RSV感染氣液相界面培養(yǎng)人支氣管上皮細胞模型的建立及其對HMGB1和pMLKL表達的影響

王 娟，廖煥金，李延寧，戈伊芹，李 佳

（上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，上海 200080）

人支氣管上皮細胞（Human bronchial epithelial cell，hBEC）是氣體交換、呼吸道濕潤和病原體防御的第一道物理和化學屏障，主要由纖毛細胞、杯狀細胞和基底細胞等不同類型上皮細胞組成，屬于假復層上皮[1]。各種類型細胞各司其職，杯狀細胞是產(chǎn)生黏液的主要細胞，產(chǎn)生的黏液起捕獲吸入的顆粒及病原體的作用[2-3]；纖毛細胞通過纖毛擺動將捕獲了顆?；虿≡w的黏液推動到支氣管敏感部位或咽部，最終清除到肺外[3]；基底細胞排列于基底膜，具有干細胞特性，在一定條件下可化生為纖毛細胞和杯狀細胞[4]，是機體黏膜維持正常黏液產(chǎn)生、表層細胞更新和功能維持的生理機制，可被高度調(diào)節(jié)[2]。當在某些刺激條件下細胞化生失衡時，基底細胞可大量化生為杯狀細胞，使其數(shù)量激增，并大量分泌黏液；同時，黏液組成比例失衡、黏性增加，黏液排出困難，導致氣道堵塞，上皮損傷可導致纖毛細胞脫落，氣體彌散至肺泡，引發(fā)缺氧，上皮進一步過氧化物聚集、死亡并脫落，形成惡性循環(huán)，最終發(fā)生呼吸窘迫綜合征[5-6]。這是呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）等多數(shù)呼吸道病毒致病的病理基礎[1]。在當下全球大流行的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）致病性中也尤為明顯，新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）病死者尸檢報告顯示，肺解剖可見大量灰白色黏稠分泌物溢出，氣管腔內(nèi)可見白色泡沫狀黏液和膠凍狀黏液附著[7-8]。

目前，最常見的hBEC研究模型為永生化細胞系液體浸沒式培養(yǎng)模型，該模型簡單、易操作，但僅為單層生長細胞，且細胞類型單一，無法還原h(huán)BEC在人體內(nèi)多細胞類型、假復層、細胞化生等特征。因此，開發(fā)一種能確切復制人體內(nèi)支氣管上皮狀態(tài)和功能，尤其是其假復層分化及氣液相界面生長特征的體外模型，是目前呼吸道病毒相關研究所亟需的。本研究采用支氣管上皮細胞培養(yǎng)的金標準方法——氣液相界面（air-liquid interface，ALI）培養(yǎng)法[9]建立原代hBEC體外培養(yǎng)模型，探究RSV感染該細胞模型的條件，及其對高遷移率族蛋白1（high mobility group box protein 1，HMGB1）和磷酸化混合系列蛋白激酶樣結構域（phosphorylated mixed-lineage kinase domain-like protein，pMLKL）表達的影響，進而分析RSV感染致hBEC損傷的機制，為呼吸道病毒致病機制研究提供關鍵的體外細胞模型。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

原代hBEC購自瑞士LONZA公司，RSVA2株購自美國標準生物品收藏中心。CorningTranswell板（美國Corning公司；24孔，帶6.5 mm直徑、0.4 μm孔徑Transwell小室）。PneumaCult-Ex Basal Medium、PneumaCult-Ex 50×Supplement、PneumaCult-ALI Basal Medium、PneumaCult-ALI 10×Supplement、PneumaCult-ALI Maintenance Supplement（加拿大STEMCELL Technologies公司）。氫化可的松原液（美國Sigma-Aldrich公司），0.2%肝素溶液（美國Invitrogen公司）；羊多克隆抗RSV抗體（貨號20745，英國Abcam公司），鼠抗人HMGB1抗體（貨號MAB1690，美國R&D公司），兔抗人pMLKL抗體（貨號187091，英國Abcam公司）。Alexa Fluor 555標記驢抗羊IgG（貨號A-21432，美國Invitrogen公司），Alexa Fluor 555標記羊抗鼠IgG（貨號A-21422，美國Invitrogen公司），Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG（貨號A-11008，美國Invitrogen公司）。

1.2 hBEC培養(yǎng)

