偽狂犬病病毒gB和gE蛋白重組表達(dá)及抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

張洪亮，郝占武，解倩倩，王鳳雪，張 志，韓先杰，單 虎，溫永俊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 山東省新獸藥創(chuàng)制協(xié)同創(chuàng)新中心 青島市獸醫(yī)生物技術(shù)工程研究中心，青島 266109；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）屬皰疹病毒科中皰疹病毒Ⅰ型，可引起多種動(dòng)物發(fā)病，包括豬、綿羊、狗、牛、貓、狐貍、水貂、鼠、兔等35種，豬是其唯一自然宿主[1-3]。疫苗免疫不充分和疫苗不合理應(yīng)用會(huì)造成該病的發(fā)生[4]。2011年下半年，由于PRV變異株的出現(xiàn)，我國(guó)多個(gè)地區(qū)豬場(chǎng)報(bào)道有偽狂犬病的暴發(fā)[5]。其中感染母豬流產(chǎn)率高達(dá)35%，以神經(jīng)癥狀為特征的仔豬死亡率大于20%，豬感染野生型病毒的幾率高達(dá)50%，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[6]。

PRV基因組可編碼多種蛋白質(zhì)，其中g(shù)B蛋白是該病毒主要的免疫原，刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體對(duì)病毒有較強(qiáng)的中和能力，若有補(bǔ)體參與，將產(chǎn)生更強(qiáng)的中和作用[7]；gE基因是PRV主要的毒力因子，在病毒跨神經(jīng)元傳播過(guò)程中發(fā)揮重要作用，缺失gE基因的PRV毒株對(duì)小鼠和仔豬的毒力大幅降低[8]。由于目前臨床上應(yīng)用的PRV疫苗多為gE基因缺失活疫苗，因而基于gE蛋白的抗體檢測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)免疫豬與自然感染豬的合理區(qū)分。在此基礎(chǔ)上，基于gB蛋白的抗體檢測(cè)方法能夠?qū)ωi群總體免疫水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)而指導(dǎo)免疫，對(duì)PRV防控和凈化具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增豬偽狂犬病病毒gB基因708 bp的核心抗原區(qū)和gE基因621 bp的核心抗原區(qū)，并與原核表達(dá)載體pET32a連接，分別構(gòu)建了pET-32a-gB、pET-32a-gE原核表達(dá)重組載體，將以上構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株中進(jìn)行表達(dá)，純化后作為包被抗原，建立了PRV野毒和疫苗毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法，旨在為豬偽狂犬病的防控和凈化提供抗體檢測(cè)技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 毒株、載體、主要試劑 PRV Bartha-K61株、閔A株由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；DH5α、BL21（DE3）、XhoⅠ、BamHⅠ和HindⅢ、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR試劑盒、DNA膠回收試劑盒、IPTG、DNA和蛋白marker購(gòu)自TaKaRa公司；DNAzol?Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒（PA110）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司公司；蛋白純化試劑盒、細(xì)菌裂解液購(gòu)自Novagen公司；HRP標(biāo)記兔抗豬IgG二抗購(gòu)自US Biological公司；ELISA高結(jié)合力板購(gòu)自Costar公司；pET-32a表達(dá)載體、PRV多克隆抗體、PRV陽(yáng)性血清和陰性血清、豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV-2）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）陽(yáng)性血清均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；IDEXX PRV gB抗體檢測(cè)試劑、IDEXX PRV gI/gE抗體檢測(cè)盒均購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參照NCBI中已公布的PRV SuHV-1株全基因組序列（GenBank登錄號(hào)：NC-006151）分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增PRV gB基因和gE基因主要抗原區(qū)的特異性引物，在上、下游引物5′端分別加入酶切位點(diǎn)。gB-F：5′-GGATCCACCATGGCGC GCCTGCAGTTCACCTACG-3′；gB-R：5′-AAGCT TGCCGAGGCCCTGGAAGAAGTTGG-3′；gE-F：5′-GGATCCACCATGGGCCCCGTCACCGAGGTCC CGAGTC-3′；gE-R：5′-CTCGAGGGGCGAGAAG AGCTGCGAGTGG-3′。

1.3 目的基因的PCR擴(kuò)增 按照DNAzol?Reagent說(shuō)明書提取PRV Bartha-K61疫苗株（擴(kuò)增gB基因）與PRV閔A株（擴(kuò)增gE基因）總DNA，用30 μL DEPC水稀釋。分別用引物gB-R/F和gE-R/F進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）為：2× PrimeSTAT GC Buffer 12.5 μL，dNTP 2 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.2 μL，gB-R/F、gE-R/F各1 μL，ddH2O 6.3 μL，DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸42 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定分析。

