應(yīng)用SSR熒光標(biāo)記法構(gòu)建山東地方桃種質(zhì)資源分子身份證

劉偉，李淼，李桂祥，董曉民，高曉蘭，張安寧

（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

桃（Prunus persica）是薔薇科桃屬的重要果樹之一，中國為桃最為重要的發(fā)源地，種質(zhì)資源豐富，類型多樣［1］，目前已在北京、南京和鄭州建立了國家級的桃種質(zhì)資源庫［2］。山東省是我國桃的重要產(chǎn)區(qū)之一，存在很多地方品種，其中最具代表性的是肥城桃、青州蜜桃、梁山蜜桃、蒙陰蜜桃等［3］。隨著我國桃育種技術(shù)的進(jìn)步，優(yōu)良桃品種的選育和推廣栽培進(jìn)展迅速，桃種質(zhì)資源的交流愈發(fā)頻繁，一些經(jīng)濟(jì)性狀良好的新品種取代了傳統(tǒng)的地方品種［4］，導(dǎo)致地方品種栽培面積急劇萎縮，種質(zhì)資源流失嚴(yán)重。而地方桃種質(zhì)資源具有突出的優(yōu)良性狀，是育種的重要基因庫，因此，為防止地方品種資源的進(jìn)一步流失，收集、鑒定、評價(jià)地方桃種質(zhì)資源成為山東省桃品種資源和育種工作的重要課題之一。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征鑒定等雖然方法簡單，但極易受環(huán)境影響，同時(shí)需要專業(yè)的背景知識，實(shí)際應(yīng)用受到很大限制。近年來，以PCR為代表的分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用，為桃種質(zhì)資源的鑒定、親緣關(guān)系的遺傳分析等提供了良好的技術(shù)手段。其中，SSR（simple sequence repeats，簡單序列重復(fù)）標(biāo)記呈現(xiàn)出多態(tài)性良好、檢測方便、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)［5］，尤其是SSR熒光標(biāo)記技術(shù)，可進(jìn)行大批量樣本的精準(zhǔn)檢測，在蘋果［6］、葡萄［7］、梨［8］等果樹的研究中發(fā)揮了重要作用。

目前，SSR熒光標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為桃屬植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系評價(jià)的重要方法之一［9－11］，但基于該項(xiàng)技術(shù)構(gòu)建山東省桃種質(zhì)資源身份證并進(jìn)行種質(zhì)鑒定的相關(guān)研究還未見報(bào)道。構(gòu)建山東地方桃種質(zhì)資源身份證，不僅有利于資源的合理利用和保護(hù)，而且能夠促進(jìn)未來育種工作的進(jìn)一步發(fā)展。因此，本研究通過篩選得到的多態(tài)性良好的10對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)對擴(kuò)增帶型進(jìn)行分析，結(jié)合帶型編碼，構(gòu)建了60份山東省桃種質(zhì)資源的分子身份證，并進(jìn)行聚類分析，旨在從分子水平對山東省桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行探討，為資源的合理保護(hù)、正確評價(jià)和科學(xué)育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年7月至2020年7月在山東省果樹研究所進(jìn)行，所用60份桃種質(zhì)材料（表1）采自山東省果樹研究所桃種質(zhì)資源圃、肥城桃園藝所及青州市、梁山縣桃產(chǎn)地。每個(gè)品種選取幼嫩莖尖葉片，迅速液氮冷凍，帶回實(shí)驗(yàn)室置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)所用桃種質(zhì)材料名稱及類型

1.2 SSR引物合成及篩選

采用HiPure Plant DNA Mini Kit（Magen）提取桃莖葉的基因組DNA，純化后克隆篩選，建立SSR富集文庫，從中開發(fā)并設(shè)計(jì)分布于桃16個(gè)連鎖群的30對引物。隨機(jī)選擇4份樣品（1，7，41和43）的總DNA，用30對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)SDS－PAGE分析擴(kuò)增條帶，篩選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的10對引物用于樣品擴(kuò)增。正向引物的5′端加1個(gè)FAM熒光標(biāo)記，所用引物均由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成（表2）。

