根據CLSI EP09-A3文件對不同方法檢測糖化血紅蛋白A1c的可比性分析

李偉 李燕 馬琳琳 黃茜北 吳文禮

作者單位：835000 新疆維吾爾自治區(qū)伊寧，新疆生產建設兵團第四師醫(yī)院檢驗科

在發(fā)達國家和發(fā)展中國家，2型糖尿病及其相關并發(fā)癥由于發(fā)病率和病死率升高，正日益成為嚴重的社會負擔。預計2010年至2030年，發(fā)達國家和發(fā)展中國家的成人糖尿病患者數將分別增加約20%和69%。亞太地區(qū)已被確定為糖尿病發(fā)病的中心，因為該地區(qū)經歷了快速的經濟發(fā)展，伴隨居民久坐的生活方式和營養(yǎng)不良，上述因素都增加了糖尿病的患病風險。僅在我國，糖尿病的發(fā)病率就從1980年的不足1%升高到2008年的近10%［1］。美國糖尿病控制與并發(fā)癥試驗（Diabetes Controls and Complications Trial，DCCT）以及英國糖尿病前瞻性研究組（United Kingdom Prospective Study of Diabetes，UKPDS）指出，在1型和2型糖尿病患者中，隨著糖化血紅蛋白A1c（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）水平降低，并發(fā)癥的發(fā)生風險也有所降低。但是口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）和空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）不能準確反映患者的血糖控制情況［2］。HbA1c已被公認為一項準確可靠的指標，可用于糖尿病患者的診斷和血糖控制評估。該指標反映患者過去8～12周的平均血糖水平，與其他糖尿病診斷指標比較，HbA1c具有較少的分析前和生物學變異性，由于不需要空腹檢測，因此對患者和臨床醫(yī)生較方便。目前臨床實踐和指南普遍認可以HbA1c作為確定患者是否達到或超出血糖目標的參考標準，同時為指導有關治療方案變化提供決策［3］。美國糖尿病協(xié)會（American Diabetes Association，ADA）推薦糖尿病患者HbA1c目標為低于0.070，美國臨床內分泌學家協(xié)會（American Association of Clinical Endocrinologists，AACE）推薦的HbA1c目標為低于0.065，國際臨床化學聯(lián)合會（International Federation of Clinical Chemistry，IFCC）推薦的HbA1c值為低于0.050。國際專家委員會（International Expert Committee，IEC）推薦當HbA1c水平高于0.065即可診斷為糖尿?。?］。目前，基于3種不同的分析原理（陽離子交換色譜法、親和層析法和免疫比濁法）有超過20種不同的HbA1c測定方法，但有研究指出，不同的HbA1c檢測方法在可比性及一致性上存在顯著偏差，因此，不同檢測方法所得HbA1c結果的可比性就成為一個重要問題［5］。本實驗參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP09-A3文件，對新疆生產建設兵團第四師醫(yī)院檢驗科采用的毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）與離子交換高效液相色譜法（ion exchange high-performance liquid chromatography，IE-HPLC）檢測HbA1c的結果進行比較，旨在為臨床提供準確和可靠的HbA1c檢測結果，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1樣本來源 選擇新疆生產建設兵團第四師醫(yī)院的65例門診及體檢患者作為研究對象，使用含有乙二胺四乙酸二鉀（dipotassium ethylenediamine tetra-acetate，EDTA-K2）的抗凝采血管采集患者靜脈全血，在2～6 ℃冰箱中保存標本，盡可能在2 d內完成標本檢測。HbA1c水平為0.004～0.016，且不同水平所占比例均符合EP09-A3文件要求。

1.2儀器與試劑 基于HPLC的ADAMSTMA1c HA-8180全自動糖化血紅蛋白分析儀（日本愛科來株式會社）及原裝配套試劑（批號：8K1321、8C1331、9C1366）、校準品（批號：HBA1C1209）和質控品（批號：水平1：33971；水平2：33972）；Capillarys 2 FLEX Piercing全自動高壓液相毛細管電泳儀（法國賽比亞公司）及原裝配套試劑（批號：15057/80、25106/01、13028/80）、校準品（批號：06115/07）和質控品（批號：水平1：58031，水平2：58032）。

1.3研究方法

1.3.1比對系統(tǒng) ADAMSTMA1c HA-8180及配套試劑組成的HbA1c測定系統(tǒng)為參比系統(tǒng)（X），Capillarys 2 FLEX Piercing及配套試劑組成的HbA1c測定系統(tǒng)為待評系統(tǒng)（Y）。

1.3.2樣本測定 根據EP09-A3文件要求，使用IE-HPLC法和CE法對收集的65份患者全血樣本進行分析，每種方法對同一樣本進行兩次重復測定，并記錄結果。在試驗開始時校準參比和待評測量程序，以確保每個程序都符合所有質量控制（質控）參數。如有必要，按照儀器說明書或實驗室操作規(guī)程重新校準參比或待評測量程序。