1.4 目的基因克隆及重組載體構(gòu)建 利用DNA膠回收試劑盒純化gB和gE基因片段，分別與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，按照質(zhì)粒DNA提取試劑盒說(shuō)明小量提取重組質(zhì)粒。將重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-gB、pGEM-T-gE及原核表達(dá)載體分別進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物鑒定純化后用T4 DNA連接酶于16℃過(guò)夜連接，并轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒。經(jīng) 菌液PCR及測(cè)序鑒定后獲得重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET32a-gB、pET32a-gE。

1.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 分別取pET32a-gB、pET32agE重組菌液20 μL加入2 mL含有氨芐的LB培養(yǎng)基后，37℃條件下180 rpm培養(yǎng)12 h。取培養(yǎng)后的菌液400 μL加入20 mL的LB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于菌液OD600在0.4～0.5時(shí)加入誘導(dǎo)物IPTG，在37℃、0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)5 h，同時(shí)設(shè)pET32a菌液誘導(dǎo)和重組菌液未誘導(dǎo)兩個(gè)對(duì)照組。收集菌液，7000 ×g離心5 min，棄上清液，用15 mL的PBS（pH7.4）重懸沉淀，7000 ×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL PBS重懸沉淀，冰浴超聲破碎后，用0.45 μm的濾菌器過(guò)濾，過(guò)濾后的菌液用不含有溴酚藍(lán)的蛋白質(zhì)5×上樣緩沖液溶解。對(duì)上述處理的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6 重組蛋白純化與Western blot鑒定 將上述處理好的蛋白樣品按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Ni-NTA His層析純化，并利用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃過(guò)夜封閉，加入PRV陽(yáng)性血清（100倍稀釋），37℃作用1 h，加入HRP標(biāo)記兔抗豬IgG抗體（4000倍稀釋），37℃作用1 h，ECL顯色。

1.7 間接ELISA方法的建立

1.7.1 矩陣法確定抗原最佳包被量和血清最佳稀釋度 將純化后的PRV gB、gE重組蛋白用pH9.6的碳酸鹽緩沖液從每孔 5.0 μg按2倍倍比稀釋至0.039 μg，加入96孔板，每孔100 μL，4℃包被12 h；用包被液（碳酸鹽緩沖液pH9.6）振蕩洗滌1次，每次2 min；0.25%的PVA溶液（碳酸鹽緩沖液pH9.6溶解）每孔300 μL，37℃封閉2 h；PBS振蕩洗滌2次，每次2 min；5%脫脂奶粉（PBS溶解）每孔300 μL，37℃封閉30 min，洗滌液洗滌3次，每次2 min；陽(yáng)性與陰性血清按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋，每孔100 μL，37℃反應(yīng)45 min；ELISA洗滌液振蕩洗滌3次，每次2 min；加入1∶10 000倍稀釋的HRP標(biāo)記兔抗豬IgG 100 μL，37℃孵育30 min；ELISA洗滌液洗滌3次，每次2 min；避光加入TMB底物顯色液100 μL，室溫避光顯色15 min；加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。

1.7.2 反應(yīng)臨界值的確定 按上述最佳實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)24份陰性血清，在酶標(biāo)儀上測(cè)定血清的OD450值，計(jì)算數(shù)據(jù)平均值（ˉx）和標(biāo)準(zhǔn)方差（SD），明確陰、陽(yáng)性判定條件。

1.7.3 特異性試驗(yàn) 按照上述最佳反應(yīng)條件，對(duì)CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、FMDV、PEDV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)PRV陰、陽(yáng)性血清對(duì)照，作3個(gè)重復(fù)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)所建gB和gE抗體間接ELISA檢測(cè)方法的特異性。另采用美國(guó)IDEXX公司試劑盒檢測(cè)各血清，比較兩者的檢測(cè)結(jié)果。

1.7.4 敏感性試驗(yàn) 按上述最佳反應(yīng)條件，將PRV陽(yáng)性血清按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12 800稀釋，檢測(cè)不同稀釋倍數(shù)的陽(yáng)性血清，根據(jù)檢測(cè)最高血清稀釋度來(lái)評(píng)價(jià)所建gB和gE抗體間接ELISA檢測(cè)方法的敏感性。