1.2.1 培養(yǎng)液配制 （1）擴展期培養(yǎng)液。室溫融化10 mL PneumaCult-Ex 50×Supplement，將其加入490 mL PneumaCult-Ex Basal Medium中，加入0.5 mL氫化可的松原液和1%青霉素-鏈霉素混合液，輕柔顛倒混勻。配制好的擴展期培養(yǎng)液可在4 ℃條件下保存4周。（2）ALI培養(yǎng)期培養(yǎng)液。將50 mL PneumaCult-ALI 10×Supplement置于4 ℃冰箱過夜融化，輕柔顛倒混勻后，加入450 mL PneumaCult-ALI Basal Medium中，再加入1%青霉素-鏈霉素混合液，輕柔混勻，然后取39.32 mL上述混合液（其余可分裝后-20 ℃凍存），加入400 μL 室溫融化的PneumaCult-ALI Maintenance Supplement、80 μL 0.2%肝素溶液和200 μL氫化可的松原液。配制好的ALI培養(yǎng)液可在4 ℃保存2周。

1.2.2 hBEC的復蘇及擴展期培養(yǎng) 首先，在培養(yǎng)板下室中加入500 μL擴展期培養(yǎng)液，然后用無菌鑷子放入Transwell插件備用。將細胞凍存管37 ℃水浴快速融化細胞，將500 μL細胞懸液無菌轉移至10 mL離心管中，加入1.1 mL 37 ℃溫熱的擴展期培養(yǎng)液重懸細胞，200 μL/孔分別種植于8孔Trans孔膜上（細胞密度為30 000個/孔）。將培養(yǎng)板置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后Transwell上室和下室同時換液，上室換液時需輕柔操作，勿觸及Transwell膜，此后隔天換液。當細胞匯合度達到100%時，將其轉入ALI培養(yǎng)液中培養(yǎng)。見圖1。

圖1 hBEC的ALI培養(yǎng)過程示意圖

1.2.3 hBEC的ALI培養(yǎng) 使用擴展期培養(yǎng)液浸沒式培養(yǎng)至單層細胞匯合度達100%，更換下室培養(yǎng)液為500 μL ALI培養(yǎng)期培養(yǎng)液，吸去上室培養(yǎng)液建立的ALI，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換下室培養(yǎng)液。ALI培養(yǎng)的第1周，上室細胞表面出現(xiàn)少量液體，換液時需及時吸除保持上室干燥。

1.2.4 RSV感染ALI培養(yǎng)的hBEC （1）細胞分組。將ALI培養(yǎng)成熟的hBEC分為以下6組，每組3個復孔：6 h對照組，6 h感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）1.0組，6 h MOI 3.0組，24 h對照組，24 h MOI 1.0組，24 h MOI 3.0組。（2）RSV感染。感染前24 h更換下室培養(yǎng)液為無氫化可的松的ALI培養(yǎng)液。向上室加入200 μL/孔 Hanks Buffer，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育5 min后取出，用槍頭吹打Transwell膜清洗細胞表面的黏液，完全棄去洗液。RSV毒株滴度為1.44×108pfu/mL，加入根據(jù)MOI值稀釋的RSV懸液100 μL/孔，對照組加入100 μL/孔 Hanks Buffer，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中感染6或24 h。吸除上室液體，將Transwell插件轉至已加入500 μL 10%福爾馬林的培養(yǎng)孔中，向Transwell上室中也加入200 μL 10%福爾馬林，固定10 min。固定結束將Transwell插件轉至已加入500 μL磷酸鹽緩沖液的新孔中，上室加入200 μL磷酸鹽緩沖液，輕輕晃動培養(yǎng)板清洗Transwell膜，重復清洗2次后，將Transwell插件浸入磷酸鹽緩沖液，4 ℃過夜。

1.3 HE染色及免疫熒光染色

將Transwell插件倒扣于紙巾上，用手術刀片沿插件底部邊緣切下Transwell膜，石蠟包埋切片。脫蠟后，分別進行HE常規(guī)染色和免疫熒光染色。免疫熒光染色使用穿膜液0.1% Triton室溫作用10 min，10%山羊血清室溫孵育30 min，以封閉非特異性抗原；加入一抗（羊多克隆抗RSV抗體1∶250稀釋，鼠抗人HMGB1抗體1∶300稀釋，兔抗人pMLKL抗體1∶200稀釋），室溫孵育過夜；滴加二抗（Alexa Fluor 555標記驢抗羊IgG 1∶500稀釋，Alexa Fluor 555標記羊抗鼠IgG 1∶500稀釋，Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG 1∶500稀釋），室溫避光孵育60 min；用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染細胞核，中性樹膠封片。

