復(fù)合感染膿毒癥大鼠模型的構(gòu)建和評價

段爽,朱瑛,趙茹茹,侯媛璐,李明泓,3,林青,李奇峰,3*

(1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,昆明 650500;2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室,昆明 650500;3. 云南省高校中醫(yī)治法與中藥藥效關(guān)系研究科技創(chuàng)新團隊,昆明 650500)

膿毒癥是由于嚴重感染引起機體過度反應(yīng)而出現(xiàn)危機生命的多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[1-2]。這一定義凸顯了感染是膿毒癥的明確誘因,而MODS是膿毒癥的重要病理特征,也是膿毒癥不良結(jié)局的決定性因素。由于缺乏有效治療藥物,僅我國嚴重膿毒癥患者病死率高達50%,每年的醫(yī)療費約為46億美元[3-5],由此造成沉重經(jīng)濟和社會負擔(dān)。缺乏穩(wěn)定、貼近臨床的動物模型,使膿毒癥病理生理學(xué)和相關(guān)藥物研究受到較大限制[6-7]。歷經(jīng)數(shù)十年的膿毒癥藥物研發(fā),均以失敗告終。因此,建立穩(wěn)定能夠高度模擬人類膿毒癥病理生理過程的膿毒癥動物模型對膿毒癥研究至關(guān)重要。目前盲腸結(jié)扎穿刺(cecum ligation and puncture,CLP)動物模型是膿毒癥研究的經(jīng)典模型,因具有血流動力學(xué)、代謝過程、炎癥反應(yīng)階段等與人類膿毒癥類似的臨床表現(xiàn)。然而,良好的膿毒癥動物模型除需模擬人類膿毒癥的臨床表現(xiàn),還需能夠模擬人類膿毒癥的病程發(fā)展。但實踐中發(fā)現(xiàn),經(jīng)典CLP模型膿毒癥大鼠由感染造成腸道水腫并封堵盲腸穿刺結(jié)扎部位,此過程會受到諸多因素的影響并隨機發(fā)生,導(dǎo)致部分模型動物的感染過程延緩或終止,進而造成相同造模條件下的模型動物差異性大的結(jié)果[8-11]。此外,考察藥物對膿毒癥的影響,如不能排除CLP模型腸道隨機封堵穿刺結(jié)扎部位的問題,就很難確認藥物的實際效用。據(jù)此,本研究以CLP模型為基礎(chǔ),著力解決CLP模型因水腫腸道封堵結(jié)扎穿刺部位隨機影響模型動物感染進程的問題,探索通過復(fù)合感染支架整合盲腸結(jié)扎穿刺法和植入帶菌物法,建立感染可持續(xù)的膿毒癥動物模型,即復(fù)合感染膿毒癥模型(multiple infect model,MIM)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

54只8周齡SPF級雄性SD大鼠,體重(230 ± 20)g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】,于采光通風(fēng)良好,溫度20 ~ 26℃,相對濕度42% ~ 62%的室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d后進行實驗,飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物部【SYXK(滇)K2017-0005】。隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、盲腸穿刺結(jié)扎組(CLP組)、復(fù)合感染模型組(MIM組)每組各18只,以上各組再隨機分為生存率組每組10只和實驗組每組8只。研究流程均符合云南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會要求(R-062021135)。

1.1.2 主要試劑與儀器

10%鼠糞混懸液(10 g大鼠新鮮糞便 + 0.02 g連二亞硫酸鈉+90 mL生理鹽水,600 r/min離心10 min,取上清,-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)試劑盒(泉州睿信,20210720);白介素-6(interleukin6,IL-6)試劑盒(泉州睿信,20210809);乳酸(lactic acid,Lac)試劑盒(南京建成,20210707);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒(南京建成,20210524);天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)試劑盒(南京建成,20210518);心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponinI,cTn-I)試劑盒(Elabscience,20210806);肌酐(creatinine,Cr)試劑盒(南京建成,20210708);總膽紅素(total bilirubin,TBil)試劑盒(南京建成,20210730);丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(南京建成,20210702);腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)試劑盒(碧云天,012521210621);抗凝劑(康衛(wèi)仕,20201012)。

冰凍切片機*/MEV(萊比信,中國);包埋儀1100 mm × 500 mm × 380 mm/YD-6L(益迪醫(yī)療,中國);玻片掃描影像系統(tǒng)TeksqraySQS-1000(eksqray,中國);多功能酶標儀InfiniteM200PR0(TECAN,瑞士)。

