豬瘟病毒Erns和E2蛋白重組表達及抗體間接ELISA檢測方法的建立

張洪亮，郝占武，林喜平，張 志，王鳳雪，解倩倩，韓先杰，單 虎，溫永俊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，呼和浩特 010018；2.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 山東省新獸藥創(chuàng)制協(xié)同創(chuàng)新中心 青島市獸醫(yī)生物技術(shù)工程研究中心，青島 266109；3.興安盟五岔溝國有林管理局，阿爾山 137803；4.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，青島 266032）

豬瘟（classical swine fever，CSF），是由黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）的豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的一種高度接觸性、致死性傳染病，以急性出血和發(fā)熱為主要特征[1-2]。該病對不同年齡、性別、品種的家豬和野豬均易感，一年四季均可發(fā)生。世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）將其定為A類傳染病，我國《動物防疫法》中將其列為一類動物傳染病，是目前危害我國和世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。隨著豬瘟兔化弱毒疫苗的使用，目前我國豬瘟疫情已基本得到控制，現(xiàn)多表現(xiàn)為無規(guī)律的地區(qū)性散發(fā)，存在分子變異和抗原改變的中等毒力CSFV毒株[3]。為貫徹落實《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年）》，有效控制和逐步消滅豬瘟，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部出臺了《國家豬瘟防治指導意見（2017-2020年）》，對豬瘟的凈化提出了明確要求。隨著豬瘟E2亞單位疫苗和豬瘟標記疫苗（如嵌合疫苗CP7_E2 alf等）的研制與推廣，使用豬瘟Erns和E2蛋白抗體ELISA檢測試劑盒以區(qū)分野毒感染與疫苗免疫產(chǎn)生的抗體，為規(guī)?；i場凈化豬瘟帶來了可能[4-5]。

CSFV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，長約為12.3 kb，整個基因組由5′端非編碼區(qū)（5′-noncoding region,5′-UTR）、3′端非編碼區(qū)（3′-untranslated region,3′-UTR）與兩者之間一個大開放閱讀框（open reading frame,ORF）三部分構(gòu)成，基因組5′端無甲基化帽子，3′結(jié)尾無Poly（A）尾巴[6]。病毒RNA首先編碼合成含有3898個氨基酸的多聚蛋白，通過病毒和細胞蛋白酶對前體蛋白進行共翻譯和翻譯后加工，得到13種成熟蛋白，包括4個具有抗原性的結(jié)構(gòu)蛋白，即核心蛋白（corn protein,C）和囊膜糖蛋白E1、E2和Erns，以及9個非結(jié)構(gòu)蛋白Npro、p7、NS2-3、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，其中NS2-3蛋白通過NS2自催化半胱氨酸蛋白酶部分加工成NS2和NS3[7]。本研究利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)制備rErns和rE2重組蛋白作為包被抗原，分別建立CSFV Erns和E2抗體間接ELISA檢測方法，以期為豬瘟的凈化工作提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株、質(zhì)粒及試劑 豬瘟活疫苗（傳代細胞源）購自廣東永順生物制藥股份有限公司；DH5α、BL21（DE3）、XhoⅠ和EcoRⅠ、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR試劑盒、DNA膠回收試劑盒、IPTG、DNA marker和蛋白marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；TRIzol?LS Reagent購自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白純化試劑盒購自Novagen公司；HRP標記兔抗豬IgG二抗購自US Biological公司；ELISA板購自Costar公司；pET-32a和pET-32aEK表達載體、CSFV陽性和陰性血清，以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus 2，PCV-2）、豬細小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、口蹄疫病毒（Foot-and -Mouth disease virus，F(xiàn)MDV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）陽性血清均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心提供；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 引物設計與合成 參照NCBI中已公布的CSFV HCLV株全基因組序列（GenBank登錄號：AF531433），分別設計擴增Erns和E2基因主要抗原區(qū)的特異性引物，在上、下游引物的5′端分別加入酶切位點（下劃線部分），并加入保護性堿基。所設計的引物序列為：Erns-F：5′-GCCGAATTCACCAT GTTGGCATGGGCGGTGATAG-3′；Erns-R：5′-GC CCTCGAGCTGGGGTGCAGTTGTTAGTGTA-3′；E2-F：5′-GCGAATTCACCATGAGTAACTGGGGC ACAAGGC-3′；E2-R：5′-GAACTCGAGGAAGTC GAAGCCACACC-3′。預計擴增目的基因大小Erns為795 bp、E2為651 bp。引物由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 RNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增 按照TRIzol?LS Reagent說明書提取CSFV HCLV株總RNA。分別用引物Erns-R/F和E2-R/F進行PCR擴增。反應體系（25 μL）為：Primescript 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL，2×1 Step Buffer 12.5 μL，Erns-F/E2-F各1.0 μL，Erns-R/E2-R各1.0 μL，ddH2O 6.5 μL，RNA 3.0 μL。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性10 s，62℃退火30 s，72℃延伸42 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析。