表2 引物信息

1.3 DNA提取以及PCR體系

采用HiPure Plant DNA Mini Kit（Magen）提取樣品總DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋至50 ng·μL－1，－20℃保存?zhèn)溆谩SR－PCR反應(yīng)體系（共25μL）：ddH2O 19.3μL，dNTP（2.5 mmol·L－1）1μL，Taq酶10×Buffer 2.5μL，正、反向引物（20 μmol·L－1）各0.5μL，DNA模板1μL，Taq酶0.2 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火35 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min。

1.4 SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，將甲酰胺與分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后，取15μL加入上樣板中，再加入1μL稀釋10倍的擴(kuò)增產(chǎn)物，毛細(xì)管電泳儀ABI3730XL進(jìn)行電泳分析。待電泳結(jié)束后，利用GeneMarker中的Fragment（Plant）片段分析軟件對毛細(xì)管電泳的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)Marker的位置與各樣品峰值的位置做比較，讀取片段大小。利用POPGENE 32軟件分析數(shù)據(jù)，獲得引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)、擴(kuò)增帶型及樣品在不同SSR位點(diǎn)的基因多樣性、多態(tài)性信息含量和香農(nóng)指數(shù)。

1.5 分子身份證構(gòu)建

利用10對引物對60份樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到各樣品的指紋數(shù)據(jù)，將指紋數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字編碼，即分子身份證。轉(zhuǎn)換方法如下：將每對引物在某一樣品上擴(kuò)增出的每一種帶型用阿拉伯?dāng)?shù)字1～9編碼，為保證每一種帶型只占一位數(shù)字，當(dāng)帶型數(shù)大于9時(shí)，分別用a、b、c代表第10、11、12種帶型，依此類推，無帶用0表示；按照引物擴(kuò)增帶型數(shù)由少到多的順序，將每個(gè)樣品在10對引物上的擴(kuò)增帶型編碼串聯(lián)起來，即得到每個(gè)樣品以10位數(shù)字或字母表示的分子身份證［12］。

1.6 聚類分析

用NTSYS－pc Version 2.1軟件對SSR位點(diǎn)進(jìn)行分析，以Dice相似系數(shù)采用非加權(quán)平均法（UPGMA）對60份桃種質(zhì)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛細(xì)管電泳結(jié)果

如表3所示，利用10對SSR引物對60份桃種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測到58個(gè)等位位點(diǎn)，每對引物得到的等位位點(diǎn)在2～8個(gè)之間，平均每對引物5.8個(gè)；共擴(kuò)增得到116個(gè)帶型，每對引物得到的帶型在3～18個(gè)之間，平均每對引物11.6個(gè)，擴(kuò)增片段長度在109～270 bp之間。圖1為引物對P29對55和56號樣品的擴(kuò)增帶型分析結(jié)果。10對引物的多態(tài)性信息含量在0.2044～0.7378之間，平均為0.5699；Nei’s基因多樣性指數(shù)在0.2311～0.7692之間，平均為0.6103；香農(nóng)指數(shù)在0.3927～1.6403之間，平均為1.2266。表明10對SSR引物為高多態(tài)性引物［13］，能夠有效顯示出60份桃種質(zhì)的遺傳多樣性。

表3 10對SSR熒光引物對60份山東桃種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果

圖1 引物P29對不同樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型分析

2.2 分子身份證編碼

按照表2所示的引物順序，將每對引物在不同樣品上擴(kuò)增得到的帶型按照由少到多的順序排列并將其編碼進(jìn)行串聯(lián)，即得到60份桃種質(zhì)資源的分子身份證（表4）。對應(yīng)位置編碼相同則表明該引物在不同樣品上得到了相同的擴(kuò)增帶型。結(jié)果（表5）表明，在供試的60份山東地方桃種質(zhì)資源中，得到了44個(gè)不同類型的分子身份證代碼，其中，基地3號肥桃、基地5號肥桃、基地4號肥桃、基地7號－肥桃、基地6號－肥桃與香肥桃共享同一分子身份證代碼；肥17號、肥47、肥51－82、肥51－28與大葉白里肥桃共享同一分子身份證代碼；5311與大葉紅里肥桃共享同一分子身份證代碼；梁山蜜桃4號、梁山蜜桃3號、梁山蜜桃2號、梁山蜜桃1號分子身份證代碼相同；中華壽桃和寒露蜜分子身份證代碼相同；珍品王桃和蓬仙15分子身份證代碼相同；秋彤和肥39分子身份證代碼相同，但這兩個(gè)品種有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。通過分子身份證代碼，將供試的60份山東地方桃種質(zhì)進(jìn)行了合理的區(qū)分。