1.1.3 主要器材和設(shè)備

復(fù)合感染支架(自制參見圖1),通過復(fù)合感染支架整合盲腸結(jié)扎穿刺法和植入帶菌物法。盲腸穿刺部位固定于支架通孔一側(cè),輔助以通孔處呈均勻分布的突起,二者協(xié)同可阻礙水腫腸道封堵盲腸結(jié)扎穿刺部位;其次通過向固定在支架上的棉球滴加糞便提取液,干擾遠端水腫腸道對盲腸結(jié)扎部位的封堵。最終達到建立穩(wěn)定而可持續(xù)感染的膿毒癥動物模型的目的。

圖1 復(fù)合感染支架圖Figure 1 Multiple infect model stent diagram

1.2 方法

1.2.1 模型制作

術(shù)前14 h禁食不禁水。麻醉滿意后腹部中下部鋪放洞巾,75%乙醇消毒,從尿道口上1 cm處沿腹中線切開約2.5 cm縱行切口,用鈍性無菌解剖鑷探查腹腔,暴露盲腸,避開血管分離腸系膜,距盲腸末端1 cm處用3/0型號手術(shù)縫合線結(jié)扎,將結(jié)扎部固定于復(fù)合感染模型支架中心部位,然后輕提起結(jié)扎盲腸,用21 G針在結(jié)扎部位從上向下螺旋狀穿刺三針六孔,每針旋轉(zhuǎn)30°,兩針之間上下間隔約3 mm。穿刺盲腸擠出少量糞便,用消毒簽擦去擠出的糞便。在復(fù)合感染支架預(yù)先固定的兩個0.03 g棉花上各滴加10%鼠糞混懸液0.3 mL。輕提腹腔切口,將復(fù)合感染支架放入腹腔并盡量至于腹腔底部。最后逐層縫合切口。將術(shù)后大鼠置于籠中直至麻醉蘇醒,正常飼養(yǎng)。所有動物手術(shù)在20 min內(nèi)完成,保持一致性。CLP組:不安放復(fù)合感染支架和滴加鼠糞混懸液,其余同MIM組。Sham組:僅暴露盲腸,其余同MIM組。操作過程如圖2所示。

圖2 建立復(fù)合感染模型步驟Figure 2 Steps to establish a multiple infection model

1.2.2 生存率實驗

每隔2 h觀察,連續(xù)觀察96 h各組大鼠是否出現(xiàn)嗜睡、少動、豎毛、蜷縮、食欲減退;眼睛和口鼻是否有分泌物;上述癥狀是否隨時間發(fā)展癥狀加劇;死前是否出現(xiàn)顫抖、全身僵化、呼吸不暢;動物開腹后檢查盲腸結(jié)扎穿刺部位封堵情況,觀察是否有混濁滲出液,腸道腫脹粘連程度,臟器是否有瘀血。記錄各組大鼠死亡時間。

1.2.3 炎癥和MODS損傷指標檢測

生存率實驗中MIM組大鼠在術(shù)后17.5 h首先出現(xiàn)死亡,因此大鼠統(tǒng)一在17.5 h麻醉腹主動脈取血,用枸櫞酸鈉抗凝,經(jīng)2500 r/mim離心10 min后血漿樣本按照說明書檢測LPS、IL-6、MDA、Lac、ALT、AST、cTn-I、Cr、TBil、ATP的含量。取肝組織測定MDA和ATP含量。

1.2.4 HE染色形態(tài)學(xué)檢查

取新鮮的臟器組織置于4%多聚甲醛中固定,依次進行HE染色步驟后通過玻片掃描保存分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

收集并整理數(shù)據(jù),以平均值 ± 標準差(±s)表示。使用SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,使用Graph Pad Prism 8.0.1進行圖像制作。組間比較采用方差分析,生存研究采用log-rank檢驗。統(tǒng)計標準為:P< 0.05有統(tǒng)計學(xué)意義,P< 0.01具有顯著性差異,P< 0.001極具顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

Sham組:所有大鼠術(shù)后4 h左右全部麻醉蘇醒,醒后能自由活動、正常進食飲水、沒有嗜睡及蜷縮狀態(tài),受刺激后有規(guī)避動作、行動速度稍慢、眼角和鼻尖沒有分泌物,無明顯不良癥狀。術(shù)后12 h左右已經(jīng)有9只大鼠運動速度恢復(fù)正常。96 h解剖未發(fā)現(xiàn)腹腔滲出液、腸管擴張和臟器肉眼觀察無明顯損傷。