1.4 Erns和E2基因的克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建 DNA膠回收試劑盒純化Erns和E2基因片段，分別與pGEM-T載體連接，連接后克隆載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，按照質(zhì)粒DNA提取試劑盒說明書小量提取重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒進行雙酶切和PCR鑒定，結(jié)果正確的重組克隆質(zhì)粒命名為pGEM-T-Erns、pGEMT-E2。將重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-Erns、pGEMT-E2分別與原核表達載體pET-32a、pET-32a EK用EcoRⅠ、XhoⅠ進行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)鑒定正確后進行純化并用T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，Erns與pET-32a連接后轉(zhuǎn)化BL21（DE3）表達菌株，E2與pET-32aEK連接后轉(zhuǎn)化BL21（DE3）Plys表達菌株。經(jīng)菌液PCR、雙酶切及測序鑒定正確后獲得重組表達載體pET32a-Erns、pET32aEK-E2。

1.5 Erns和E2重組蛋白誘導表達 分別取pET32a-Erns、pET32aEK-E2重組質(zhì)粒菌液20 μL加入2 mL含有氨芐的LB培養(yǎng)基后，37℃條件下180 ×g培養(yǎng)12 h。取出培養(yǎng)后的菌液400 μL加入20 mL的LB液體培養(yǎng)基，在菌液OD600在0.4～0.5范圍內(nèi)時加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG進行誘導，同時設空質(zhì)粒誘導和重組質(zhì)粒未誘導兩個對照組。收集菌液，7000 ×g離心5 min，棄上清液，用15 mL的PBS（pH7.4）重懸沉淀，7000 ×g離心5min，棄上清液，加入1 mL PBS重懸沉淀，冰上超聲破碎，收集上清液和沉淀進行SDS-PAGE蛋白電泳鑒定分析。

1.6 重組蛋白純化與Western blot鑒定 將上述處理好的蛋白樣品進行Ni-NTA His層析柱純化，按照His Bind purification Kit說明書來操作。純化后的重組蛋白利用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃過夜后加入CSFV陽性血清（1∶100稀釋），37℃作用1 h，加入HRP標記兔抗豬IgG抗體（1∶4000稀釋），37℃作用1 h，ECL顯色。

1.7 間接ELISA方法的建立

1.7.1 抗原最佳包被量和血清最佳稀釋度的確定 將Erns、E2重組蛋白用pH9.6碳酸鹽緩沖液從每孔5.0 μg/mL倍比稀釋到0.039 μg/mL，加入96孔板，每孔100 μL，4℃包被12 h；用包被液振蕩洗滌1次，每次2 min；加0.25%的PVA溶液，每孔300 μL，37℃封閉2 h；PBS振蕩洗滌2次，每次2 min；加5%脫脂奶粉，每孔300 μL，37℃封閉30 min，用洗滌液洗滌3次，每次2 min；陽性與陰性血清用PBS按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋，每孔100 μL，37℃反應45 min；洗滌液振蕩洗滌3次，每次2 min；加入PBS稀釋HRP標記兔抗豬IgG，每孔100 μL，37℃孵育30 min；洗滌液振蕩洗滌3次，每次2 min；避光加入100 μL TMB底物顯色液，室溫避光顯色15 min；加入50 μL終止液，酶標儀測定OD450值。

1.7.2 最佳封閉液的確定 包被后用包被液（pH9.6碳酸鹽緩沖液）震蕩洗滌1次，每次2 min；選用0.25%PVA溶液、5%脫脂奶粉、2%明膠、1%BSA、0.25%PVA溶液+5%脫脂奶粉（先用0.25%PVA溶液37℃封閉2 h后，用5%脫脂奶粉37℃封閉30 min）、2%海藻糖，每孔300 μL，37℃封閉2 h。其他條件同1.7.1中最佳條件。