表4 10對SSR引物的擴(kuò)增帶型

表5 供試60份桃種質(zhì)的分子身份證代碼

2.3 聚類分析

根據(jù)10對SSR引物對60份山東桃種質(zhì)的擴(kuò)增數(shù)據(jù)，以Dice相似系數(shù)采用UPGMA聚類，得到桃系統(tǒng)關(guān)系樹，如圖2所示。可以發(fā)現(xiàn)，在遺傳相似系數(shù)為0.46時(shí)，可以將60份山東地方桃種質(zhì)資源分為5組：第Ⅰ組包括3個(gè)品種，分別為1、2號和32號；第Ⅱ組24個(gè)品種，包含17個(gè)肥城桃品種，并聚為一支，其中，19、20、21、22、23、30號親緣關(guān)系較近，24、29、31、35號親緣關(guān)系較近，26、27、33號親緣關(guān)系較近，說明肥城桃群體基因組相對保守，受外來品種基因組滲入影響較??；第Ⅲ組包含9個(gè)桃品種，分別是4、6、40、16、17、54、39、38、36號，其中，4號和6號親緣關(guān)系較近，16號和17號親緣關(guān)系較近；第Ⅳ組包含22個(gè)桃品種，其中，48、49、50、51、52、53、55、57號為8個(gè)美國遺傳背景的桃品種，與山東本地桃背景相差較大，區(qū)分明顯；第Ⅴ組包含2個(gè)品種，分別是25號和56號，這兩個(gè)品種可能存在其他基因組的滲入，與其他桃品種相差較大?？梢?，聚類分析結(jié)果與分子身份證代碼分析結(jié)果相符，共享同一分子身份證代碼的品種在系統(tǒng)關(guān)系樹中遺傳相似系數(shù)相同。

圖2 基于10對SSR引物的60份山東桃種質(zhì)聚類分析結(jié)果

3 討論

SSR標(biāo)記技術(shù)兼顧高準(zhǔn)確性和高穩(wěn)定性。目前，SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測主要有銀染技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)2種，銀染技術(shù)分析效率較低，無法進(jìn)行批量操作，且有害人體健康；熒光標(biāo)記技術(shù)解決了銀染技術(shù)存在的種種問題，更適合多樣本操作，同時(shí)具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。郝晨陽等［14］對銀染技術(shù)和SSR熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)對比，證實(shí)SSR熒光標(biāo)記技術(shù)處理效率更高，更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。魯敏等［15］對40份梨種質(zhì)資源的研究也表明，SSR熒光標(biāo)記技術(shù)得到的數(shù)據(jù)重復(fù)性和準(zhǔn)確性均較高。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，SSR熒光標(biāo)記技術(shù)能夠準(zhǔn)確高效地對擴(kuò)增帶型進(jìn)行大小判別。

近年來，桃種質(zhì)資源的SSR引物數(shù)量增長迅速［16］；盡管桃基因組相應(yīng)染色體上都標(biāo)記有大量的SSR位點(diǎn)信息，但實(shí)際研究中可用的SSR數(shù)量仍然較少，因此，相應(yīng)研究將有助于桃目的基因定位、種質(zhì)資源鑒定以及遺傳進(jìn)化等課題的開展［17］。葉宇蕓等［18］通過NCBI數(shù)據(jù)庫的ESTs信息開發(fā)了20對SSR引物，并用于對成都平原主栽的40份桃種質(zhì)進(jìn)行分子身份證構(gòu)建，得到平均等位基因數(shù)3.4個(gè)；李雄偉等［19］通過48個(gè)SSR標(biāo)記對國內(nèi)外669份桃品系的遺傳多樣性進(jìn)行分析，篩選出16個(gè)多態(tài)性高的標(biāo)記，可用于構(gòu)建基于SSR分子標(biāo)記的桃種質(zhì)分子指紋數(shù)據(jù)庫；陳霽等［20］利用16對SSR引物對42份觀賞桃品種進(jìn)行擴(kuò)增，得到平均等位基因數(shù)7.75個(gè)。本研究通過10對SSR引物構(gòu)建了60份山東桃種質(zhì)的分子身份證，共檢測得到58個(gè)SSR等位位點(diǎn)和116個(gè)擴(kuò)增帶型，平均每對引物得到SSR等位位點(diǎn)5.8個(gè)，擴(kuò)增帶型11.6個(gè)。