CLP組:所有大鼠術(shù)后4 h左右全部麻醉蘇醒,12 h左右所有大鼠開始出現(xiàn)嗜睡、進食減少、精神狀態(tài)不佳、行動緩慢、蜷縮抱團、鼻尖有少量分泌物、尿量減少。22 h后3只大鼠開始出現(xiàn)寒戰(zhàn)、呼吸困難、死亡。36 h后存活大鼠癥狀逐步改善。死亡大鼠解剖可見:盲腸結(jié)扎部位未能完全封堵,穿刺針孔明顯,盲腸結(jié)扎部位呈暗紅色,腹腔有渾濁腹水,腸道粘連,空腸充氣。心臟、肝、肺等臟器瘀血明顯。而存活大鼠96 h解剖可見盲腸結(jié)扎部位被水腫腸道嚴密封堵,盲腸結(jié)扎部位與周圍腸道較難分離,盲腸末端變灰綠色。腹腔有較少或無清澈腹水,腸道腫脹粘連程度較死亡鼠大幅減輕,心臟、肝、肺和腎未見瘀血。

MIM組:所有大鼠術(shù)后4 h左右全部麻醉蘇醒,8 h后所有大鼠開始出現(xiàn)嗜睡、無進食、精神狀態(tài)不佳、行動緩慢、蜷縮抱團、豎毛、鼻尖有分泌物、尿量減少;大約12 h后癥狀逐步顯著,眼角出現(xiàn)紅色分泌物,腹脹明顯。16 h后陸續(xù)有大鼠出現(xiàn)明顯寒戰(zhàn)和呼吸困難、有瀕死感。27 h后全部死亡。打開腹腔可見盲腸結(jié)扎部位盲腸結(jié)扎部位未被完全包裹,穿刺針孔明顯,盲腸結(jié)扎部位呈暗紅色,腹腔有渾濁或血性腹水,腸道粘連,空腸充氣。心臟、肝、肺、腎等多個臟器瘀血明顯。

2.2 生存率實驗結(jié)果

觀察改良CLP模型造模96 h期間大鼠生存狀況并記錄死亡時間(見圖3)。術(shù)后96 h,Sham組大鼠生存率100%,CLP組大鼠生存率70%,術(shù)后22.5 h,CLP組首只大鼠出現(xiàn)死亡,其中3只死亡時間集中在(29 ± 7)h期間,其余存活。MIM組生存率0%,術(shù)后17.5 h MIM組首只大鼠出現(xiàn)死亡,死亡時間集中在(22 ± 5)h期間。從死亡時間柱狀圖可知,與Sham組相比,CLP組無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05),而MIM組統(tǒng)計意義極顯著(P< 0.001)。大鼠生存時間與放置復(fù)合感染支架密切相關(guān)。

圖3 造模后各組生存曲線及死亡時間柱狀圖(n = 10)Note. Compared with the Sham group and the MIM group, ***P < 0.001.Figure 3 Survival curve and death time histogram of each group after molding(n = 10)

2.3 血清中炎癥指標和器官損傷指標變化

通過前期生存率實驗結(jié)果,對造模17.5 h后大鼠進行LPS、IL-6、MDA、cTn-I、ALT、AST、TBil、Cr、Lac和ATP指標檢測。組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。結(jié)果知:LPS、IL-6、MDA、cTn-I、ALT、AST、TBil、Cr和Lac的含量Sham組較低,CLP組和MIM組顯著升高,MIM組最高。ATP含量Sham組最高,而CLP組和MIM組顯著降低,MIM組最低(見圖4)。

圖4 造模17.5 h后各組指標的變化水平(n = 8)Note. A. Comparison of LPS content between groups. B. Comparison of IL-6 content between groups. C. Comparison of MDA content between groups. D. Comparison of cTn-I content between groups. E. Comparison of ALT content between groups. F. Comparison of AST content between groups. G. Comparison of TBil content between groups. H. Comparison of Cr content between groups. I. Comparison of Lac content between groups. J. Comparison of ATP content between groups. Compared with the Sham group and the MIM group.*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001.Figure 4 Level of change of indicators in each group after 17.5 h of molding(n = 8)

從各組變異系數(shù)對比表可看出,MIM組內(nèi)反映感染與炎癥的模型關(guān)鍵指標(LPS、IL-6、MDA)變異性遠低于CLP組,且大部分指標變異性均較CLP組更小(見表1)。

表1 造模17.5 h后各組變異系數(shù)對比表( ± s)Table 1 Comparison table of coefficients of variation of each group after 17.5 h of mold making( ± s)

表1 造模17.5 h后各組變異系數(shù)對比表( ± s)Table 1 Comparison table of coefficients of variation of each group after 17.5 h of mold making( ± s)

