草莓果實病原菌的分離鑒定及對12種殺菌劑的敏感性

姜莉莉，王欽超，宗曉娟，王曉芳，田中一久，武沖

（1.山東省果樹研究所／山東省現(xiàn)代設施果樹技術創(chuàng)新中心，山東 泰安 271000；2.龍口省級農(nóng)業(yè)高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)管委會，山東 龍口 265701）

草莓（Fragaria ananasaDuch）屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實味美多汁、口感上佳，且富含維生素、花色苷等多種營養(yǎng)成分，深受消費者喜愛［1］。由于草莓果皮薄、果肉組織柔軟，在采摘和采后貯運過程中極易受到擦碰，導致病原菌侵染而迅速腐爛，造成巨大經(jīng)濟損失［2］。

草莓含水量較高，易促使微生物生長繁殖。微生物是影響草莓貯存期的重要因素，因此抑制微生物的生長是提高草莓保鮮效果、延長貨架期的必要條件，也是草莓采后產(chǎn)業(yè)迫切需要解決的問題［3］。本研究從‘章姬’草莓的腐敗果實中分離病原菌，進行菌種鑒定，并通過測定室內(nèi)毒力評價其對12種殺菌劑的敏感性，篩選得到高效殺菌劑，以期為草莓果實病害科學防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2021年5月3日，在山東省果樹研究所金牛山試驗基地草莓大棚采集無腐爛、無病蟲害、無機械損傷的近成熟‘章姬’草莓果實，置于無菌保鮮盒內(nèi)，室溫放置。待果實自然腐爛后，進行病原菌分離。

1.2 供試藥劑

98%咪鮮胺原藥、97%氟環(huán)唑原藥，安道麥輝豐（江蘇）有限公司；95%咯菌腈原藥、96%啶酰菌胺原藥、95%己唑醇原藥、95%氟硅唑原藥，山東濰坊潤豐化工股份有限公司；96%氟吡菌酰胺原藥，拜耳股份公司；98%肟菌酯、94%腈菌唑原藥、97%苯醚甲環(huán)唑原藥、98%噻呋酰胺原藥、96%嘧菌酯原藥，山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司。

氟硅唑原藥以環(huán)己酮溶解，其它原藥以丙酮溶解，制備濃度為1%的母液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的分離純化

采用病組織分離法［4］，在腐敗草莓果實的病健交界處切取組織小塊，75%酒精浸泡30 s后，以無菌水沖洗3次，接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)3～5 d。待菌落形成后，在菌落邊緣挑取菌絲接種于新的PDA培養(yǎng)基上，進行純化。

1.4 病原菌鑒定

將純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基，25℃黑暗培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)；繼續(xù)培養(yǎng)至產(chǎn)孢后，采用光學顯微鏡觀察孢子形態(tài)。

根據(jù)柯赫氏法則進行病原菌致病力測定［5］。選擇健康無傷口的草莓果實表面消毒后，置于濃度約為1×105個／mL的病原菌孢子懸浮液中浸泡30 s后取出，瀝干水分，置于保鮮盒中，室溫存放，記錄病害癥狀。

以真菌全基因組DNA提取試劑盒提取菌絲基因組DNA，以ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物進行PCR擴增［6］。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，并采用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹［7］。

1.5 殺菌劑室內(nèi)毒力測定

采用生長速率法測定12種殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力［8］。在預試驗確定試驗濃度范圍的基礎上，對供試藥劑母液進行梯度稀釋。其中咪鮮胺濃度為0.125、0.25、0.50、1.25、2.50 mg／L，咯菌腈、啶酰菌胺和氟吡菌酰胺濃度為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00 mg／L，其余藥劑濃度為0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 mg／L。

在超凈工作臺上，采用移液器吸取1 mL各濃度藥液，加入49 mL滅菌后冷卻至50～60℃的PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻后倒板，制成含藥PDA平板，每個濃度3次重復。在活化好的菌落邊緣，以直徑7 mm的打孔器打取菌餅，菌絲朝下接種于含藥PDA平板中央。以無菌水處理為對照，25℃黑暗培養(yǎng)5～7 d。待對照組菌落長至培養(yǎng)皿1／2以上時，以十字交叉法測定菌落直徑［9］，計算各濃度藥液對菌絲生長的抑制率。采用SPSS 18.0計算毒力回歸方程和EC50值。以EC50值最高的藥劑為基準，計算其它藥劑的相對毒力指數(shù)，比較病原菌對12種供試藥劑的敏感性差異。

抑制率（%）＝（對照組菌落直徑－處理組菌落直徑）／（對照組菌落直徑－菌餅直徑）×100。

2 結果與分析

2.1 病原菌鑒定

從自然腐敗的草莓果實上分離得到多株病原菌，選取具有代表性的菌株CH－4進行鑒定。在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，菌落圓形，深棕色至褐色，菌絲致密，氣生菌絲較少（圖1）。分生孢子呈棒槌形，有縱橫分隔，分割處有縊縮（圖2）。

