xiàng)PCR技術(shù)相比，雙重?zé)晒舛縋CR的方法無需進(jìn)行凝膠電泳，可采集熒光信號通過電腦直接顯示結(jié)果，不同的熒光信號增加了結(jié)果判斷的客觀性，實(shí)現(xiàn)了高效、低成本的快速檢測。

該方法對SHIV和EHP標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的檢測靈敏度可以達(dá)到10個 copies/μL，比普通PCR敏感100倍，從樣品核酸提取到檢驗(yàn)完成，整個檢測反應(yīng)只需2 h，大大提高了SHIV和EHP檢測效率，可滿足高通量檢測。還可以通過對DNA模板的定量，來實(shí)現(xiàn)對病原的檢測，對分析SHIV和EHP載量和開展病原防控研究具有重要意義。對IHHNV、WSSV、VP以及TSV病毒無交叉反應(yīng)，說明本方法具有很好的特異性。通過批內(nèi)和批間的重復(fù)試驗(yàn)，變異系數(shù)均小于4%，有良好的穩(wěn)定性。應(yīng)用SHIV和EHP雙重?zé)晒舛糠椒▽?7個臨床樣品進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。該方法靈敏度高、成本低、操作簡單，適用于親蝦、苗種和養(yǎng)殖環(huán)境的快速檢測。篩選簡單易行，可在SHIV和EHP的發(fā)病早期提供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，為有效防控SHIV和EHP提供了技術(shù)支撐。