豬圓環(huán)病毒3型PCR檢測方法的建立與Cap基因序列分析

朱小甫，吳旭錦，熊忙利，張文娟，尹寶英，邢 蕾

（咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，咸陽市動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，咸陽 712000）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,PCV）分為3型，豬圓環(huán)病毒1型（Porcine circovirus type 1,PCV1）是細(xì)胞培養(yǎng)的污染物，無致病性[1]。豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎炎綜合征、懷孕母豬繁殖障礙和新生仔豬先天性震顫，致病性強(qiáng)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害較大[2-3]。2016年，豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）被首次發(fā)現(xiàn)，其來源于患病母豬及流產(chǎn)胎兒，基因測序證實(shí)PCV3基因組長2000 bp，基因組結(jié)構(gòu)和遺傳相似性與圓環(huán)病毒科病毒相近[4]。

為了解我國豬場中PCV3的流行情況，賀會(huì)利等[5]檢測了廣西某豬場腹瀉死亡仔豬的病料，證實(shí)存在PCV3陽性樣品，測定Cap基因序列并進(jìn)行比較分析后，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)PCV3毒株和美國毒株的同源性很高。劉曉東等[6]對(duì)10個(gè)省區(qū)豬場進(jìn)行PCV3 PCR檢測，結(jié)果表明在山東省、安徽省、江西省、河南省、福建省與廣西省等省區(qū)均存在陽性豬場。徐國等[7]對(duì)貴州92個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場2016～2017年所送檢的308份樣品采用進(jìn)行PCV3篩查，發(fā)現(xiàn)了15份PCV3陽性病料，其中有13份存在與其他病原共同感染現(xiàn)象。湛洋等[8]對(duì)江蘇、湖南與湖北疑似豬皮炎腎病綜合征的病豬組織樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)存在PCV3感染情況，且PCV2和PCV3混合感染比較突出。咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室對(duì)陜西96個(gè)豬場進(jìn)行PCV3檢測，檢出陽性樣品8份，其中7份樣品與其他6種常見豬群病毒存在不同程度的混合感染[9]。這些研究表明，在我國豬場中不但存在PCV3感染，而且感染地域分布很廣。由于PCV3至今未分離成功，以上研究在進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查時(shí)設(shè)計(jì)的引物未進(jìn)行嚴(yán)格的靈敏度測定和特異性驗(yàn)證，在盲檢獲得的陽性樣品的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)PCV3 PCR檢測方法，為臨床提供靈敏度高、特異性好的診斷試劑具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 病料與血清 PCV3陽性病料[9]，待檢組織病料175份，豬血清110份，樣品來源于陜西省咸陽、西安、寶雞、渭南、商洛、漢中和延安共7個(gè)地市，均由咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室收集保存。

1.2 參考病毒 豬繁殖與呼吸綜合征經(jīng)典毒株CH-1R、豬繁殖與呼吸綜合征變異毒株HuN4-F112、豬瘟病毒疫苗C株、偽狂犬Bartha-K毒株均為市售疫苗毒株，豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2,PCV-2）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.3 試劑與設(shè)備 RNAiso plus、rTaq酶、dNTP等購自寶生物工程（大連）有限公司；pGEM-T easy載體克隆試劑盒購自Promega公司；Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）有限公司產(chǎn)品；DH5α大腸桿菌本實(shí)驗(yàn)室保存。PCR儀購自美國ABI ProFlex；高速冷凍離心機(jī)購自德國艾本德5424R；超微量紫外-可見光分光光度計(jì)購自賽默飛世爾科技。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中公開的PCV3全基因序列MF405272、KY075987、KY075988設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，PCV3-F/PCV3-R引物用于構(gòu)建陽性質(zhì)粒，PCV3-JF/PCV3-JR引物設(shè)計(jì)在PCV3 Cap基因區(qū)域，用于PCV3核酸檢測，引物信息見表1。

表1 本研究使用引物Table1 Primers used in this study

1.5 組織病料中DNA的提取 用Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒提取PCV3陽性病料處理液DNA。吸取處理好的組織病料上清液或血清200 μL置于1.5 mL無菌無酶離心管，加600 μL裂解液，振蕩混勻后靜置10 min，室溫12 000 ×g離心1 min，將500 μL溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，室溫靜置2 min，12 000 ×g離心1 min，棄去穿透液，將吸附柱放回收集管，剩余上清液全部轉(zhuǎn)入吸附柱，室溫靜置2 min，12 000 ×g離心1min，棄去穿透液，將吸附柱放回收集管，加入700 μL洗柱液，12 000 ×g離心1 min，棄去穿透液，將吸附柱放回收集管，12 000 ×g再次空離心1 min，棄去離心管，將吸附柱套入新的1.5 mL無菌無酶離心管，加入40 μL DNA洗脫液于濾膜上，室溫靜置2 min后12 000 ×g離心1 min，管底溶液即為DNA溶液。