2.4 大鼠HE染色觀察臟器組織病理學(xué)結(jié)果

心臟:Sham組無炎性細胞浸潤,心肌細胞排列整齊,心肌纖維結(jié)構(gòu)完整無斷裂,心肌橫紋清晰,血管結(jié)構(gòu)完整,無擴張及充血;CLP組有炎性細胞浸潤,心肌細胞排列紊亂,心肌橫紋模糊,細胞質(zhì)空泡化增加,部分區(qū)域出現(xiàn)間質(zhì)水腫,毛細血管擴張;MIM組可見大量炎性細胞浸潤,心肌纖維變性、壞死、心肌橫紋幾乎消失,可見細胞核固縮或溶解,毛細血管明顯擴張充血,周圍有紅細胞滲出,部分區(qū)域呈凝固型壞死改變。

肝:Sham組匯管區(qū)未見炎癥性細胞浸潤,肝小葉和肝細胞形態(tài)正常;CLP組有炎性細胞浸潤,肝竇擴張,肝細胞水腫,細胞核腫脹,氣球樣變性明顯;MIM組有大量炎性細胞浸潤,細胞邊界不清,細胞廣泛水腫,部分細胞出現(xiàn)凋亡小體,細胞核碎裂、溶解,中央?yún)R管區(qū)可見肝細胞出血性壞死。肝竇擴張,肝索結(jié)構(gòu)紊亂,肝小葉結(jié)構(gòu)不清,可見大量紅細胞滲出。

肺:Sham組未見明顯炎性細胞浸潤,肺組織平整無皺褶,結(jié)構(gòu)正常,肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄;CLP組出現(xiàn)炎性細胞浸潤,部分肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞,肺泡周圍血管腔擴張,肺泡擴張融合,肺泡數(shù)目變少且變大,纖維間隔增厚;MIM組出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤,肺泡壁明顯增厚,肺間隔明顯增厚,肺泡塌陷,部分肺泡腔及呼吸性支氣管內(nèi)出血,毛細血管變少且畸形,大量紅細胞滲出。

腎:Sham組未見明顯炎性細胞浸潤,腎小球結(jié)構(gòu)正常,腎小管管腔完整齊;CLP組可見腎皮質(zhì)及間質(zhì)有大量炎性細胞浸潤,并可見腎小球萎縮、腎小管上皮細胞水腫、空泡變性;MIM組出可見大量炎性細胞浸潤,腎小球及基底膜萎縮、球囊間隙明顯增寬,腎小球毛細血管擴張及充血,大量紅細胞外滲出,上皮細胞水腫,空泡變性。腎小管壁增厚、血管腔接近閉塞。遠曲小管及收集管內(nèi)可見紅細胞(見圖5)。

圖5 造模17.5 h后臟器組織HE染色結(jié)果(n = 8)Figure 5 HE staining results of posterior organ tissues 17.5 h after molding(n = 8)

3 討論

膿毒癥是宿主對感染功能失調(diào)反應(yīng)引起的危急生命的多器官功能障礙綜合征[1],是當(dāng)代重癥醫(yī)學(xué)研究的焦點和難點。建立穩(wěn)定且可較好模擬膿毒癥臨床復(fù)雜病理生理過程的動物模型,無疑是膿毒癥病理生理機制研究和治療藥物篩選的基礎(chǔ)。

注射內(nèi)毒素和植入活菌培養(yǎng)物膿毒癥模型可控制感染劑量,穩(wěn)定性和重復(fù)性好。但二者僅是對實驗動物的急性一次性打擊,無法模擬臨床患者存在的感染灶持續(xù)性地釋放病菌和內(nèi)毒素過程。此外基于注射內(nèi)毒素模型開發(fā)的藥物在臨床上并未顯示出有益效果,這提示模型與臨床有較大差距。CLP模型通過盲腸結(jié)扎穿刺,破壞腸道屏障,引起腸內(nèi)菌群持續(xù)性釋放,模型動物病情不斷發(fā)展,具有更好的臨床相關(guān)性[12-13]。但實際操作中如果盲腸結(jié)扎部位稍長、穿刺針孔過大、過多,容易導(dǎo)致動物死于急性損傷,與感染導(dǎo)致機體過度反應(yīng)的本質(zhì)不符;而如果結(jié)扎部位稍短、穿刺較少,又容易出現(xiàn)水腫腸道隨機封堵盲腸結(jié)扎穿刺部位,表現(xiàn)為:(1)有的動物不能有效封堵盲腸結(jié)扎穿刺部位,病情不斷發(fā)展至死亡;(2)有的動物部分封堵減少一定腸道菌群釋放,生存周期大幅延長;(3)有的動物全面有效封堵,病情不再發(fā)展長久存活。由此造成模型動物組間變異性大,進而干擾膿毒癥機制研究和藥物效果評價。針對CLP模型的弊端,有學(xué)者做出積極有益的探索[14],如通過靜脈采血針套管呈“十”字型固定于盲腸結(jié)扎穿刺部位,以阻礙水腫腸道對盲腸結(jié)扎穿刺部位的封堵,并能造成較CLP模型更為嚴重的炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙。但筆者重復(fù)該模型發(fā)現(xiàn),該模型仍不能完全避免結(jié)扎盲腸被封堵問題,且模型動物死亡時間不均一,模型動物有相當(dāng)?shù)拇婊盥省?/p>