1.7.3 酶標抗體工作濃度的確定 將HRP標記兔抗豬IgG抗體分別按照1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000稀釋，其余按上述間接ELISA反應測定，篩選出最佳酶標抗體工作濃度。

1.7.4 反應臨界值的確定 按上述最佳反應條件檢測32份CSFV陰性血清，在酶標儀上測定血清的OD450，計算數(shù)據(jù)平均值（ˉx）和標準方差（SD），明確陰、陽性判定條件。

1.7.5 特異性試驗 按照上述最佳反應條件，對PRRSV、PRV、PCV-2、PPV、FMDV、PEDV陽性血清進行檢測，同時設陰、陽性血清對照，作3個重復，根據(jù)檢測結(jié)果評價所建Erns和E2抗體間接ELISA檢測方法的特異性。

1.7.6 敏感性試驗 按上述最佳反應條件，將CSFV陽性血清按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12 800稀釋，檢測不同稀釋倍數(shù)的陽性血清，根據(jù)檢測最高血清稀釋度評價所建Erns和E2抗體間接ELISA檢測方法的敏感性。

1.7.7 重復性試驗 按上述最佳反應條件，用同一批次包被的酶標板檢測10份血清，每份血清進行5次重復檢測，以評價Erns和E2抗體間接ELISA檢測方法的批內(nèi)重復性；用5個不同批次包被的酶標板檢測10份血清，計算平均值（ˉx）和標準方差（SD），根據(jù)變異系數(shù)來評價所建Erns和E2抗體間接ELISA檢測方法的批內(nèi)和批間重復性。

近年來民居的植物文化越來越受到人們的關(guān)注，尤其是關(guān)于民居的植物文化的期刊發(fā)表量呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。我國民居植物文化在這23年間，經(jīng)歷了從無到有的發(fā)展歷程，眾多作者文章對我國漢族、傣族、藏族、維吾爾族、侗族、白族、客家族等地的傳統(tǒng)民居，黃土高原地區(qū)、北京地區(qū)、吐魯番地區(qū)、豫西地區(qū)、嶺南地區(qū)等傳統(tǒng)民居聚落，居住區(qū)、濱水公園、道路景觀等民居園林景觀，佛寺、傳統(tǒng)民居、鄉(xiāng)村民居里面的木雕、石雕、磚雕以及壁畫等居住的植物文化研究進展進行了闡述。通過內(nèi)容分析法，統(tǒng)計分析文獻年度數(shù)量分布，概括為以下幾個特征：

1.8 臨床樣品檢測 利用1.7建立的間接ELISA方法，檢測實驗室采集的86份臨床豬血清樣品中的Erns和E2抗體，驗證其區(qū)分疫苗免疫與野毒感染的有效性。臨床樣品背景資料顯示，其中26份為免疫豬瘟E2亞單位疫苗血清，45份為免疫豬瘟兔化弱毒疫苗血清，15份為豬瘟發(fā)病豬血清。

2 結(jié)果

2.1 CSFV Erns和E2基因的擴增 以CSFV疫苗為模板，PCR擴增豬瘟病毒Erns和E2蛋白主要抗原區(qū)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，目的片段大小分別為795 bp和651 bp（圖1），與預期結(jié)果一致。

圖1 豬瘟病毒Erns和E2基因主要抗原區(qū)的PCR擴增Fig.1 PCR result of Erns and E2 antigenic genes from CSFV

2.2 Erns和E2基因的克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建 分別將Erns和E2基因連接至pGEM-T克隆載體并分別亞克隆pET-32a和pET-32aEK表達載體，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后，分別獲得795 bp的Erns目的基因片段和651 bp的E2目的基因片段（圖2、圖3），結(jié)合PCR鑒定和重組質(zhì)粒測序結(jié)果，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-T-Erns、pGEM-T-E2、pET32a-Erns和pET32aEK-E2。

圖2 重組質(zhì)粒pGEM-T-Erns與pGEM-T-E2的雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion identification of pGEM-T-Erns and pGEM-T-E2 recombinant plasmid

圖3 重組質(zhì)粒pET32a-Erns、pET32aEK-E2的雙酶切鑒定Fig.3 Double enzyme digestion identification of pET32a-Erns and pET32aEK-E2 recombinant plasmid

