豬源化膿隱秘桿菌分離的鑒定與病原特性研究

姜 軒，徐承倩，張 欣，張 奧，趙瑞利，馬吉飛，孫英峰

（天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes）又稱化膿放線菌（Actinomyces pyogenes），屬于隱秘桿菌屬（Arcanobacterium）。該菌最早于1893年從牛的膿汁中分離到，常引起豬、牛、羊等動物的化膿性感染，表現(xiàn)為肺炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、乳腺炎、皮下膿腫等疾病[1]，也曾有化膿隱秘桿菌感染人的事件報道[2]。該菌的臨床致病性與所攜帶的毒力因子密切有關(guān)，目前已報道的化膿隱秘桿菌毒力因子有多種，如溶血素（pyolysin,Plo）、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase,NanH）、膠原結(jié)合蛋白（CbpA）等，其中同時攜帶Plo基因和NanH基因的菌株的致病性要強于攜帶其他幾種毒力因子的菌株[3-5]。本研究對2019年3月從天津地區(qū)某豬場發(fā)病豬的肺臟膿腫中分離到的1株病原菌，進行了細菌常規(guī)鑒定、16S rRNA序列及毒力基因PCR檢測與耐藥性實驗。通過對該病原菌的生物學(xué)特性、遺傳進化、毒力因子和耐藥情況，為豬化膿隱秘桿菌的流行病學(xué)調(diào)查及臨床防治提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 天津市某規(guī)模化豬場斷奶仔豬，病豬體溫達到41℃，食欲廢絕，個別豬嚴重呼吸困難。無菌條件下采集肺臟膿腫物進行細菌分離鑒定，編號為NF1913。

1.2 試劑與培養(yǎng)基 鮮血平板培養(yǎng)基購自凱林貿(mào)易有限公司；革蘭氏染色試劑盒、藥敏紙片、生化鑒定管等均購自杭州微生物有限公司；10×PCR buffer、dNTP、Taq酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 試驗動物 健康昆明系小鼠20只，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中公開發(fā)表的細菌16S rRNA基因設(shè)計通用性引物。依據(jù)參考文獻[6]合成化膿隱秘桿菌毒力基因Plo、NanH、CbpA、NanP引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，具體信息見表1。

表1 本研究使用引物序列Table 1 Primer used in this study

1.5 細菌的分離培養(yǎng)及純化 在無菌條件下將肺部濃汁劃線培養(yǎng)于鮮血瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取可疑單克隆菌落進一步純化后，將該單克隆菌株命名為TJjh1913，革蘭染色觀察分離株的形態(tài)染色特征。

1.6 細菌生化試驗 參考文獻[7-8]將純化后的菌液接種至不同細菌微量生化試驗管內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察記錄結(jié)果，參照細菌生化鑒定手冊進行判定。

1.7 藥物敏感性試驗 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical & Laboratory Standards Institute,CLSI）推薦的紙片擴散法和判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]對分離到的菌株進行藥敏試驗。取100 μL的新鮮菌液均勻涂布在鮮血平板培養(yǎng)基上，選取藥敏紙片貼在平板表面，倒置放37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈直徑判定菌株對藥物的敏感性。

