環(huán)狀RNA在乳腺癌中作用的研究進(jìn)展

何 嘯，胡為杰，呂文昌，任玉萍，吳 敏，吳毅平，張 奇

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 整形美容外科，湖北 武漢 430022)

乳腺癌(breast cancer，BC)是中國女性發(fā)病率最高的癌，并且是導(dǎo)致癌死亡的主要原因[1]。乳腺癌有5種基因分型，主要包括管腔上皮A型、管腔上皮B型、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)過表達(dá)型、基底樣型和正常乳腺樣型。此外，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)具有高轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等惡性特征，其免疫組織化學(xué)定義是雌激素受體、孕激素受體和HER2的表達(dá)缺失，且其中50%～75%的TNBC為基底樣型[2]。乳腺癌具有高復(fù)發(fā)性、高轉(zhuǎn)移性及耐藥性等特征，仍是當(dāng)前亟待解決的難題?；谛滦湍[瘤分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與機(jī)制研究，對(duì)乳腺癌治療具有重要的意義。內(nèi)源性環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)為一類新型的非編碼RNA，在果蠅、小鼠、人類等多種物種中均有表達(dá)。最新研究表明，circRNA參與了乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移并干預(yù)乳腺癌治療效果。因此，本文主要綜述了近年來circRNA在乳腺癌中的作用機(jī)制和耐藥的研究進(jìn)展。譯circRNA在乳腺癌中的功能與機(jī)制，將有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌腫瘤本質(zhì)的新認(rèn)識(shí)，提供新穎的乳腺癌治療策略。

1 CircRNA分類和形成

CircRNA根據(jù)其組成可分為3種類型：外顯子circRNA(exonic circRNA，ecircRNA)、內(nèi)含子circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)和外顯子-內(nèi)含子circRNA(exon-intronic circRNA，EIciRNA)[3]。CircRNA的形成是一種可變的環(huán)化剪接，根據(jù)剪接位點(diǎn)的不同，產(chǎn)生不同類型的circRNA，主要包括三種機(jī)制：外顯子跳躍、直接反向剪接和依賴RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)剪接。外顯子跳躍指的是pre-mRNA在轉(zhuǎn)錄過程中被部分折疊，導(dǎo)致下游外顯子的3-SD(splicing donor)與上游外顯子的5′-SA(splicing acceptor)連接，形成既包含外顯子又包含內(nèi)含子的RNA套索，移除內(nèi)含子后，最終形成ecircRNA。直接反向剪接則是pre-mRNA的側(cè)翼內(nèi)含子互補(bǔ)序列通過直接堿基配對(duì)形成套索，通過去除或保留內(nèi)含子可分別形成ecircRNA或EIciRNA。依賴RBP剪接是指，RBP與外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子上、下游堿基序列結(jié)合，拉進(jìn)兩側(cè)內(nèi)含子之間的距離，形成circRNA。

2 CircRNA主要特征

CircRNA具有多樣性、特異性、保守性和穩(wěn)定性等特征。就多樣性而言，circRNA廣泛表達(dá)于多種原生生物、真菌、果蠅、植物和人類等生命體。CircRNA也存在于人體多種體液、組織和器官中。在一些特殊情況下，單個(gè)細(xì)胞中circRNA比相關(guān)的信使RNA(messenger RNA，mRNA)更為豐富。CircRNA具有特異性，即不同細(xì)胞、組織中，或者同一組織正常和病理狀態(tài)中，存在差異性的circRNA表達(dá)譜，并且會(huì)隨著細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生變化。例如，circRNA在幼豬腦發(fā)育過程中呈時(shí)空動(dòng)態(tài)性變化[4]。CircRNA表達(dá)譜在各物種之間具有保守性，不僅在哺乳動(dòng)物中是保守的，且在進(jìn)化上相對(duì)較遠(yuǎn)的果蠅間也具有保守性。CircRNA是RNA剪接的保守且非隨機(jī)產(chǎn)物，與ALU重復(fù)有關(guān)，并參與調(diào)控基因表達(dá)[5]。有意思的是，在豬中的大約20%與circRNA生成相關(guān)的剪切位點(diǎn)在老鼠和人類中也有相同的功能[6]。此外，circRNA通過5′與3′端首尾相連共價(jià)閉合形成環(huán)狀分子，在結(jié)構(gòu)上缺乏易被降解的3′端poly尾。因此，circRNA在一定程度上可避免被RNA外切酶降解，并通過RNA折疊維持基因結(jié)構(gòu)，使得circRNA具有較高的穩(wěn)定性。

