2013—2020年四川大學(xué)華西醫(yī)院寄生蟲形態(tài)學(xué)室間質(zhì)量評價結(jié)果分析

鄧山鷹，裴雨晴，張春瑩，謝 恒，蒙 強，馬 瑩

（四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041）

室間質(zhì)量評價（external quality assessment，EQA）又被稱為能力驗證，是促進檢測結(jié)果準(zhǔn)確性與可靠性的有效措施，目的在于評價實驗室的能力，確認(rèn)實驗室間的差異。美國病理家學(xué)會（the College of American Pathologists，CAP）的寄生蟲檢測能力比對采用糞便濕片樣本，要求參加者自行涂片后鏡檢，樣本和操作與臨床一致，不僅考核檢驗人員辨認(rèn)寄生蟲的能力，也考核其發(fā)現(xiàn)寄生蟲的能力。我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心（簡稱臨檢中心）寄生蟲形態(tài)學(xué)室間質(zhì)量評價活動采用通過圖片識別寄生蟲形態(tài)的形式，客觀、有效地考評檢驗人員寄生蟲識別能力。本研究對2013—2020年四川大學(xué)華西醫(yī)院參加CAP和臨檢中心寄生蟲形態(tài)學(xué)EQA的結(jié)果進行回顧分析，并結(jié)合工作實際，歸納了相似寄生蟲（卵）的形態(tài)特征。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2013—2020年四川大學(xué)華西醫(yī)院寄生蟲形態(tài)學(xué)EQA的200份樣本的回報結(jié)果，其中CAP 80份，臨檢中心120份。

1.2 方法

1.2.1 CAP樣本檢測 CAP寄生蟲形態(tài)學(xué)EQA每年3次，每次5個樣本。由于海關(guān)原因，2014、2017年只有2次，2016、2020年0次。每次收到樣本后，均嚴(yán)格按第4版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》中寄生蟲濕片檢查的要求進行操作[1]，將樣本混勻后，滴1滴在潔凈載玻片上，蓋上蓋玻片，涂片厚度以透過玻片可隱約辨認(rèn)書上字跡為宜。先在低倍鏡下按從左到右、從上到下的順序查找全片；找到疑似寄生蟲（卵）后，在高倍鏡下觀察細(xì)微結(jié)構(gòu)；計數(shù)全片查見的寄生蟲（卵）數(shù)量，1～2個蟲卵為少量，3～9個為中等量，≥10個為大量。檢測結(jié)果包括查見的寄生蟲（卵）種類和數(shù)量。將結(jié)果在線報告給CAP后，CAP以線上形式回報，并對所有參評實驗室的結(jié)果做出評價。

1.2.2 臨檢中心樣本檢測 臨檢中心寄生蟲形態(tài)學(xué)EQA每年1次，每次15張圖片，每張圖片上附有寄生蟲大小、染色方法、放大倍數(shù)等信息。由科室所有寄生蟲檢測人員輪流、獨立進行形態(tài)識別，可參閱相關(guān)形態(tài)學(xué)圖譜[2-3]，將其中1位檢測人員的檢測結(jié)果作為實驗室結(jié)果在線上報，臨檢中心以線上形式回報結(jié)果，并對結(jié)果做出評價。

2 結(jié)果

2.1 識別正確率

80份CAP樣本中，有77份識別正確，3份識別錯誤，12份未評分，正確率為96.3%；120份臨檢中心樣本中，118份識別正確，2份識別錯誤，正確率為98.3%。全部200份樣本的正確率為97.5%。5次識別錯誤的寄生蟲見表1。

表1 2013—2020年EQA寄生蟲識別錯誤結(jié)果

200份CAP與臨檢中心樣本涉及30種寄生蟲的47種不同生活史形態(tài)，包括醫(yī)學(xué)原蟲、醫(yī)學(xué)蠕蟲和醫(yī)學(xué)節(jié)肢動物。具體蟲種和不同生活史形態(tài)見表2。

表2 2013—2020年EQA涉及寄生蟲蟲種和生活史形態(tài)