本實驗著力解決CLP模型水腫腸道封堵盲腸結(jié)扎部位影響感染進程這一核心問題通過在復(fù)合感染支架頭部棉球滴加鼠糞混懸液,干擾腸道對盲腸結(jié)扎部位的封堵;通過植入復(fù)合感染支架可物理隔絕水腫的腸道對盲腸結(jié)扎穿刺部位封堵;最后通過螺旋均勻的穿刺方法能夠在發(fā)生封堵的情況下,腸道也很難對盲腸結(jié)扎部位完全封堵。實現(xiàn)MIM模型能夠始終存在持續(xù)感染源的目的。本模型亦可手術(shù)切除結(jié)扎盲腸,將包裹特定細菌的膜性小囊穿刺后固定于復(fù)合感染支架中心孔上,在棉球上滴加同種細菌,進而開展特定細菌導(dǎo)致膿毒癥發(fā)展的機制研究,如革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌致膿毒癥差異研究。這是傳統(tǒng)CLP模型不易實現(xiàn)的。

判斷動物模型有效性可從結(jié)構(gòu)效度和表面效度兩方面評價,結(jié)構(gòu)效度是理論基礎(chǔ)。臨床上膿毒癥患者一般體內(nèi)存在感染病灶,感染灶持續(xù)性地釋放病菌和內(nèi)毒素,從而引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮損傷、循環(huán)狀態(tài)改變、能量代謝低下和器官功能障礙等病理生理改變[15-17],伴有劇烈炎癥反應(yīng)和嚴重器官損傷癥狀[18-20]。本模型實驗動物為SPF級大鼠,其同批大鼠本身無明顯感染與炎癥,因此MIM模型鼠的LPS、IL-6、MDA等指標的組內(nèi)變異系數(shù)較小可直接反映該模型的感染與炎癥進程更為一致。此外LPS、IL-6、MDA指標反映MIM模型較CLP模型感染、炎癥反應(yīng)更為強烈;cTn-I、AST、ALT、TBil、Cr、Lac和ATP等指標說明MIM模型較CLP模型更能造成心臟、肝、腎多器官功能障礙[21-23],并伴隨能量代謝低下。HE染色結(jié)果也表明造成嚴重的器官損傷。因此MIM模型的結(jié)構(gòu)效度更好。表面效度是動物模型表現(xiàn)癥狀與人類自然發(fā)展的相似性。臨床膿毒癥最常見癥狀有疲勞、呼吸短促和精神狀態(tài)改變等[24]。大鼠有嗜睡、無進食、精神狀態(tài)不佳、行動緩慢、蜷縮抱團、豎毛等表現(xiàn)可作為類似臨床膿毒癥的表現(xiàn)。MIM模型大鼠集中出現(xiàn)類似宏觀病理表現(xiàn)。因此MIM模型的表面效度更好。

綜上,本研究顯示放置滴加糞便的復(fù)合感染支架,能夠?qū)崿F(xiàn)膿毒癥模型核心要求的持續(xù)感染,還可人為決定注射感染源種類,實現(xiàn)復(fù)合感染,更貼近膿毒癥因感染引發(fā)的發(fā)病機制。該模型的動物死亡時間較CLP模型更為集中,多器官高度損傷,且感染與炎癥進程更為統(tǒng)一,因此有利于開展膿毒癥病理生理和藥效評價等相關(guān)研究。但此模型需開較大切口放置復(fù)合感染支架,易致實驗數(shù)據(jù)偏倚且主觀控制盲腸結(jié)扎長度在實際操作中有誤差,加之沒有做血流動力學(xué)相關(guān)指標,可能與臨床實際有一定出入。此次改良模型方法可為今后膿毒癥模型提供借鑒意義,并在此基礎(chǔ)上繼續(xù)改良創(chuàng)新。