1.3.3可視化數據審查 依據EP09-A3文件要求，采用目測散點圖、差異圖以及廣義極端學生化偏差法對65份患者樣本檢測結果進行異常結果（離群值）檢查。

1.4統(tǒng)計學處理 應用MedCalc和GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件處理數據。通過可視化數據審查，即目測散點圖、差異偏差圖、百分比差異偏差圖、排序差異偏差圖、排序百分比差異偏差圖的具體特征，確定兩種方法測定結果差異的變化，即恒定標準差（standard deviation，SD）、恒定變異系數（coefficient of variation，CV）、差值混合變化，選擇最優(yōu)的回歸模型進行計算。

1.4.1檢測異常結果（離群值） 根據EP09-A3文件要求，對離群值檢測采用廣義極端學生化偏差法。具體流程如下：① 設置顯著性水平（α）用于檢測異常值，其典型值為0.05或0.01；② 通過差異圖或其他審查數據集的方式確定是否存在潛在的異常值，以樣品例數的5%設置潛在異常值數量的上限（h），h＝N×5%，并四舍五入為整數；③ 對每個數據集，根據廣義極端學生化偏差法確定一個或多個可疑結果是否在統(tǒng)計上被視為異常值；④ 計算CE法檢測HbA1c結果（Y）與IE-HPLC法檢測HbA1c結果（X）差值的平均值（-d） 和SD；⑤ 計算最大偏移值（extreme studentized deviate ，ESDi）［6］；⑥ 計算最大臨界值（λi）［6］；⑦ 若ESDi≤λi，則認為該值為非離群值，再重復計算第2個ESDi和λi，直到ESDi＞λi，則認為該值為離群值，但最大不超過h個循環(huán)。

1.4.2方法學比較和偏倚評估 根據EP09-A3指南，繪制散點圖、差異偏差圖、百分比差異偏差圖、排序差異偏差圖、排序百分比差異偏差圖和差異頻數分布柱狀圖，判斷CE法和IE-HPLC法測定HbA1c結果的分布規(guī)律，以及兩種方法測定HbA1c結果間差異的變化特點，根據兩種方法測定HbA1c結果的散點圖和4種差異偏差圖的具體特征，選擇最合適的回歸方程，計算醫(yī)學決定水平處的偏倚及偏倚95%可信區(qū)間（95% confidence interval，95%CI），以偏倚值在95%CI范圍內為可接受標準。

1.4.3臨床可接受水平 根據中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《糖化血紅蛋白檢測》WS/T461-2015，推薦臨床可接受水平為±0.5%，但控制在±0.3%為宜。

2 結果

2.1兩種方法所得HbA1c結果比較 IE-HPLC法與CE法檢測HbA1c的結果分別為0.081（0.065，0.114）和0.078（0.064，0.113），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（Z＝0.222，P＝0.824）。

2.2離群值檢測 采用廣義極端學生化偏差法進行離群值檢驗，結果顯示58、56、1、64號全血樣品ESDi值均小于λi值，提示無離群值存在。見表1。

表1 廣義極端學生化偏差法檢驗離群值計算結果

2.3數據作圖

2.3.1散點圖 以IE-HPLC法檢測HbA1c的結果（Xi）為X軸，CE法檢測HbA1c的結果（Yi）為Y軸繪制散點圖，顯示CE法和IE-HPLC法檢測HbA1c結果緊密圍繞在回歸方程線性周圍，差異表現(xiàn)為恒定SD，線性回歸方程為Y＝-0.060 92+0.993 1X，r＝0.998，斜率b的95%CI為0.981 9～1.004 3（P＜0.000 1）。見圖1。

圖1 2種不同方法檢測HbA1c結果散點圖

2.3.2差異偏差圖 根據EP09-A3指南，繪制差異偏差圖時應考慮兩個因素，第一個因素取決于試驗者是否希望將參比方法視為與候選方法進行比較的真實值，或將兩種方法的平均值視為樣本真實值的最佳估計值。第二個因素是兩種測量方法之間的差異可變性是恒定的還是與水平軸上的數值成比例的。綜合考慮這兩種因素，以IE-HPLC法檢測HbA1c結果作為X軸，以毛細管電泳法與IE-HPLC法檢測HbA1c結果的差值及其占IE-HPLC法檢測HbA1c結果的比例作為Y軸，繪制差異偏差圖和百分比差異偏差圖。見圖2。

圖2 2種方法檢測HbA1c的差異偏差圖（2A）和百分比差異偏差圖（2B）

2.3.3差值頻數分布圖 繪制2種方法測定HbA1c結果的差值頻數分布圖，結果顯示差值頻數分布呈非正態(tài)分布。見圖3。

圖3 2種方法檢測HbA1c結果百分比偏差頻數分布圖

2.4結果比較與偏倚評估

2.4.1差異偏差圖特征分析及相應的回歸模型選擇 根據EP09-A3指南要求，對65份患者全血標本的HbA1c結果繪制散點圖、差異偏差圖、百分比差異偏差圖。CE法與IE-HPLC法測定HbA1c的結果差值變化為恒定SD，測定結果總體呈現(xiàn)線性變化趨勢，r2≥0.95，因此選擇普通線性回歸（ordinary linear regression，OLR）分析模型進行擬合。