CAP樣本存在寄生蟲量分布不均，且同一樣本含多種寄生蟲（卵）的情況，只有評審員與所有參評實驗室在該樣本的上報一致性比例均＞80%時才會評分。8年中，本實驗室上報的樣本中共有12份未評分，其中11份均是評審員和參評實驗室缺乏共識；而對于樣本2013 P3-17，雖然選擇查見寄生蟲的參評實驗室中有97.4%鑒定為藍氏賈第鞭毛蟲包囊，但由于有25.0%的參評實驗室未查見寄生蟲，所以該樣本被判定為有問題樣本而未評分；具體情況見表3。未評分樣本中易漏檢、難辨認(rèn)原蟲的鑒別特征見表4。

表3 2013—2020年CAP寄生蟲EQA未評分樣本

表4 未評分樣本中易漏檢且較難辨認(rèn)原蟲鑒別特征

3 討論

2013—2020年，CAP和臨檢中心寄生蟲EQA樣本中出現(xiàn)了30種寄生的47種生活史形態(tài)。CAP樣本由于是糞便樣本，所考核的寄生蟲（卵）均是腸道寄生蟲，以藍氏賈第鞭毛蟲包囊出現(xiàn)次數(shù)最多，其次是鞭蟲卵、鉤蟲卵、糞類圓線蟲幼蟲和帶絳蟲卵。臨檢中心的考核是以圖片的形式，除涉及腸道寄生蟲外，還包括血液、骨髓、組織、體液樣本中出現(xiàn)的寄生蟲，以瘧原蟲的各種形態(tài)出現(xiàn)次數(shù)最多，其次是華支睪吸蟲（卵）、日本血吸蟲（卵）、蛔蟲卵、肺吸蟲（卵）、微絲蚴。由于地域的差異和考評形式的不同，CAP與臨檢中心的EQA側(cè)重點稍有不同，故而考核的內(nèi)容可以在一定程度上互補。本實驗室近幾年在實際工作中發(fā)現(xiàn)的寄生蟲以鉤蟲卵為主，其次是人芽囊原蟲、藍氏賈第鞭毛蟲包囊、華支睪吸蟲卵與絳蟲卵，所有寄生蟲類型均在EQA考核范圍內(nèi)。

從本實驗室5次樣本識別錯誤的原因來看，臨檢中心的2次樣本識別錯誤均是由于圖片中寄生蟲的特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)不清晰所造成：結(jié)腸內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體與溶組織阿米巴滋養(yǎng)體的主要鑒別要點在于核仁，前者核仁大，略偏位，核周染色質(zhì)大小不一；后者核仁小，居中，核周染色質(zhì)大小一致，常生出指狀或舌狀單一的偽足（圖1），因該圖片核仁不明顯，影響了檢測人員的判斷。馬來微絲蚴與班氏微絲蚴的主要鑒別要點在于體核與尾核，前者體核不均，有2個尾核前后排列；后者體核均勻，無尾核（圖2）。從臨檢中心考核微絲蚴的圖片上可以看出，每幅圖中只有1條微絲蚴，且個別圖片中的結(jié)構(gòu)特點比較模糊，無法從體核跟尾核上準(zhǔn)確判斷是哪種微絲蚴，增加了辨認(rèn)的難度。在實際工作中，微絲蚴往往不止1條，便于特殊結(jié)構(gòu)的觀察，建議臨檢中心可以在同一圖片上展示多條微絲蚴，以便參評實驗室更好地識別。

圖1 結(jié)腸內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體與溶組織阿米巴滋養(yǎng)體（三原染色，×1 000）（圖片來源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html）

