酶水解對提高燕麥、蕎麥粉發(fā)酵酒精度的影響研究

李 慧，張弘弛，劉 瑞，楊永恒，石金波

（1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所，山西大同 037008）

燕麥和蕎麥?zhǔn)俏覈耘嗝娣e較大的小雜糧作物，具有良好的營養(yǎng)和保健功能。燕麥?zhǔn)撬泄任镏形ㄒ缓性碥账氐霓r(nóng)作物，有控制血糖、降低血壓、膽固醇等保健功能。燕麥中的黃酮類化合物具有抗腫瘤等生物活性。蕎麥富含蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、膳食纖維、礦物質(zhì)及維生素等營養(yǎng)成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，蕎麥黃酮類化合物具有防癌抗癌、調(diào)節(jié)心血管、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、增強免疫力等功能。

由于二者的高營養(yǎng)性和經(jīng)濟性，市場上富含蕎麥、燕麥的產(chǎn)品種類越來越豐富，以燕麥、蕎麥為原料的傳統(tǒng)食品如白酒、啤酒、香醋等產(chǎn)品越來越受到大眾青睞。但傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝多采用曲作為糖化劑，而曲并不能完全將原料中的多糖分解利用，相對于酶催化糖收得率較低，而且發(fā)酵的周期較長。食醋生產(chǎn)時多采用曲作為糖化劑，但相對于酶催化糖收得率較低30 %～50 %。酶法水解可以加快原料中多糖的分解，得到更多的可發(fā)酵性單糖，加快料液中微生物的代謝繁殖，提高料液的發(fā)酵酒精度。

本試驗在發(fā)酵工藝中，加入酶進行原料水解，通過正交試驗優(yōu)化水解工藝條件，大大提高了原料的利用率，使發(fā)酵更加充分，縮短了發(fā)酵時間，提高了發(fā)酵終產(chǎn)物的產(chǎn)量，為蕎麥燕麥酒類工藝研究及相關(guān)發(fā)酵食品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：燕麥、蕎麥粉均產(chǎn)自山西省大同市陽高縣；α-淀粉酶：南寧龐博生物工程有限公司；酒曲：大同酒莊；糖化酶：鄭州一陽食化生物科技。

試劑及耗材：DNS（3，5-二硝基水楊酸）：酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL 蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸0.63 g，NaOH 2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL，貯于棕色瓶中，室溫保存。

儀器設(shè)備：數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市國旺實驗儀器廠；電子天平，常州市宏衡電子儀器廠；752 型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司制造；酸度計，美國奧豪斯ST 3100；酒精計；粉碎機，尼陽機械制造公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝路線

原料干燥→等量混勻→蒸料→加水?dāng)嚢柚羷驖{液→加酶糊化→加酶糖化→酒精發(fā)酵

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 原料粉碎和處理

分別稱取相同質(zhì)量的蕎麥粉和燕麥粉混合，沸水蒸40 min，加水?dāng)嚢柚敝镣耆芙饣靹?，加水量為原料質(zhì)量的4倍。

1.2.2.2 糊化

燕麥?zhǔn)w麥粉混合勻漿液中加入不同量的α-淀粉酶，放于70 ℃的恒溫水浴鍋中酶解20 min。

1.2.3 糖化工藝

將糊化好的混合液冷卻到50 ℃左右，加入糖化酶混勻，控制酶用量、pH 值、溫度、時間進行單因素試驗。在糖化酶的4 個單因素試驗分析基礎(chǔ)上，以燕麥、蕎麥粉酶解液中的還原糖含量為指標(biāo)，選擇酶解時間、加酶量、酶解溫度、pH 值為正交試驗的考察因素，選擇L（3）正交試驗表對這些因素的水平進一步優(yōu)化，見表1。