通常認(rèn)為，當(dāng)位點(diǎn)多態(tài)性信息含量＞0.5時(shí)，該引物即為高度多態(tài)性信息引物［21］。本研究中，10對SSR引物平均多態(tài)性信息含量為0.5699，其中多態(tài)性信息含量大于0.5的有8對，占比80%，充分說明本研究所采用的SSR引物多態(tài)性較高，能夠有效地對60份山東桃種質(zhì)進(jìn)行鑒定。原因可能有兩點(diǎn)：第一，本研究所用引物是從30對引物中二次篩選而來；第二，供試材料自身具備豐富的遺傳多樣性，從而使得引物的多態(tài)性信息含量升高。

迄今為止，SSR指紋圖譜的研究結(jié)果通常以分子身份證［22］和品種聚類圖［23］的形式呈現(xiàn)，二者各有特點(diǎn)。分子身份證是由品種指紋圖譜數(shù)據(jù)抽象化而來，無法直觀顯示品種間的指紋信息；品種聚類圖只能夠通過遺傳相似系數(shù)呈現(xiàn)品種之間遺傳距離的遠(yuǎn)近，不能將品種區(qū)分開，也不能顯示SSR多樣性信息。本研究綜合采用了分子身份證和品種聚類圖兩種形式，有效規(guī)避了兩種形式的不足，兩種形式所得結(jié)果一致，即共享同一分子身份證代碼的品種在系統(tǒng)關(guān)系樹中也具有相同的遺傳相似系數(shù)。

不同研究采用的分子身份證構(gòu)建方法亦有不同［24，25］，本研究采用的是數(shù)字（0～9）和字母（26個(gè)小寫英文字母）相結(jié)合的方式，通過將引物擴(kuò)增的帶型按照由小到大的順序排列并進(jìn)行編碼，得到各品種的分子身份證代碼。本研究選取的10對SSR引物平均多態(tài)性信息含量為0.5699，具備良好的多態(tài)性，其中多態(tài)性信息含量數(shù)值高于平均值的有8對，理論上能夠區(qū)分836個(gè)桃種質(zhì)資源。本研究選取的60份山東桃種質(zhì)均得到了合理的區(qū)分，得到的分子身份證信息可用于品種資源的鑒定和分類。

地方種質(zhì)資源往往蘊(yùn)含著高產(chǎn)、抗逆等優(yōu)良性狀，全面研究山東地方桃種質(zhì)資源遺傳多樣性還需要進(jìn)一步擴(kuò)大地方桃種質(zhì)資源的樣品，同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)等技術(shù)，多角度、多層面系統(tǒng)研究地方品種的遺傳關(guān)系，從而為正確評價(jià)山東地方桃種質(zhì)資源創(chuàng)新和育種實(shí)踐提供理論支持。此外，隨著人類活動和自然環(huán)境的影響，越來越多的桃種質(zhì)資源遭到破壞甚至滅絕，因此，對山東地方桃種質(zhì)資源進(jìn)行廣泛而有效地收集、保護(hù)、評價(jià)和利用已成為一項(xiàng)比較緊迫的任務(wù)。本研究初步構(gòu)建了60份山東桃種質(zhì)的分子身份證，今后將納入更多種質(zhì)進(jìn)一步完善山東地方桃種質(zhì)資源庫。

4 結(jié)論

本研究采用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)構(gòu)建了60份山東桃種質(zhì)的分子身份證，得到的SSR引物具備較高的多態(tài)性信息，將有助于山東地方桃品種資源的鑒定、遺傳多樣性評價(jià)、親緣關(guān)系分析等各項(xiàng)研究工作的順利開展。