2.3 Erns和E2重組蛋白誘導表達 SDS-PAGE蛋白電泳鑒定結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET32a-Erns、pET32aEK-E2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）和BL21（DE3）PlysS感受態(tài)細胞后，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導5 h，可以檢測到約為47 kDa的rErns重組蛋白和42 kDa的rE2重組蛋白（圖4），與目的蛋白預期大小相符。

圖4 rErns和rE2重組蛋白的誘導表達Fig.4 Induced expression of rErns and rE2 recombinant proteins

2.4 重組蛋白純化與Western blot鑒定 在pH7.4條件下對重組蛋白進行純化，經(jīng)SDS-PAGE分析，rErns和rE2重組蛋白分別在47 kDa和42 kDa處出現(xiàn)較為單一的蛋白質(zhì)條帶（圖5），SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，純化后的蛋白能與CSFV陽性血清反應（圖5），說明重組蛋白rErns和rE2在大腸桿菌中正確表達并具有良好的免疫原性。

圖5 純化后的rErns和rE2重組蛋白SDS-PAGE和Western blot鑒定Fig.5 SDS-PAGE and Western blot of purified rErns and rE2 recombinant proteins

2.5 間接ELISA方法的建立

2.5.1 抗原最佳包被量和血清最佳稀釋度的確定 將豬瘟病毒rErns、rE2蛋白進行5、2.5、1.25、0.625、0.3 125、0.15 625 μg/mL梯度稀釋，血清按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋，方陣滴定結(jié)果見表1、表2所示。陽性血清OD450與陰性血清OD450的P/N值（陽性血清OD450值/陰性血清OD450值）見表3、表4所示。選取陽性與陰性血清P/N值最高的孔，同時要求陽性血清OD450值在1.0左右，因此確定Erns蛋白最佳包被量為2.5 μg/mL、rE2蛋白最佳包被量為0.625 μg/mL，血清最佳稀釋度均為1∶100。

表1 方陣法確定rErns蛋白包被量與血清稀釋度Table 1 Determination of rErns protein coating and serum dilution by square matrix method

表2 方陣法確定rE2蛋白包被量與血清稀釋度Table 2 Determination of rE2 protein coating and serum dilution by square matrix method

表3 rErns蛋白P/N值Table 3 The P/N values of rErns protein

表4 rE2蛋白P/N值Table 4 The P/N values of rE2 protein

2.5.2 最佳封閉液的確定 以0.25%的PVA溶液+5%脫脂奶粉做封閉液時，rErns和rE2 P/N比值最大，分別為14.80和8.82，因此，確定0.25%的PVA溶液+5%脫脂奶粉為最佳封閉液。

2.5.3 酶標抗體工作濃度的確定 當酶標抗體分別按照1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000稀釋時，前3個梯度P/N值無明顯差異，當稀釋到1∶8000時，P/N值下降較多，因此，酶標抗體最佳工作濃度為1∶4000。

2.5.4 反應臨界值的確定 通過對32份豬瘟陰性血清進行ELISA檢測，按照公式ˉx±3SD（±2SD）計算陰陽性臨界值及確定判斷標準，ˉx±3SD為樣品上限臨界值，ˉx±2SD為下限臨界值，界于兩數(shù)值之間的則認為是可疑。由以上判定條件可知Erns蛋白構(gòu)建的間接ELISA檢測方法陰陽性的判定標準為待檢血清OD450值≥0.24時判斷為陽性，待檢血清OD450值≤0.2時判斷為陰性，待檢血清OD450值界于0.24～0.2時則認為可疑。E2蛋白構(gòu)建的間接ELISA檢測方法陰陽性的判定標準為待檢血清OD450值≥0.33時判斷為陽性，待檢血清OD450值≤0.27時判斷為陰性，待檢血清OD450值界于0.33～0.27時則認為可疑。

2.5.5 特異性試驗 檢測PRRSV、PRV、PCV-2、PPV、FMDV、PEDV陽性血清OD450平均值均小于0.1946，為陰性；而CSFV陽性血清OD450平均值均大于0.3363，為陽性，表明所建立的Erns和E2抗體間接ELISA方法特異性良好。

2.5.6 敏感性試驗 用建立的ELISA方法對倍比稀釋的CSFV陽性血清進行檢測，結(jié)果顯示，當陽性血清稀釋1600倍時，OD450值仍在臨界值以上，說明所建立的Erns和E2抗體間接ELISA方法具有較好的靈敏度。