1.8 細菌16S rRNA 基因與毒力基因PCR擴增與測序 按照DNA抽提試劑盒說明書進行細菌基因組DNA提取，進行16S rRNA及毒力相關(guān)基因的PCR擴增與測序。擴增體系：DNA模板5 μL，10× PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上、下游引物各 1 μL，Taq 酶 0.5 μL，用ddH2O 補至25 μL。PCR 擴增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 30 s，56℃/60℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，共35個循環(huán)，72℃再延伸10 min。以 1%瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。并按照DNA凝膠回收試劑盒的操作說明進行切膠回收，連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細胞，將陽性菌液送生工生物工程（上海）有限公司進行基因序列測定。將測序結(jié)果與NCBI中GenBank登錄的序列進行比對，運用DNAStar軟件將所得序列和參考序列進行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.9 小鼠致病性試驗 將小鼠隨機分成5組，每組5只，第1～4組為實驗組，第5組為空白對照組[6]。依次將108、107、106、105CFU/mL化膿隱秘桿菌菌液培養(yǎng)物分別腹腔注射試驗組小鼠，0.1 mL/只。對照組注射相同劑量液體培養(yǎng)基。各組接種后隔離飼養(yǎng)，每12 h觀察小鼠臨床表現(xiàn)。對各組出現(xiàn)癥狀及死亡的小鼠進行剖檢，分離細菌并鑒定及病理組織切片觀察。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果 病料接種鮮血瓊脂平板，置于37℃條件下培養(yǎng)48 h后長出肉眼可見的細小菌落，菌落呈光滑、濕潤、表面凸起、邊緣整齊、針尖狀乳白色，并呈β溶血現(xiàn)象（圖1）。將分離純化后的菌株進行革蘭氏染色。結(jié)果顯示，分離得到的菌株為革蘭氏陽性菌，外形為兩段鈍圓、形態(tài)或曲或直的短小多形態(tài)桿菌（圖1）。

圖1 NF1913在血平板上的菌落形態(tài)與革蘭染色結(jié)果Fig.1 The result of colony morphology and Gram stain of NF1913

2.2 細菌生化試驗結(jié)果 觀察并記錄不同微量生化培養(yǎng)管內(nèi)顏色的變化，參照試劑盒內(nèi)說明書的判定標(biāo)準(zhǔn)與《伯杰氏細菌鑒定手冊》，將實驗結(jié)果進行對比，其特性與化膿隱秘桿菌相似，結(jié)果初步判定為化膿隱秘桿菌（表2）。

表2 NF1913的生化試驗結(jié)果Table 2 Biochemical test result of NF1913

2.3 藥敏試驗結(jié)果 結(jié)果顯示，頭孢類藥物（頭孢噻呋、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢曲松）和部分喹諾酮類（左氧氟沙星、環(huán)丙沙星）高度敏感；對氨基糖苷類藥物（丁胺卡那、慶大霉素、新霉素）、甲硝唑、林可霉素、桿菌肽等耐藥（表3）。

表3 NF1913藥敏試驗結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results of NF1913

2.4 細菌NF1913 16SrRNA基因擴增結(jié)果 通過16S rRNA引物進行PCR擴增，測序結(jié)果顯示，本次分離得到的菌株為化膿隱秘桿菌，該菌株與中國新疆株（GenBank登錄號：JX975440）的基因同源性高達98%，與國內(nèi)外已發(fā)表的分離自水牛、山羊、豬等動物體內(nèi)的化膿隱秘桿菌的基因同源性達95%以上。從圖2建立的菌株進化樹可以看出，分離菌株NF1913與JX975440（中國新疆）關(guān)系最近；與CP029004與CP033902的關(guān)系相對較遠。說明本次分離的菌株與國內(nèi)和國外其他分離株存在地域差異。

圖2 基于16S rRNA基因核酸序列遺傳進化樹Fig.2 The phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of l6S rRNA gene

2.5 毒力基因PCR擴增結(jié)果 將NF1913的4種毒力基因進行PCR擴增，結(jié)果顯示，本分離株同時攜帶有Plo、NanH、CbpA三種毒力基因（圖3），與之前報道的同時攜帶Plo基因和NanH基因的菌株的致病性要強于攜帶其他幾種毒力因子的菌株，推測該分離株具有較強致病力。