1.7.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按上述最佳反應(yīng)條件，用同一批次包被的酶標(biāo)板檢測(cè)10份血清，每份血清進(jìn)行5次重復(fù)檢測(cè)，以評(píng)價(jià)gB和gE抗體間接ELISA檢測(cè)方法的批內(nèi)重復(fù)性；用5個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板檢測(cè)10份血清，計(jì)算平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)方差（SD），根據(jù)變異系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)所建gB和gE抗體間接ELISA檢測(cè)方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 PRV gB和gE基因的擴(kuò)增 分別以PRV Bartha-K61株與閩A株核酸為模板，PCR擴(kuò)增了gB和gE基因主要抗原區(qū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳分析，獲得大小為708 bp的gB基因和621 bp的gE基因目的條帶（圖1）。

圖1 PRV gB和gE基因主要抗原區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of major antigenic regions of PRV gB and gE genes

2.2 PRV gB和gE基因的克隆及重組載體構(gòu)建 分別將gB和gE目的基因連接至pGEM-T載體和pET-32a載體，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后，分別獲得708 bp的gB目的基因片段和621 bp的gE目的基因片段（圖2、圖3），結(jié)合PCR鑒定和重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEMT-gB、pGEM-T-gE、pET32a-gB和pET32a-gE。

圖2 pGEM-T-gB與pGEM-T-gE重組載體的雙酶切鑒定Fig.2 Double restriction enzyme identification of recombinant plasmid pGEM-T-gB and pGEM-T-gE

圖3 重組質(zhì)粒pET32a-gB、pET32a-gE的雙酶切鑒定Fig.3 Double enzyme digestion identification of pET32agB and pET32a-gE recombinant plasmid

2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) pET-32a蛋白分子量約為18 kDa，gB蛋白分子量約為26 kDa，gE蛋白分子量約為23 kDa，故原核表達(dá)融合蛋白pET32a-gB的總分子量約為44 kDa，pET32a-gE的總分子量約為41 kDa。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，pET32a-gB在約44 kDa處出現(xiàn)蛋白條帶，pET32a-gE大約在41 kDa處出現(xiàn)蛋白條帶，pET32a空質(zhì)粒誘導(dǎo)和pET32a-gB、pET32a-gE重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)未出現(xiàn)相似條帶，證明重組蛋白成功表達(dá)（圖4）。

圖4 gB與gE蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of gB and gE proteins

2.4 重組蛋白的純化與Western blot鑒定 在pH7.4條件下對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫，結(jié)果顯示咪唑濃度為1 mol/L的洗脫緩沖液洗脫效果最好，pET32a-gB在44 kDa處、pET32a-gE在41 kDa處出現(xiàn)較為單一的條帶而且濃度相對(duì)較高（圖5）。用PRV陽(yáng)性血清對(duì)目的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示gB和gE重組蛋白均能與PRV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)（圖6），在44 kDa和41 kDa處有特異性條帶，表明gB和gE重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)，并具有良好的反應(yīng)原性。

圖5 gB與gE蛋白純化效果Fig.5 The result of purification with gB and gE protein

圖6 gB與gE蛋白的Western blot鑒定Fig.6 Western blot identification of gB and gE proteins

2.6 間接ELISA方法的建立

2.6.1 矩陣法確定抗原最佳包被量和血清最佳稀釋度 將PRV gB和gE蛋白分別進(jìn)行5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 25、0.078 125、0.039 062 5 μg/mL 8個(gè)梯度稀釋，血清按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋度稀釋，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，測(cè)定OD450值，選取陽(yáng)性與陰性血清P/N值較高的孔，同時(shí)要求陽(yáng)性血清OD450值在1.000左右。最終確定蛋白gB包被量為0.156 25 μg/mL、gE包被量為0.625 μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶100（表1、2）。