3 CircRNA調(diào)控機(jī)制

CircRNA主要通過競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)、結(jié)合RBP、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯以及生成假基因來發(fā)揮調(diào)控作用。CeRNA功能是circRNA最經(jīng)典的腫瘤學(xué)作用機(jī)制，即circRNA可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)競爭性結(jié)合微小RNA(microRNA，miRNA)，對(duì)miRNA產(chǎn)生“海綿作用”，抑制miRNA的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，從而提高相應(yīng)mRNA的胞內(nèi)濃度并調(diào)節(jié)細(xì)胞功能(圖1)。RBP是一類可以結(jié)合RNA并協(xié)助調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的蛋白質(zhì)，在circRNA的剪接、處理、折疊、穩(wěn)定和定位中發(fā)揮重要作用。CircRNA與RBP的結(jié)合同樣參與了調(diào)控腫瘤進(jìn)展。EIciRNA主要定位在細(xì)胞核中，可與U1核小RNA結(jié)合形成復(fù)合體，再與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物啟動(dòng)子Pol Ⅱ相互作用，最終促進(jìn)親本基因表達(dá)[7]。一些位于細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)源性circRNA具有合適的結(jié)構(gòu)和翻譯長度，這表明circRNA具有一定的蛋白質(zhì)編碼潛力[8]。然而關(guān)于乳腺癌中circRNA翻譯功能的研究還尚未見諸報(bào)道。CircRNA可通過反轉(zhuǎn)錄形成假基因，而假基因可調(diào)控DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平并廣泛存在于多種腫瘤中。目前關(guān)于circRNA和假基因的研究非常少，有待進(jìn)一步探索。

圖1 CircRNA最主要的腫瘤學(xué)作用機(jī)制

4 CircRNA在乳腺癌(BC)中作用的相關(guān)機(jī)制

4.1 CircRNA調(diào)控乳腺癌(BC)細(xì)胞增殖

在TNBC中，circRNA可以通過多種方式調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖。Circ-TFCP2L1在TNBC中顯著上調(diào)，導(dǎo)致TNBC患者的無病生存時(shí)間縮短。Circ-TFCP2L1通過海綿化miR-7來降低PAK1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)TNBC的增殖和遷移[9]。CircPLK1通過競爭性結(jié)合miR-296-5p，增加Plk1合成，最終可促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]；CircAGFG1作為miR-195-5p的“海綿”，可緩解miR-195-5p對(duì)CCNE1的抑制作用，從而加速細(xì)胞分裂和增殖[11]。CircRNA_069718在TNBC組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯增加，降低circRNA_069718的表達(dá)可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來減少β-catenin、原癌基因、cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而抑制TNBC的增殖[12]。與之相反，circ-ITCH的顯著下調(diào)與TNBC的不良預(yù)后有關(guān)，circ-ITCH可以結(jié)合miR-214和miR-17并增加ITCH的表達(dá)，從而滅活Wnt/β-catenin信號(hào)，抑制TNBC的增殖[13]。

低氧是乳腺腫瘤微環(huán)境的主要特征之一。低氧可通過circRNA-miRNA-mRNA軸調(diào)控乳腺癌細(xì)胞分化、增殖及轉(zhuǎn)移。CircDENND4C可競爭性結(jié)合miR-200b和miR-200c，而下調(diào)circDENND4C的表達(dá)可通過促進(jìn)miR-200b和miR-200c的表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的糖酵解、轉(zhuǎn)移和侵襲能力[14]。低氧微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中HIF1α相關(guān)的circDENND4C表達(dá)，而敲除circDENND4C基因，可以抑制低氧環(huán)境下乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。