2 結果

2.1 hBEC 擴展期培養(yǎng)

于倒置顯微鏡下觀察接種到Transwell膜上的hBEC形態(tài)規(guī)則，貼壁良好，此后細胞增殖迅速，種植3 d后細胞匯合度約80%[圖2（a）]。不同供者來源的hBEC生長速度略有差異，4～10 d后可觀察到細胞匯合度達100%。

2.2 hBEC ALI 培養(yǎng)

轉為ALI培養(yǎng)后第1周，換液時可見Transwell上室表面有少量液體來自蒸發(fā)的下室培養(yǎng)液，用槍頭輕輕吸去，保持上室干燥，使細胞充分接觸氣體環(huán)境[圖2（b）]。ALI培養(yǎng)2周后，鏡下觀察可見淡黃色云霧狀黏液形成[圖2（c）]，此后黏液逐漸增多。約3周后肉眼可見上室細胞表面出現(xiàn)1層淡黃色覆蓋物，鏡下可見覆蓋物隨培養(yǎng)板晃動出現(xiàn)黏稠狀流動[圖2（d）]。ALI培養(yǎng)第4周，鏡下開始出現(xiàn)條索狀細胞[圖2（e）]，隨后條索狀分布越來越清晰[圖2（f）]，此時hBEC假復層上皮結構分化成熟，HE染色可見其假復層結構及纖毛[圖2（g）、（h）]。之后持續(xù)隔天換液，ALI培養(yǎng)細胞可穩(wěn)定維持3～6個月。

圖2 光鏡下觀察Transwell膜上培養(yǎng)的hBEC

2.3 RSV感染ALI培養(yǎng)的hBEC

為構建并驗證RSV感染ALI培養(yǎng)的hBEC模型，分別設置RSV病毒MOI為1.0和3.0，感染時間分別設置為6和24 h。細胞經(jīng)固定制片，通過抗RSV抗體免疫熒光染色后顯示，MOI為3.0感染24 h的hBEC細胞質(zhì)內(nèi)可見紅色熒光，證實RSV病毒感染成功；而MOI為1.0感染6和24 h及MOI 3.0感染6 h的hBEC中未見紅色熒光，未檢測到感染RSV病毒。見圖3。

圖3 ALI培養(yǎng)的hBEC中的RSV免疫熒光染色（×400）

2.4 RSV感染對hBEC中HMGB1及pMLKL表達的影響

為探討RSV感染后hBEC胞表達HMGB1和pMLKL的變化，采用免疫熒光雙染色，結果顯示，與對照組、MOI 1.0組（6、24 h）、6 h MOI 3.0組相比，MOI 3.0感染24 h后，hBEC細胞核內(nèi)出現(xiàn)粉色熒光（為藍色DAPI和紅色HMGB1熒光Merge結果），證實RSV感染后HMGB1出現(xiàn)核表達；而RSV感染前后均未見pMLKL（綠色）熒光，說明hBEC未表達pMLKL。見圖4。

圖4 ALI培養(yǎng)的hBEC HMGB1和pMLKL免疫熒光雙染色（×400）

3 討論

hBEC是空氣與機體內(nèi)環(huán)境的完美分界，是阻止病毒感染呼吸道的第1道重要防御屏障[10-11]。呼吸道病毒致病機制與支氣管上皮細胞功能失調(diào)密切相關[12-14]，因此，良好的hBEC體外模型是研究呼吸道病毒感染以及哮喘、慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）等常見呼吸道疾病的重要研究基礎[10]。