表1 燕麥?zhǔn)w麥粉酶解正交試驗因素與水平

1.2.4 酒精發(fā)酵

為了縮短發(fā)酵周期，將稱好的酒曲提前進行活化，按照比例添加到已通過α-淀粉酶糊化的混合糊化液中。向未加入糖化酶的燕麥?zhǔn)w麥混合糊化液中加入2 %的大曲糖化之后，再加入1 %的酒曲以30 ℃發(fā)酵。向加入糖化酶并進行了適當(dāng)時間酶解的燕麥?zhǔn)w麥混合勻漿液中以及同時加入糖化酶和1 %大曲并進行了適當(dāng)時間糖化后的燕麥?zhǔn)w麥混合液中，分別加入1%的酒曲進行發(fā)酵。每天早晚觀察兩次并且振蕩，使之排出發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，直至觀察到原料液中再無氣泡產(chǎn)生，說明該發(fā)酵大致結(jié)束，可測定發(fā)酵酒精度。

1.2.5 還原糖含量的測定

還原糖的測定采用DNS 法（3，5-二硝基水楊酸比色法）測定。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.6 酒精含量的測定

將得到的發(fā)酵液離心，蒸餾之后，取適量的液體用酒精計進行酒精含量的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 糊化工藝條件

燕麥?zhǔn)w麥粉混合勻漿液中α-淀粉酶添加量分別為每克燕麥、蕎麥粉10 U、15 U、20 U、25 U、30 U、35 U進行糊化，在糊化液中分別加入糖化酶200 U/g燕麥?zhǔn)w麥粉，調(diào)pH5.5，在55 ℃下酶解180 min 后取出，測還原糖含量，結(jié)果見圖2。

圖2 α-淀粉酶濃度對混合液酶解的影響

由圖2 可知，α-淀粉酶用量越大，最終糊化、糖化后所得的還原糖含量越高，從10 U/g 到30 U/g 增加最為明顯，添加量為30 U/g 后增加緩慢，從節(jié)約成本方面考慮，我們選擇30 U/g 蕎麥燕麥粉的α-淀粉酶用量為最優(yōu)用量。

2.2 糖化工藝單因素試驗

2.2.1 酶解時間對混合糊化液酶解程度的影響

將混合糊化液在溫度55 ℃、pH5.5、糖化酶用量200 U/g 條件下，分別酶解60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min，隨后分別測定還原糖含量，測得結(jié)果見圖3。

圖3 時間對混合糊化液酶解的影響

由圖3 可知，混合勻漿液在酶解時間為90 min到180 min 的酶解效果上升最為明顯，還原糖含量增加明顯，而從180 min以后，還原糖含量甚至沒有明顯的變化，酶解程度基本穩(wěn)定，糖化酶的最適酶解時間為180 min。

2.2.2 酶用量對混合糊化液酶解程度的影響

將混合糊化液在溫度為55 ℃、pH5.5 的條件下進行酶解180 min，分別加入的糖化酶的用量為50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、300 U/g。隨后測定不同酶用量的還原糖含量,測得的結(jié)果見圖4。

圖4 糖化酶用量對混合糊化液水解的影響

圖4 結(jié)果表明，混合糊化液隨糖化酶用量的增加，酶解程度呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。酶用量為50～200 U/g 時，燕麥?zhǔn)w麥混合勻漿液的酶解速度增加較快，而在酶用量為200～300 U/g 時，混合勻漿液的酶解速度增加較為緩慢。如果從生產(chǎn)的角度考慮，選用200 U/g 的糖化酶用量，可以節(jié)約成本，在相對減少酶用量的同時對生產(chǎn)的影響較小。

2.2.3 溫度對混合糊化液酶解程度的影響

將混合糊化液分別在45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃下進行酶解，其他條件均相同，分別為pH5.5，酶解時間180 min，糖化酶用量200 U/g。隨后測其還原糖含量，所得結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對混合糊化液水解的影響

從圖5 中可以明顯的看出，溫度對于燕麥?zhǔn)w麥混合液的酶解程度有明顯的影響。溫度從45 ℃逐漸上升到55 ℃時，混合水解液的酶解程度也隨之不斷提高，而溫度一旦超過55 ℃，混合水解液的酶解程度反而隨著溫度的升高而迅速降低。此現(xiàn)象表明，糖化酶會在超出其最適溫度范圍的高溫下，逐漸失活，喪失其酶解能力。因此，我們選擇將55 ℃作為該糖化工藝的最適酶解溫度。

2.2.4 pH值對混合糊化液酶解度的影響

將混合糊化液置于55 ℃，糖化酶用量200 U/g，酶解時間180 min 的條件下，分別調(diào)pH 值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。酶解后分別測還原糖值，所得結(jié)果見圖6。