2.5.7 重復性試驗 用同一批次包被的酶標板5次重復檢測10份血清，批內(nèi)變異系數(shù)均＜10%；用5個不同批次包被的酶標板檢測10份血清，批間變異系數(shù)均＜10%。說明所建立的rErns和rE2抗體間接ELISA檢測方法具有良好的批內(nèi)和批間重復性。

2.6 臨床樣品檢測 用建立的間接ELISA方法分別對86份臨床豬血清樣品進行了Erns和E2抗體檢測分析。結(jié)果顯示，26份免疫豬瘟E2亞單位疫苗血清樣品中Erns抗體陽性4份（4/26），E2抗體陽性24份（24/26），其中Erns抗體陽性全血樣品經(jīng)抗原檢測均為CSFV核酸陽性；45份免疫豬瘟兔化弱毒疫苗血清樣品中Erns抗體陽性40份（40/45），E2抗體陽性41份（41/45）；15份為豬瘟發(fā)病血清樣品中Erns抗體陽性14份（14/15），E2抗體陽性15份（15/15），其中14份全血樣品經(jīng)抗原檢測為CSFV核酸陽性。上述結(jié)果表明，本研究建立的間接ELISA方法可對臨床豬血清樣品進行Erns和E2抗體檢測，統(tǒng)計抗體陽性率，評價免疫效果，結(jié)合免疫疫苗的種類分析是否存在CSFV野毒感染。

3 討論

Erns蛋白是由二硫鍵連接而成，分子量大小為100 kDa的同源二聚體，該蛋白產(chǎn)生的中和抗體中和譜很窄，但其具有中和活性的單克隆抗體卻可有效阻斷CSFV對易感細胞的感染，Erns蛋白廣泛應用于CSFV抗原和抗體的免疫學檢測中[8]。E2蛋白是暴露于病毒體外表面的主要抗原蛋白，其在豬感染期間誘導主要的中和抗體，E2蛋白有15個半胱氨酸殘基，其主要抗原區(qū)位于N端氨基酸690～866，有A、B、C和D四個相對獨立的抗原結(jié)構(gòu)域，由于E2蛋白擁有較多的中和抗體表位[9]。因此，CSFV血清學診斷和疫苗開發(fā)研究主要以Erns和E2蛋白作為對象[10-18]。

我國對豬瘟的防控主要采取兔化弱毒疫苗或E2蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗免疫接種，結(jié)合免疫豬群抗體水平監(jiān)測。種豬帶毒，通過胎盤感染造成仔豬先天帶毒，以及后備豬潛伏帶毒形成亞臨床感染，這是目前規(guī)模化豬場豬瘟持續(xù)存在的重要原因。免疫抗體水平和野毒感染抗體的鑒別診斷對評價豬瘟疫苗免疫效果，開展豬瘟凈化具有重要的指導作用。目前應用于豬瘟抗體檢測的方法主要有間接法和阻斷法。本研究通過大腸桿菌表達系統(tǒng)將CSFV Erns和E2基因的主要抗原區(qū)進行原核表達，建立的間接ELISA方法特異性、敏感性和穩(wěn)定性良好，可用于鑒別E2亞單位疫苗免疫抗體和野毒感染抗體。制備包被抗原rErns和rE2采用的大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前重組蛋白表達最常用的系統(tǒng)，雖然存在易形成包涵體、蛋白缺少翻譯后修飾的缺陷，但其具有遺傳背景清楚、操作簡便、培養(yǎng)工藝簡單、表達量高、生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)點。因此，本研究建立的CSFV Erns和E2抗體間接ELISA檢測方法，后續(xù)可開發(fā)組裝成檢測試劑盒，進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，為豬瘟的抗體監(jiān)測和凈化提供產(chǎn)品支撐。

現(xiàn)階段，國內(nèi)大部分種豬場及大中型養(yǎng)豬場已具備凈化豬瘟的軟硬件設施，如內(nèi)外部生物安全控制措施、人員素質(zhì)和技術(shù)水平、養(yǎng)殖場管理經(jīng)驗等。因此，在完成豬瘟鑒別診斷技術(shù)和標記疫苗產(chǎn)品開發(fā)的基礎上，創(chuàng)建豬瘟凈化關(guān)鍵技術(shù)體系，盡早實施豬瘟的凈化，是我國控制和消滅豬瘟的必經(jīng)之路。