圖2 馬來微絲蚴與班氏微絲蚴（吉姆薩氏染色，×1 000）（圖片來源于臨檢中心）

CAP識別錯誤中，有1次是在識別出姜片/肝片蟲卵的同時，把不典型的蟲卵誤認(rèn)為是裂頭絳蟲卵，同時上報了2種蟲卵，被判定為錯誤。闊節(jié)裂頭絳蟲卵、肺吸蟲卵、姜片蟲卵、肝片吸蟲卵形態(tài)相似，應(yīng)注意鑒別。通過對幾種蟲卵進行復(fù)習(xí)、比較和觀察，總結(jié)了它們各自的形態(tài)特點，除姜片蟲卵和肝片蟲卵在光鏡下較難區(qū)別外，其他幾種蟲卵均可以通過各自的特點，如蟲卵的大小、卵殼的厚薄、卵蓋的大小和形態(tài)進行鑒別：闊節(jié)裂頭絳蟲卵為淺灰褐色，大小為（58～76）μm×（40～51）μm，有卵蓋和小棘；肺吸蟲卵為金黃色，較闊節(jié)裂頭絳蟲卵大[（68～118）μm×（39～67）μm]，卵殼厚薄不均，卵蓋扁平且寬；姜片蟲卵為淡黃色，卵殼薄、卵蓋小且不明顯，是常見蠕蟲卵中最大的蟲卵[（130～150）μm×（60～90）μm]（圖3）。另外2次CAP錯誤都是由于樣本中寄生蟲（卵）數(shù)量少而漏檢，其中1次是漏了樣本中的糞類圓線蟲幼蟲，上報了鞭蟲卵。從回報結(jié)果可以看出，有33.3%的評審員與18.3%的參評實驗室均看到了鞭蟲卵，有42.9%的參評實驗室未查見寄生蟲，說明該樣本中寄生蟲的量存在分布不均的情況。

圖3 有卵蓋且形態(tài)相似的寄生蟲卵（0.9% NaCl溶液涂片，×400）（圖片來源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html）

從CAP的回報結(jié)果中不僅可以看到所有參評實驗室在各個樣本中檢出的寄生蟲（卵）分布情況，而且資料中還會說明該樣本考核的目標(biāo)寄生蟲（卵），以及是否存在2種及以上的寄生蟲（卵），最后還會將考核寄生蟲的形態(tài)、生活史等相關(guān)資料，以及上報結(jié)果中出現(xiàn)的相似寄生蟲（卵）的鑒別要點及難點進行詳細(xì)說明。所以我們可以從12份未評分樣本回報資料中各參評實驗室的上報情況看出，對大多數(shù)實驗室而言，難點都是相似的，即原蟲的識別以及一些少見蟲卵的鑒別。通過對未評分樣本中考核的易漏檢且較難辨認(rèn)的原蟲進行復(fù)習(xí)、比較和濕片查找，本實驗室總結(jié)了它們各自的形態(tài)特征（表4、圖4）。其中人芽囊原蟲近年來在本實驗室的檢出率越來越高，該寄生蟲是一種呈世界性分布，且動物宿主廣泛的人獸共患寄生原蟲，屬于機會致病病原體，其感染率在不同國家和地區(qū)間差異顯著[4]，除南極洲以外的各大洲均有人芽囊原蟲流行的相關(guān)報道[5]。盡管對于人芽囊原蟲的致病性尚存在一定爭議，但隨著近年來人類對人芽囊原蟲認(rèn)識的深入，越來越多的證據(jù)表明，人芽囊原蟲與人類多種疾病密切相關(guān)，其中胃腸道疾病最常見[6]，臨床癥狀以腹痛、腹瀉最多[11]，并且人芽囊原蟲感染還可能是蕁麻疹和皮膚病的一個重要病因[7-8]。這些研究結(jié)果表明，人芽囊原蟲具有潛在致病性。因此，正確識別人芽囊原蟲對相關(guān)疾病的治療非常重要。

圖4 未評分樣本中易漏檢且較難辨認(rèn)原蟲（碘染色，×400）（圖片來源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html）

從樣本2015 P3-13的參評實驗室上報結(jié)果可以看出，上報結(jié)果為考核目標(biāo)的縮小膜殼絳蟲卵的比例比上報結(jié)果為微小膜殼絳蟲卵的低。這2種蟲卵在臨床工作中均比較少見，在鑒別上存在一定困難，特別是當(dāng)標(biāo)本不新鮮時，會增加識別難度。2種蟲卵的鑒別要點在于：縮小膜殼絳蟲卵卵殼較厚，胚膜兩端無極絲，卵殼與胚膜間有輻射狀條紋；微小膜殼絳蟲卵卵殼較薄，卵殼與胚膜間無輻射狀條紋，胚膜兩端凸起，有2～4對極絲（圖5）。