圖6 pH值對混合糊化液水解的影響

由圖6 可知，在整個設(shè)定的pH 值梯度中，混合液的酶解程度呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，結(jié)果表明，糖化酶水解該混合糊化液的最適pH值為5.5。

2.3 酶解正交試驗

燕麥、蕎麥粉酶解試驗的正交試驗結(jié)果見表2。由表2 可看出，在燕麥、蕎麥糊化液的酶解試驗中，各因素影響酶解反應(yīng)的大小順序為C＞B＞A＞D，即酶用量對于酶解程度的影響最大，其次是酶解時間，pH 值和酶解溫度相對來說影響小。最佳的優(yōu)化工藝為ABCD，pH值為5.5，酶解時間為180 min，糖化酶用量為300 U/g，酶解溫度為55 ℃。

表2 燕麥?zhǔn)w麥糊化液酶解的正交試驗結(jié)果

由表3 可知，F(xiàn) 值＞F=3.11，表示在0.10 水平上顯著，說明酶用量對于混合液酶解產(chǎn)生的還原糖量有顯著影響（p＜0.10），是影響酶解的主要因素。而其他因素對混合液酶解程度影響不大。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析

分別取等質(zhì)量的燕麥和蕎麥粉混合后，于最佳條件中發(fā)酵，進行試驗驗證，燕麥、蕎麥混合液經(jīng)過發(fā)酵實驗測得還原糖含量為13.7%。

2.4 酒精發(fā)酵

在未加入糖化酶的燕麥?zhǔn)w麥混合糊化液中，加入2 %的大曲進行糖化，糖化得還原糖結(jié)果為8.92%，隨后加入1%的酒曲進行發(fā)酵，置于恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)定溫度28 ℃，發(fā)酵結(jié)束測得酒精度為3%vol，發(fā)酵時間6 d。

加入了糖化酶的燕麥、蕎麥混合糊化液，進行糖化得還原糖結(jié)果為13.11%，隨后加入1%的酒曲進行發(fā)酵，置于恒溫培養(yǎng)箱設(shè)定溫度為28 ℃，發(fā)酵后測得酒精度為5%vol，發(fā)酵時間4 d。

同時加入了糖化酶和1%大曲的燕麥、蕎麥混合糊化液，進行糖化得還原糖結(jié)果為13.95%，隨后加入1 %的酒曲，置于恒溫培養(yǎng)箱進行發(fā)酵，設(shè)定溫度為28 ℃，發(fā)酵后測得酒精度為6%vol，發(fā)酵時間4 d。

由圖7 可知，燕麥、蕎麥粉經(jīng)酶解后，進行酵母發(fā)酵提高了發(fā)酵酒精度，同時大大縮短了酒精的發(fā)酵周期。從第2 個和第3 個方案比較可以看出，同時加入糖化酶和大曲進行糖化，可以提高發(fā)酵的酒精度，但是對于發(fā)酵周期并沒有影響。

圖7 3種試驗方案的發(fā)酵酒精度和發(fā)酵時間結(jié)果

3 結(jié)論

在α-淀粉酶的糊化作用下，加入糖化酶充分的酶解燕麥、蕎麥混合漿液中的淀粉，使其變成可被酵母發(fā)酵利用的還原糖。通過單因素和正交試驗，以還原糖含量為指標(biāo)進行酶解條件優(yōu)化，結(jié)果表明，在α-淀粉酶添加量為30 U/g 燕麥、蕎麥粉，溫度70 ℃條件下糊化；糖化酶用量300 U/g 燕麥、蕎麥粉，酶解時間180 min，pH5.5，酶解溫度55 ℃下糖化，燕麥、蕎麥混合漿液中的還原糖含量提高至13.95%，經(jīng)酵母發(fā)酵后酒精度達(dá)到6%vol，發(fā)酵時間為4 d。燕麥和蕎麥同比例混合的情況下，用適量的α-淀粉酶和糖化酶進行糊化、糖化，不僅可以節(jié)約大曲的用量，而且可發(fā)酵性糖的含量也大大提高，提高了發(fā)酵酒精度，同時也可以提高此工藝生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量。