1.6 PCV3基因克隆 PCR反應(yīng)體系為：DNA溶液2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，PCV3-F/PCV3-R引物各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 17.0 μL。PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，54℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共循環(huán)35次； 72℃再延伸5 min。

1.7 PCV3陽性質(zhì)粒的構(gòu)建 膠回收并純化VP1基因DNA片段。將回收的DNA片段與pGEM-T Easy載體連接，4℃水浴過夜，轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐陽性LB培養(yǎng)基篩選，挑取單個(gè)菌落，37℃條件下200 rpm搖床培養(yǎng)，PCR鑒定陽性的菌液用堿裂解法提取質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

1.8 PCV3檢測方法的建立 利用微量紫外-可見光分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度，以陽性質(zhì)粒做為模板，改變擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件，確定最佳PCR方案。PCR反應(yīng)體系：質(zhì)粒1.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，PCV3-JF/PCV3-JR引物各0.5 μL，梯度增加rTaq DNA聚合酶用量（0.25～1.0 μL），用ddH2O補(bǔ)足25.0 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度由52℃～58℃按1℃遞增，時(shí)間30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min，反應(yīng)完成后瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.9 PCV3檢測方法靈敏性試驗(yàn) 按10倍梯度稀釋質(zhì)粒溶液，用建立的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)完畢后進(jìn)行電泳觀察。

1.10 PCV3檢測方法特異性試驗(yàn) 用RNAiso Plus試劑提取HuN4-F112、C株、PEDV核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；提取偽狂犬病病毒Bartha-K毒株、PPV、PCV-2等病毒DNA模板，驗(yàn)證本研究建立的檢測方法的特異性。

1.11 PCV3檢測方法臨床應(yīng)用 用建立的檢測方法對(duì)收集的175份組織病料、110份豬血清進(jìn)行檢測，陽性樣品PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV3基因擴(kuò)增結(jié)果 通過PCR方法，從PCV3陽性病料中成功擴(kuò)增出了預(yù)期1127 bp的目的條帶，見圖1。

圖1 病料中PCV3基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of clone PCV3 gene from tissue

2.2 PCV3基因重組陽性質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果 回收PCR產(chǎn)物連接pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，菌液PCR鑒定結(jié)果為陽性后提取質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切鑒定為陽性（圖2），測序比對(duì)發(fā)現(xiàn)與參考序列MF405272同源性為100%，提示PCV3基因重組陽性質(zhì)粒構(gòu)建成功，將構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒命名為pGEM-T-PCV3。

圖2 重組陽性質(zhì)粒酶切結(jié)果Fig.2 Enzyme digest result of recombinant plasmids of PCV3 gene

2.3 PCV3 PCR檢測方法的建立 以pGEM-T-PCV3質(zhì)粒為模板，通過擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件的探索，確定最佳PCR方案。PCR反應(yīng)體系為：質(zhì)粒1.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，PCV3-JF、PCV3-JR各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 18.0 μL；最優(yōu)反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s、72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。

2.4 BFDV PCR檢測方法靈敏性試驗(yàn) 用微量紫外-可見光分光光度計(jì)測定pGEM-T-PCV3質(zhì)粒濃度為362 ng/μL，A260/A280為2.02，提示質(zhì)粒純凈度高。用質(zhì)粒拷貝數(shù)計(jì)算公式換算并梯度稀釋質(zhì)粒，以5.0×106～5.0×10-2copies/μL共8個(gè)濃度的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果見圖3。建立的PCR方法檢測的極限為50 copies/μL，說明建立的方法有較高的靈敏度。

圖3 PCR檢測方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The result of sensitivity test for PCV3 by PCR

2.5 PCV3 PCR檢測方法特異性試驗(yàn) 以HuN4-F112、C株、PEDV反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA，以及偽狂犬病病毒Bartha-K毒株、PPV、PCV-2病毒DNA作為模板，用pGEM-T-PCV3作為參照，用建立的PCR方法擴(kuò)增。結(jié)果僅有pGEM-T-PCV3擴(kuò)增出了419 bp的目的條帶，說明所建立的方法特異性良好（圖4）。

圖4 方法特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Specialization test result for PCV3

2.6 PCV3 PCR檢測方法臨床檢測與Cap基因序列分析 用建立的PCV3 PCR檢測方法對(duì)175份組織病料、110份豬血清進(jìn)行檢測，結(jié)果檢測出陽性樣品39份，陽性率為13.7%（圖5），在陜西省咸陽、西安、寶雞、渭南、商洛、漢中和延安共7個(gè)地市樣品中均有陽性分布。