目前，多數(shù)呼吸道疾病研究采用的體外模型為液體浸沒式培養(yǎng)的永生化支氣管上皮細胞系，如NCI-H292和A549，這些細胞大多來自肺癌細胞，其生理特點并不完全接近正常細胞，且液體浸沒式培養(yǎng)的細胞呈單層單一生長，不能還原體內(nèi)假復層上皮的特性及功能。本研究采用的ALI培養(yǎng)法是目前公認的支氣管上皮細胞培養(yǎng)金標準方法[9]，該方法使細胞營養(yǎng)供給方式發(fā)生變化，即將細胞從周圍吸收營養(yǎng)物質(zhì)改為僅從底部吸收營養(yǎng)物質(zhì)；另外，通過培養(yǎng)液中氫化可的松的作用來引起細胞分化[15]。有少數(shù)研究采用酶消化法或組織塊貼壁法嘗試分離原代支氣管或鼻黏膜上皮細胞，并進行ALI培養(yǎng)，種族來源以小鼠和人為主，也有豬、兔、牛來源的原代細胞。但原代細胞培養(yǎng)存在倫理、供體健康狀態(tài)、取材繁瑣、細胞量少、純度低、成活率低、易污染等問題，一般實驗室較難操作，因此該方法仍處于探索階段。本實驗室在前期也嘗試采用酶消化法分離原代細胞，但同樣存在上述問題，且獲得的細胞無法滿足大量后續(xù)實驗的需求，在實際操作中，自行分離方法可行性較低。經(jīng)過多次比較和探索，本研究最終采用了瑞士LONZA公司的原代hBEC，該細胞分離自兒童供者健康肺組織，我們將該P1代細胞經(jīng)液體浸沒式培養(yǎng)7～10 d，細胞大量增殖后凍存P2代細胞，作為hBEC的細胞庫，不僅可用于后續(xù)ALI培養(yǎng)及病毒相關實驗研究，還可再次復蘇，進行液體浸沒式培養(yǎng)，用于前期實驗條件測試。該方法使后續(xù)實驗均以同批次P2代細胞為來源，避免了多次傳代細胞的去分化，保證了數(shù)據(jù)的可再現(xiàn)性和可靠性。本研究以RSV為研究對象，此病毒以兒童為主要感染對象，因此選擇兒童來源的原代細胞。如研究SARS-CoV-2，根據(jù)其成人易感的流行病學特征[16]，可選擇成人來源的原代hBEC，培養(yǎng)方式與本研究相同。

ALI培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hBEC在完美體現(xiàn)細胞體內(nèi)狀態(tài)和功能的同時，其自身的黏液-纖毛清除系統(tǒng)也為病毒感染體外模型的建立帶來了困難[3]。為克服細胞本身對病毒的防御清除，本研究在實驗中采用了Hanks Buffer清洗黏液，增加RSV用量及延長感染時間的措施，通過RSV免疫熒光染色顯示，這些措施有效增加了病毒的感染效率。

HMGB1是一種典型的核蛋白，在人體內(nèi)廣泛表達，作為轉錄調(diào)控因子，其具有調(diào)節(jié)基因轉錄活化的作用[17]。當細胞發(fā)生pMLKL介導的程序性壞死時，pMLKL可通過激活離子通道或在細胞膜上穿孔破壞離子流，從而誘導膜損傷，最終導致細胞死亡[18-19]；HMGB1作為一種警報蛋白或損傷相關分子蛋白（damage associated molecular pattern，DAMP），被轉移到細胞質(zhì)中，并從細胞中被釋放出來，可起到趨化因子或細胞因子的作用[20-21]。為進一步探討HMGB1在RSV感染的hBEC損傷及致病中的作用，本研究通過免疫熒光雙染色發(fā)現(xiàn)，RSV MOI 3.0感染24 h后，HMGB1在細胞核高表達，未見細胞質(zhì)轉移及胞外釋放，也未見pMLKL表達，推測hBEC在感染24 h后開始出現(xiàn)細胞損傷，但尚未達到壞死水平。有研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染的A549細胞 HMGB1表達增加[22]，RSV支氣管肺炎患兒鼻咽拭子中HMGBl水平升高[23]，在RSV感染小鼠的肺組織中HMGB1表達和釋放明顯增加[24]，與本研究結果一致。但要進一步研究pMLKL通路介導的程序性壞死在RSV感染損傷中的作用，需要后續(xù)增加更多、更長的感染觀察時間點。

綜上所述，本研究構建了ALI培養(yǎng)的hBEC模型，該模型在生長狀態(tài)及功能上更接近支氣管上皮細胞的體內(nèi)狀況。本研究以RSV為對象，分析了不同病毒效價及感染時間對感染效果的影響，并通過免疫熒光染色證實RSV感染的hBEC損傷后HMGB1表達增加；為呼吸道病毒感染、哮喘、COPD等呼吸道常見疾病研究提供了重要的體外模型，為RSV感染治療提供了新思路及新靶點。