圖5 縮小膜殼絳蟲卵與微小膜殼絳蟲卵（0.9% NaCl溶液涂片，×400）

EQA（特別是臨檢中心EQA）中考核的蛔蟲卵與鉤蟲卵形態(tài)多樣，我們在日常檢測中也會遇到。如脫蛋白質(zhì)膜的受精蛔蟲卵和退變鉤蟲卵，由于與典型蟲卵在形態(tài)上存在一定差異而容易誤認(rèn)。脫蛋白質(zhì)膜受精蛔蟲卵的特點是：卵殼厚，呈雙線層，卵殼和卵細(xì)胞之間可見新月形空隙。退變鉤蟲卵的特點是：卵殼薄、卵細(xì)胞融合為1團，體積變小，卵殼和卵細(xì)胞之間空隙更加明顯。另外，如果患者便秘，或糞便放置過久，鉤蟲卵內(nèi)細(xì)胞分裂為多細(xì)胞期，則與東方毛圓線蟲卵形態(tài)相似，東方毛圓線蟲卵比鉤蟲卵稍大，為長圓形，長一般為寬的2倍以上，一端較尖，卵內(nèi)細(xì)胞為10～20個（圖6）?；紫x卵和鉤蟲卵是臨床上常見的蟲卵，因此它們的各種形態(tài)的辨認(rèn)都非常重要。

圖6 鉤蟲卵與蛔蟲卵、東方毛圓線蟲卵（0.9% NaCl涂片，×400）[（b）圖片來源于臨檢中心；（c）、（d）圖片來源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html]

對于糞便樣本，除需要辨認(rèn)各種相似蟲卵外，還存在各種食物殘渣，形態(tài)各異，有的看上去與某些寄生蟲（卵）相似，容易誤認(rèn)。如華支睪吸蟲卵和靈芝孢子在形態(tài)上非常相似，兩者的鑒別要點是：華支睪吸蟲卵比靈芝孢子大，呈淡黃褐色，在低倍鏡下形似芝麻，高倍鏡下可見明顯的卵蓋、肩峰、小疣、內(nèi)含毛蚴；而靈芝孢子呈棕色，且不具備這些結(jié)構(gòu)（圖7）。含有靈芝孢子的糞便樣本通常呈棕褐色，并且就診者均曾服用過靈芝孢子類藥物或保健品。因華支睪吸蟲感染與膽結(jié)石、膽囊炎等肝膽系統(tǒng)并發(fā)癥密切相關(guān)，且是明確的膽管癌致癌物[9-12]，故正確識別華支睪吸蟲卵對臨床治療意義重大。鉤蟲卵與豌豆花粉顆粒形態(tài)相似；不完整的帶絳蟲卵與十字花科油菜花粉顆粒形態(tài)相似；蟯蟲卵與薔薇科雪花梨花粉顆粒相似；受精蛔蟲卵與菊科植物刺兒菜花粉顆粒以及豆科菜豆花粉顆粒形態(tài)上均相似，極易混淆而致誤認(rèn)，均應(yīng)仔細(xì)識別[13]。

圖7 華支睪吸蟲卵與靈芝孢子（圖片來源于臨檢中心）

要減少和避免EQA樣本與臨床糞便樣本寄生蟲（卵）的漏檢及誤診，除涂片厚薄適中外，還需要增加檢測視野，對于高度懷疑寄生蟲感染的樣本需要通看全片，必要時可采用濃集法檢測。另外，還需要檢驗人員多在顯微鏡下觀察各種寄生蟲（卵），充分掌握其形態(tài)特點。本實驗室將查見寄生蟲（卵）的EQA樣本制作成混合蟲卵樣本，與EQA圖片和圖譜一起，供日常鏡下形態(tài)識別、學(xué)習(xí)和考核比對，以進一步提高寄生蟲形態(tài)學(xué)檢驗?zāi)芰Α?/p>

通過對寄生蟲形態(tài)學(xué)EQA資料階段性的回顧分析，不僅可以了解過去8年本實驗室在EQA中出現(xiàn)的錯誤和出現(xiàn)該類錯誤的頻率，還可以作為以后某一階段回顧性分析的參考資料。通過參加寄生蟲EQA活動，使糞便常規(guī)中寄生蟲檢驗的質(zhì)量得到了提高，檢驗人員檢出和識別寄生蟲的能力也得到了提升。