圖1 CH－4菌株的菌落形態(tài)

圖2 CH－4菌株的分生孢子

病原菌孢子懸浮液接種至健康草莓果實2 d后出現(xiàn)腐敗癥狀，與原發(fā)病癥狀相同（圖3）。

圖3 CH－4菌株回接癥狀

采用ITS1／ITS4通用引物對菌株rDNA－ITS序列進行PCR擴增，得到長度為543 bp的DNA序列。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，其與枝孢屬（Cladosporium）相似度最高。通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，該菌株與多主枝孢菌（Cladosporium herbarum）的親緣關系最近，結合形態(tài)學特征，將其鑒定為多主枝孢菌。

2.2 12種供試殺菌劑對多主枝孢菌的抑制率

由表1可以看出，咪鮮胺對多主枝孢菌的抑制作用最高，濃度為0.125～2.50 mg／L時抑制率為18.40%～96.79%；其次為咯菌腈、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺，濃度為0.25～5.00 mg／L時，抑制率分別為26.06%～92.58%、22.53%～86.20%和16.61%～90.62%。己唑醇、腈菌唑和氟硅唑的作用效果也較好，濃度為0.50～10.00 mg／L時，抑制率分別為25.13%～93.87%、31.27%～81.28%和20.64%～92.41%。肟菌酯、噻呋酰胺、嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑和氟環(huán)唑的抑制活性較低，濃度為0.50～10.00 mg／L時，抑制率分別為11.52%～91.98%、11.02%～80.82%、7.70%～80.14%、13.80%～75.61%和15.44%～71.55%。

表1 （續(xù)）

圖4 病原菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 12種殺菌劑對草莓果實多主枝孢菌菌絲生長的抑制率

2.3 12種殺菌劑對多主枝孢菌的室內(nèi)毒力

由表2可以看出，多主枝孢菌對咪鮮胺的敏感性最高，EC50值為0.341 mg／L，相較于氟環(huán)唑（EC50值＝3.621）的相對毒力指數(shù)為10.62。其次為咯菌腈、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺，EC50值分別為0.672、0.769、0.884 mg／L，相對毒力指數(shù)分別為5.39、4.71和4.10。己唑醇、腈菌唑和氟硅唑的抑菌活性也較高，EC50值分別為1.243、1.457、1.603 mg／L，相對毒力指數(shù)分別為2.91、2.49和2.26。肟菌酯、噻呋酰胺、嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑的抑制活性較低，EC50值分別為2.025、2.649、3.043和3.432，相對毒力指數(shù)分別為1.79、1.37、1.19和1.06。

表2 12種殺菌劑對草莓果實多主枝孢菌菌絲生長的室內(nèi)毒力

3 討論與結論

草莓屬非呼吸躍變型漿果，果實成熟后呼吸旺盛、采收后失重較快，在采摘、貯運和銷售過程中極易遭受微生物侵染而導致果肉腐敗，縮短貨架期［10］。抑制果實表面微生物的增殖是草莓采后保鮮領域的重要任務之一［11］。短波紫外線（UV－C）輻照處理能夠有效控制草莓果實貯藏期間病害的發(fā)生［12］，但儀器使用成本較高，尚不能推廣普及。近年來生物保鮮劑越來越受到關注，包括天然的或利用生物工程技術改造而獲得的生物產(chǎn)品，如植物精油等［13］，但其研究和開發(fā)尚處于起步階段［14］。

本研究從自然腐敗的草莓果實中分離鑒定出1株多主枝孢菌，與甘瑾等［15］的結果一致。魏超等［16］報道，枝孢菌屬真菌更易引起草莓軟腐。通過室內(nèi)毒力測定發(fā)現(xiàn)，分離得到的多主枝孢菌對咪鮮胺的敏感性最高，其次為咯菌腈、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺。中國農(nóng)藥信息網(wǎng)顯示，以上4種殺菌劑均已在草莓上獲得登記，其中450 g／L咪鮮胺水劑已登記可用于浸果處理，咯菌腈和氟吡菌酰胺在草莓上的安全間隔期為3 d，啶酰菌胺在草莓上的安全間隔期為7 d。

農(nóng)藥的安全間隔期是指施用后至農(nóng)藥殘留量降低到最大允許殘留量所需要的間隔時間［17］。安全間隔期越短，果品安全性越高。綜合比較12種供試殺菌劑的抑菌活性和安全間隔期，我們認為防治草莓果實采后多主枝孢菌優(yōu)先選擇咪鮮胺采前噴施或采后浸果，其次為咯菌腈和氟吡菌酰胺采前不少于3 d噴施。