4.2 CircRNA調(diào)控乳腺癌(BC)細(xì)胞轉(zhuǎn)移

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是乳腺癌細(xì)胞獲得侵襲能力的重要途徑，指上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性以及與基底膜間的連接，進(jìn)而獲得高轉(zhuǎn)移、抗凋亡和可降解細(xì)胞外基質(zhì)等特性。CircANKS1B通過競爭性結(jié)合miR-148a-3p和miR-152-3p來增加轉(zhuǎn)錄因子USF1的表達(dá)，進(jìn)而激活TGF-β1/Smad信號(hào)、促進(jìn)EMT，最終促進(jìn)了TNBC的侵襲轉(zhuǎn)移[16]。Hsa_circ_001569基因表達(dá)下調(diào)可減少PI3K/AKT通路激活和抑制EMT效應(yīng)，并因此抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[17]。Circ-TFF1和TFF1在BC中均過表達(dá)且呈正相關(guān)。Circ-TFF1在體外可促進(jìn)BC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT，在體內(nèi)可通過海綿化miR-326增加TFF1表達(dá)，促進(jìn)BC細(xì)胞增殖[18]。CircRNA-miRNA-mRNA軸可能在乳腺癌轉(zhuǎn)移癌的治療中發(fā)揮重要作用。Hsa_circ_21439和hsa_circ_11783分別是肝轉(zhuǎn)移癌組織細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)最顯著的circRNA，且這兩種circRNA可以作為ceRNA發(fā)揮作用，可能是乳腺癌肝轉(zhuǎn)移潛在的治療靶點(diǎn)[19]。

4.3 CircRNA調(diào)控乳腺癌(BC)化療耐藥

乳腺癌耐藥特征是影響乳腺癌治療的重要因素之一。阿霉素、他莫西芬、單星素已被廣泛應(yīng)用于乳腺癌患者的化學(xué)藥物治療(簡稱化療)，circRNA主要參與了這3種化療藥物的耐藥作用。

阿霉素是一種抑制DNA和RNA合成的臨床用廣譜抗腫瘤藥物。CircKDM4C可競爭性結(jié)合miR-548p，而上調(diào)miR-548p的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)circKDM4C誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞惡性表型減弱和PBLD的表達(dá)升高[20]。CircKDM4C在體內(nèi)外均可顯著抑制乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移，并減緩乳腺癌患者對(duì)阿霉素的耐藥。與阿霉素敏感組相比，hsa_circ_0006528在阿霉素耐藥細(xì)胞系和組織中表達(dá)水平更高。相關(guān)機(jī)制可能為hsa_circ_0006528競爭性結(jié)合miR-7-5p，從而抑制Raf1相關(guān)MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌阿霉素耐藥的發(fā)生[21]。

他莫昔芬是一種主要用于雌激素受體陽性乳腺癌患者的非甾體類藥物。CircBMPR2在人乳腺癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，同時(shí)circBMPR2的下調(diào)可抑制他莫昔芬誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的耐藥[22]。Hsa_circ_0025202在乳腺癌組織中表達(dá)明顯降低，其可通過競爭性結(jié)合miR-182-5p來調(diào)控FOXO3a的表達(dá)和活性，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，增加乳腺癌細(xì)胞凋亡和對(duì)他莫昔芬的敏感性[23]。此外，上調(diào)circRNA CDR1-AS的表達(dá)，可通過抑制hsa-miR-7功能，減少了他莫昔芬治療乳腺癌的不良反應(yīng)，增強(qiáng)乳腺癌復(fù)發(fā)患者療效[24]。

單星素是一類作用于有絲分裂紡錘體的乳腺癌化療藥物，能通過抑制有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白Eg5活性發(fā)揮腫瘤抑制作用。CircRNA-MTO1在單星素耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平升高，此外circRNA-MTO1可通過結(jié)合TRAF4，并抑制TRAF4所激活的Eg5翻譯從而抑制Eg5蛋白水平，證實(shí)circRNA-MTO1的調(diào)控機(jī)制可影響乳腺癌細(xì)胞生存力和單星素耐藥性[25]。

5 問題與展望

作為新興的調(diào)控分子，circRNA參與了乳腺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥。CircRNA主要通過ceRNA機(jī)制調(diào)控乳腺癌相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮致癌或抑癌作用。然而，關(guān)于circRNA的研究還處于方興未艾階段，仍有許多問題有待探索，如circRNA命名缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，以及circRNA乳腺癌中的功能和機(jī)制的研究還比較少；而且，闡明乳腺癌中circRNA的生物發(fā)生、降解、細(xì)胞定位和作用機(jī)制仍然至關(guān)重要；此外，circRNA對(duì)乳腺癌治療主要聚焦于化療藥物耐藥特性，而circRNA對(duì)其他免疫治療、放射治療等抵抗作用還知之甚少，也需要格外的關(guān)注。深入了解circRNA在乳腺癌中的作用機(jī)制和耐藥影響，將促進(jìn)乳腺癌治療策略的開發(fā)，以及有益于乳腺癌相關(guān)的早期篩查、精準(zhǔn)診斷和預(yù)后監(jiān)測等諸多領(lǐng)域。