圖3 毒力基因的PCR擴增結(jié)果Fig.3 The results of virulence genes detection

2.6 小鼠致病性試驗結(jié)果 昆明系小鼠接種NF1913菌株后12 h開始出現(xiàn)死亡，其他小鼠精神沉郁，采食活動減少等臨床癥狀；18 h后攻毒108CFU/mL試驗組小鼠全部死亡，對照組小鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象且精神食欲均正常。按照Reed-Muench法計算出菌株NF1913的LD50為2.04×105CFU。小鼠病理組織切片顯示，正常組織肺泡壁較薄且均勻，其他組織無充血、水腫等病理變化，攻毒小鼠各臟器均出現(xiàn)不同程度的水腫和炎性細胞浸潤，肺臟組織可見肺泡腔內(nèi)有少量紅細胞、肺泡壁毛細血管增厚等病理變化（圖4A～D）。采集死亡小鼠臟器進行細菌分離并進行16S rRNA基因擴增及測序，結(jié)果與從病豬體內(nèi)分離到的化膿隱秘桿菌一致。

表4 不同濃度菌株N1913的小鼠毒力試驗Table 4 Mice toxicity test of strain N1913 at different concentrations

圖4 小鼠組織石蠟切片（400×）Fig.4 Paraffin section of mouse tissue （400×）

3 討論

化膿隱秘桿菌作為隱秘桿菌屬中致病力最強的病原體，是常存在于家畜（豬、牛、羊）體內(nèi)的條件致病菌，可引起動物發(fā)生肺炎、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎及腎臟膿腫等疾病，嚴重時可因敗血癥引起家畜死亡[9]。該菌能感染的動物種類廣泛，多引起反芻動物（牛、羊）等動物的發(fā)病，但近年來該菌感染豬的病例時有發(fā)生，魯興華等[10-12]分別在上海市、廣東省、四川省等地分離到豬源化膿隱秘桿菌。本試驗從天津一規(guī)?；i場病死豬體內(nèi)分離出隱秘化膿桿菌，表明該細菌病的發(fā)病范圍在不斷擴大，特別是在規(guī)?；i場不斷擴大的情況下，更應(yīng)該提高對該病的防范意識和采取有效的治療措施。

本試驗將分離到的菌株進行遺傳進化樹分析，結(jié)果表明該菌株與JX975440（中國新疆）、KP159746（中國河北）親緣關(guān)系最近；與國外其他分離株的親緣關(guān)系稍遠，說明該菌的流傳存在地域差異?；撾[秘桿菌的致病性與其攜帶的毒力因子有關(guān)，本株化膿隱秘桿菌攜帶Plo（溶血素）、NanH（神經(jīng)氨酸酶）、CbpA（膠原結(jié)合蛋白）三種毒力基因，其中Plo對牛多形核粒細胞具有毒性效應(yīng)[13]，神經(jīng)氨酸酶分為NanH與NanP，具有多種毒力作用，能夠增強細菌的粘附力和感染力。小鼠致病力試驗結(jié)果顯示，該菌對小鼠具有強致病力，說明分離得到的菌株具有致病性，其中可能與該菌攜帶NanH毒力基因有關(guān)。該菌從豬肺臟膿腫中分離，對豬的致病力尚不清楚，需后續(xù)動物回歸試驗證明。有研究表明從豬膿腫中分離到的化膿隱秘桿菌、金黃色葡萄球菌以及停乳鏈球菌是造成豬表皮膿腫的原因[14]，本試驗從仔豬肺膿腫中分離到的化膿隱秘桿菌沒有其他細菌混合感染的現(xiàn)象，表明該菌作為病原菌的影響逐步擴大。

我國對化膿隱秘桿菌的致病機理及流行病學(xué)調(diào)查還尚不完全，特別是現(xiàn)代化規(guī)模豬場范圍的擴大，化膿隱秘桿菌作為條件致病菌常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病病毒、巴氏桿菌等混合感染引起發(fā)病，豬場飼養(yǎng)人員應(yīng)注意找準(zhǔn)病因，對癥治療，并注意敏感抗生素之間交替用藥防止出現(xiàn)耐藥性。本次試驗通過藥敏試驗篩選出對頭孢噻呋、阿莫西林、左氧氟沙星、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢曲松等抗生素高度敏感，對新霉素、林可霉素、丁胺卡那等常見抗生素出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。本研究為天津地區(qū)規(guī)?；i場化膿隱秘桿菌的預(yù)防和深入研究提供了試驗依據(jù)和用藥參考。