表1 gB蛋白P/N值Table 1 The P/N values of protein gB

表2 gE蛋白P/N值Table 2 The P/N values of protein gE

2.6.2 血清陰陽(yáng)性臨界值的確定 根據(jù)24份豬陰性血清的檢測(cè)結(jié)果（表3、表4），按照公式±3SD（±2SD）計(jì)算陰陽(yáng)性臨界值及確定判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，±3SD為樣品上限臨界值，±2SD為下限臨界值，界于兩數(shù)值之間的則認(rèn)為是可疑。由以上判定條件可知，gB蛋白構(gòu)建的間接ELISA檢測(cè)方法陰陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)為待檢血清OD450值≥0.28時(shí)判斷為陽(yáng)性，待檢血清OD450值≤0.22時(shí)判斷為陰性，待檢血清OD450值界于0.28～0.22時(shí)則認(rèn)為可疑。gE蛋白構(gòu)建的間接ELISA檢測(cè)方法陰陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)為待檢血清OD450值≥0.27時(shí)判斷為陽(yáng)性，待檢血清OD450值≤0.22時(shí)判斷為陰性，待檢血清OD450值界于0.27～0.22時(shí)則認(rèn)為可疑。

表3 gB蛋白陰陽(yáng)性臨界值的確定Table 3 Determination of the cut-off value with protein gB

表4 gE蛋白陰陽(yáng)性臨界值的確定Table 4 Determination of the cut-off value with protein gE

2.6.3 特異性試驗(yàn) 利用重組表達(dá)蛋白gB和gE作為包被抗原的ELISA方法檢測(cè)CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、FMDV、PEDV的陽(yáng)性血清與陰性血清OD450平均值均小于0.1946，為陰性；而PRV陽(yáng)性血清OD450平均值均大于0.3363，為陽(yáng)性；應(yīng)用本研究建立的ELISA方法與美國(guó)IDEXX公司的同類產(chǎn)品對(duì)上述血清樣品進(jìn)行平行檢測(cè)。結(jié)果顯示，除PRV陽(yáng)性血清結(jié)果為陽(yáng)性外，其他結(jié)果均為陰性（圖7），兩者檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)果表明所建立的gB和gE抗體間接ELISA方法無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。

圖7 本研究建立的ELISA方法與IDEXX試劑盒特異性比對(duì)分析Fig.7 Specific comparison analysis of ELISA method established in this study and IDEXX kit

2.6.4 敏感性試驗(yàn) 用建立的ELISA方法對(duì)倍比稀釋的PRV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋1600倍時(shí)，OD450值仍在臨界值以上，說(shuō)明所建立的gB和gE抗體間接ELISA方法具有較好的靈敏度。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批次包被的酶標(biāo)板5次重復(fù)檢測(cè)10份血清，批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%；用5個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板檢測(cè)10份血清，批間變異系數(shù)均小于10%。說(shuō)明所建立的gB和gE抗體間接ELISA檢測(cè)方法具有良好的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

3 討論

國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年）中將偽狂犬病的凈化作為一項(xiàng)重要項(xiàng)目。因此，加強(qiáng)疫苗免疫預(yù)防，定期進(jìn)行PRV（gE/gB）抗體的檢測(cè)，制定適合本場(chǎng)豬群的免疫程序和控制凈化方案仍是防控偽狂犬病的最根本措施[10]。我國(guó)用于預(yù)防偽狂犬病的疫苗主要是gE基因缺失的疫苗，配套使用gE缺失疫苗的豬場(chǎng)，使用PRV gE基因抗體檢測(cè)試劑盒能夠方便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)PRV野毒抗體，從而評(píng)價(jià)豬群PRV野毒感染狀況[11]；PRV gB抗體ELISA檢測(cè)可了解豬場(chǎng)接種偽狂犬疫苗后的免疫保護(hù)情況，若gB-ELISA抗體檢測(cè)為陰性，則說(shuō)明豬群不受免疫保護(hù)[12]。

PRV gB蛋白分別在59～126、214～289、507～734氨基酸處存在優(yōu)勢(shì)抗原表位，本研究主要表達(dá)了gB蛋白507-734位氨基酸；表達(dá)了gE蛋白N端403個(gè)氨基酸的胞外區(qū)，中間47個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)以及C端123個(gè)氨基酸胞內(nèi)區(qū)。成功構(gòu)建了PRV gB和gE蛋白主要抗原區(qū)的原核表達(dá)載體pET32a-gB和pET32a-gE，在37℃、IPTG 0.5 mol/L，誘導(dǎo)5 h的條件下進(jìn)行蛋白表達(dá)。成功表達(dá)并純化了豬偽狂犬gB、gE主要抗原區(qū)蛋白，并以此作為包被抗原，通過(guò)優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立了PRV gB和gE抗體間接ELISA檢測(cè)方法。該方法特異性與重復(fù)性良好，適用于開展PRV血清學(xué)檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查，為間接ELISA診斷試劑盒的研發(fā)奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。