2.4.2回歸模型選擇及偏移評估 EP09-A3指南提供了5種回歸模型，如果兩種方法測定結果間差值變化表現(xiàn)為恒定SD，則采用OLR回歸和恒定SD的Deming回歸。如果兩種方法測定結果間差值變化表現(xiàn)為恒定CV，則采用加權的最小二乘法（weighted least squares，WLS）回歸、恒定CV的Deming回歸及Passing-Bablok回歸。根據本試驗CE法和IE-HPLC法測定HbA1c結果的散點圖和差異偏差圖表現(xiàn)的數值變化特點，各數據點差值變化一致（恒定SD），r2≥0.95，選取OLR作為最佳回歸模型進行擬合，回歸方程為Y＝-0.060 92+0.993 1X。將0.065、0.098這兩個HbA1c醫(yī)學決定水平值分別代入擬合方程，其在醫(yī)學決定水平處的偏倚值分別為-0.105 8%和-0.128 5%，均在偏倚的95%CI范圍內。見表2。

表2 采用OLR回歸模型估算HbA1c醫(yī)學決定水平點偏倚結果

3 討論

糖尿病的高發(fā)病率已經成為近20年來世界范圍內的公共衛(wèi)生問題。2型糖尿病是最常見的糖尿病，患者數約為糖尿病總患者數的85%～90%［6-7］。糖耐量受損是2型糖尿病發(fā)生的預測因子，也是發(fā)生大血管病變的危險因素。2型糖尿病在早期階段通常無癥狀，并且可能在幾年內不被發(fā)現(xiàn)。越來越多的證據表明，有一半的2型糖尿病患者不知道自己患病，因此早期診斷并給予治療可以減少長期并發(fā)癥的發(fā)生［8］。HbA1c能反映患者過去2～3個月的平均血糖水平，是監(jiān)測糖尿病患者代謝控制程度的重要參數，因此作為評價碳水化合物代謝的獨立參數［9-10］。再現(xiàn)性作為糖尿病患者體內數值的長期可比性是絕對必要的。在DCCT和UKPDS發(fā)表后，HbA1c被引入作為監(jiān)測晚期糖尿病并發(fā)癥潛在發(fā)展的風險參數。在這種背景下，準確度成為允許在糖尿病管理中使用HbA1c作為治療目標的重要因素。2010年，ADA進一步強調了HbA1c在糖尿病診斷中的重要作用，將HbA1c的分析臨界值設為0.065［11］。在首次對HbA1c進行定量檢測后，人們采用多種方法來測定HbA1c，從簡單的手工微柱法到非常精確的自動高壓液相色譜法等。由于HbA1c測定方法的改進和標準化的推行，HPLC對全血直接測定HbA1c，其批內和批間CV均＜1%，檢測結果精確，不受存在的變異型血紅蛋白及其衍生物的影響，因此，美國國家糖化血紅蛋白標準化計劃（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP）、DCCT及IFCC HbA1c標準化工作組選擇HPLC法作為測定HbA1c的“金標準”［12］。

近年來，同一臨床實驗室普遍采用不同儀器和方法對HbA1c進行測定，而有研究表明，采用不同測定原理的方法檢測HbA1c所得結果存在一定程度的差異，各種檢測方法測定HbA1c結果的可比性及一致性尤其重要［13-14］。由于臨床實際工作的需要，本實驗室采用IE-HPLC法和CE法檢測HbA1c，根據中國合格評定國家認可委員會CNAS-CL01《檢測和校準實驗室能力認可準則》中要求規(guī)定，實驗室采用不同檢測方法或設備測定同一樣品的同一項目時，應驗證測定結果在不同方法間的一致性。由于ADAMSTMA1c HA-8180全自動糖化血紅蛋白分析儀已在實驗室使用了較長時間，每年都參加新疆維吾爾自治區(qū)臨床檢驗中心組織的室間質評且成績優(yōu)秀，因此以該系統(tǒng)所用IE-HPLC法作為參考方法，而Capillarys 2 FLEX Piercing HbA1c電泳儀所用CE法作為待評方法與其進行結果比對和偏倚評估分析。參考EP09-A3指南和試驗方法比對方面的相關文獻，根據比對試驗所獲得兩種方法測定的HbA1c結果，繪制了兩者結果間的散點圖和差異偏差圖，未發(fā)現(xiàn)有明顯的異常值（離群值），進一步檢驗離群值，確保無離群值的存在［15-17］。通過分析兩種方法檢測結果間的散點圖、差異偏差圖、百分比差異偏差圖的變化特征，結果表明CE法和IE-HPLC法測定HbA1c的結果間呈現(xiàn)線性變化趨勢，兩種方法測定結果間差值變化的總體趨勢表現(xiàn)為恒定SD。雖然兩種方法檢測HbA1c的結果存在偏倚，但偏倚在規(guī)定的臨床可接受范圍內，在實驗室日常的操作過程中，作為IE-HPLC法備選方法的CE法，其檢測HbA1c結果可以向臨床發(fā)出。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突