圖5 部分臨床樣品檢測結(jié)果Fig.5 Partial clinical sample test results

對(duì)其中8份不同地區(qū)Cap基因PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得的序列根據(jù)地區(qū)和時(shí)間分別命名為SXXY1601、SXXY1710、SXYA1805、SXBJ1905、SXHZ1711、SXSL1702、SXWN1806和SXXA1812。用DNAStar軟件，將獲得的8株P(guān)CV3流行毒株Cap基因與12株GenBank中公開的參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建基因進(jìn)化樹，比對(duì)核苷酸同源性（表2）。

表2 PCV3流行毒株Cap基因序列與參考毒株核苷酸同源性Table 2 Cap gene of PCV3 assay sequence and reference strain nucleotide homology

由表2數(shù)據(jù)可知，20株核苷酸序列同源性比對(duì)為87.1%～100%，SXSL1702與SXXA1812同源性最低，為87.1%，CN Fujian-12 2016 KY075987與CN Henan-13 2016 KY075988、CN GDBL1 2017 MF405272與CN GXHJ1 2017 MF405273同源性為100%。

基因進(jìn)化樹顯示，20個(gè)PCV3流行毒株分為2個(gè)群，SXSL1702單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)分支，其他7個(gè)測定毒株與國內(nèi)外參考毒株交叉分布于另一個(gè)大的分支，提示SXSL1702株Cap基因與其他毒株有較大差異（圖6）。

圖6 PCV3 Cap基因進(jìn)化樹Fig.6 Cap gene of PCV3 evolution tree

3 討論

豬圓環(huán)病毒3型是近年發(fā)現(xiàn)的新病毒，有報(bào)道認(rèn)為PCV3可能與母豬繁殖障礙有關(guān)，但由于仍未成功分離病毒，無法證實(shí)PCV3的致病性。為了解我國豬群中PCV3感染情況，多位學(xué)者開發(fā)了不同的PCV3檢測技術(shù)。姜辰龍等[10]根據(jù)PCV3 ORF2基因保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物，建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測方法，該方法最低檢測限為1 copies/μL，并與常見的5種豬群傳染病病毒無交叉反應(yīng)。但由于LAMP技術(shù)靈敏度很高，難以避免產(chǎn)生假陽性反應(yīng)，對(duì)環(huán)境和操作要求極高。李暢等[11]建立了快速檢測PCV3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，靈敏度可達(dá)為129 copies/μL，特異性、可重復(fù)性良好，用該方法對(duì)2016～2017年湖北省等地124份豬病料進(jìn)行檢測，結(jié)果PCV3陽性率為8.06%。石磊等[12]建立了一種PCV3微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）檢測方法，該方法靈敏度可達(dá)4.4 copies/μL，特異性良好，與常見豬病原無交又反應(yīng)。但ddPCR方法對(duì)設(shè)備要求很高，普通實(shí)驗(yàn)室不具備檢測條件。本試驗(yàn)在前期的盲檢與序列分析基礎(chǔ)上[9]，選取PCV3陽性病料，通過構(gòu)建陽性質(zhì)粒、PCR檢測條件優(yōu)化、特異性試驗(yàn)和臨床檢測試驗(yàn)，建立了PCV3 PCR檢測方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的PCR方法靈敏度極限為50 copies/μL，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、流行性腹瀉病毒、偽狂犬病病毒、細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型檢測均為陰性，提示該方法靈敏度高、特異性好，可作為PCV3核酸檢測方法。該方法比姜辰龍等建立的LAMP方法和石磊等建立的ddPCR方法靈敏度稍低，但比李暢等建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法稍高，由于常規(guī)PCR設(shè)備要求低，普通分子實(shí)驗(yàn)室均具備條件，所以該方法具有更好的適用性。本研究建立了一種靈敏度高、特異性好的檢測PCV3感染的PCR方法，為PCV3感染流行病學(xué)調(diào)查奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

應(yīng)用建立的方法對(duì)陜西省7個(gè)地市285份樣品進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在這7個(gè)地市豬群中均有PCV3陽性結(jié)果，表明PCV3感染地域分布較為普遍。測定并分析了8份不同地區(qū)PCV3流行毒株Cap基因片段序列，發(fā)現(xiàn)其中7株與參考毒株序列同源性為97.4%～100%，僅有SXSL1702與SXXA1812同源性為87.1%，提示大多數(shù)測定流行毒株與其他國家和地區(qū)PCV3 Cap基因高度同源，僅SXSL1702與參考毒株同源性較低，Cap基因核苷酸位點(diǎn)變異較多，在進(jìn)化樹中形成一個(gè)單獨(dú)的分支。由于本研究僅測定了Cap部分基因片段，后續(xù)研究尚需對(duì)該毒株進(jìn)行全基因測序分析，以期精確反映SXSL1702毒株的進(jìn)化情況。