超濾法結(jié)合HPLC測定連翹苷的血漿蛋白結(jié)合率

杜春潔，朱麒臻，郝 季，王 巍

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

連翹苷(phillyrin，PHI)作為連翹質(zhì)控指標之一，是一種具有廣闊應用前景的活性物質(zhì)，具有良好的抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降脂、止吐等藥理活性[1-4]。目前關于連翹苷在體內(nèi)吸收、分布、代謝及排泄規(guī)律研究證實其在大鼠體內(nèi)的藥代動力學屬于一級動力學，是一個快速分布，緩慢消除的過程[5]。在心、腦、脾、肺、肝、腎、小腸、大腸中均有所分布，其中心、肺中含量較低，小腸，腎中含量較高。有學者對小腸和腦的吸收機制進行深入研究，表明連翹苷在胃腸道吸收主要是被動擴散，透過血腦屏障為被動擴散結(jié)合主動轉(zhuǎn)運，但吸收率均較低[6]。連翹苷在大鼠體內(nèi)發(fā)生的主要生物反應有氫化、甲基化、羥基化、葡糖醛酸化、磺化、羰基化、氨化、脫氫、脫甲基、環(huán)斷裂及其復合反應，代謝產(chǎn)物高達60種[7]。

除上述吸收、分布、代謝及排泄規(guī)律之外，血漿蛋白結(jié)合率也是藥動學的重要參數(shù)之一，由于游離型藥物濃度的大小與作用強度密切相關[8]，因此其會影響藥物在體內(nèi)的吸收代謝，對于新藥研發(fā)具有重要的指導意義。鑒于目前尚無關于連翹苷血漿蛋白結(jié)合率研究的相關報道，本實驗擬采用超濾法截留與血漿蛋白結(jié)合后的大分子藥物，通過測定游離型藥物濃度計算連翹苷的血漿蛋白結(jié)合率，為連翹苷新藥開發(fā)提供臨床前藥動學參數(shù)。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Agilent 1100型高效液相色譜儀,美國安捷倫科技公司；FA1004B型分析天平,上海精密科學儀器有限公司；Kylin-Bell漩渦混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司；3k15型高速冷凍離心機,德國sigma公司；10 kDa Millipore超濾離心管,上海未熹生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

連翹苷對照品，大連美侖生物技術有限公司(批號：A0426AS)；連翹苷，實驗室自制(純度98%以上)；肝素鈉,大連美侖生物技術有限公司(批號：A1208A)；甲醇為色譜醇,天津市凱信化學工業(yè)有限公司；水為超純水；磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉、氯化鈉，天津科密歐化學試劑有限公司(均為分析純)。

1.3 動 物

SPF級SD大鼠(購自于遼寧長生生物技術股份有限公司，動物許可證號：SCXK(遼)2020-001)雄性，體重(130～160 g)，適應性飼養(yǎng)一周后，取健康大鼠5只，眼眶靜脈取血，置于肝素鈉抗凝EP管中，靜置30 min后，以3000 r/min離心15 min，取上層血漿置于-20 ℃冰箱冷凍貯存，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ecosil-EC C18(4.6×150 mm，5 μm)，流動相：甲醇-水(55:45)；流速：1 mL/min，檢測波長：277 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：20 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 PBS溶液的配制

取磷酸二氫鈉0.52 g，磷酸氫二鈉4.757 g，氯化鈉1.1 g，加水至250 mL，即得pH 7.4的等滲磷酸鹽緩沖溶液。

2.2.2 對照品溶液的配制

精密稱取連翹苷對照品1 mg，置10 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的對照品貯備液，于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 連翹苷樣品溶液的配制

精密稱取連翹苷對照品10 mg，置10 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的連翹苷樣品貯備液，于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 專屬性考察

取大鼠空白血漿400 μL，置于超濾管中，4℃條件下，8000 r/min離心15 min，制成大鼠空白血漿超濾液，另取“2.2.3”項下的連翹苷樣品溶液60 μL加入大鼠空白血漿 540 μL，渦旋混勻，37 ℃孵育2 h，取400 μL超濾離心，制備成供試品溶液，取大鼠空白血漿超濾液與對照品溶液、供試品溶液各20 μL，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，連翹苷保留時間在4.3 min左右，與其他組分分離度良好，空白基質(zhì)無干擾，表明該方法具有良好的專屬性，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

2.4 標準曲線與定量限

精密吸取連翹苷對照品貯備液適量，加入PBS溶液依次稀釋成質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1，2，5，10，20，50 μg/mL的連翹苷系列對照品溶液，取系列對照品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以連翹苷對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，連翹苷峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線，得到連翹苷的回歸方程為Y=11.585X+6.827 5(0.9996)，結(jié)果表明，連翹苷在0.2～50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系，以信噪比10:1對應濃度作為定量限，該方法線性范圍最低濃度即為定量限。

2.5 精密度試驗

精密吸取連翹苷樣品貯備液適量，PBS溶液進行稀釋，分別制備成低、中、高(1，5，20 μg/mL)不同質(zhì)量濃度的連翹苷樣品溶液，取20 μL進樣測定，以一日內(nèi)測定5次測得的峰面積計算日內(nèi)精密度，以連續(xù)測定3 d測得的峰面積計算日間精密度，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，連翹苷日內(nèi)及日間精密度RSD值均小于3%，符合方法學測定要求。

表1 精密度試驗結(jié)果(n=5)Table 1 Precision test results(n=5)

2.6 超濾膜回收率試驗

精密吸取“2.2.3”項下的連翹苷樣品貯備液適量，PBS溶液進行稀釋，制備成質(zhì)量濃度為100，200，400 μg/mL的連翹苷樣品溶液，依次取上述溶液60 μL加入540 μL的PBS溶液，渦旋混勻，即得10，20，40 μg/mL的連翹苷樣品溶液，取400 μL置于超濾管中，于4 ℃條件下，8000 r/min離心 15 min，即得不同質(zhì)量濃度的超濾液，取超濾液20 μL按照上述色譜條件進樣分析，測定連翹苷超濾液的濃度，計算相對回收率(超濾膜回收率=超濾液濃度/超濾前濃度×100%)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，超濾膜回收率均可達90%以上，連翹苷對超濾膜無特異性吸附。

表2 超濾膜回收率試驗結(jié)果Table 2 Ultrafiltration membrane recovery test

2.7 穩(wěn)定性試驗

取質(zhì)量濃度為100，200，400 μg/mL的連翹苷樣品溶液 60 μL，加入大鼠空白血漿540 μL，即得濃度為10，20， 40 μg/mL的連翹苷血漿樣品溶液，渦旋混勻，37 ℃水浴孵育2 h，吸取400 μL置于超濾膜中離心取超濾液，室溫下放置2，4，8，12，24 h后，按上述色譜條件進樣分析，根據(jù)峰面積值計算穩(wěn)定性，結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)RSD值分別為1.8%，1.7%，0.8%，符合生物樣品測定要求。

2.8 血漿蛋白結(jié)合率試驗

取連翹苷樣品貯備液適量，用PBS稀釋成質(zhì)量濃度為100，200，400 μg/mL的連翹苷樣品溶液，精密吸取上述三種樣品溶液60 μL置于1.5 mLEP管內(nèi)，另外加入空白血漿540 μL，制得質(zhì)量濃度為10，20，40 μg/mL的連翹苷血漿樣品溶液，渦旋混勻，于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育2 h，取血漿樣品400 μL置于超濾管中，4 ℃條件下，8000 r/min離心15 min，得不同質(zhì)量濃度的血漿超濾液，取20 μL進樣，按照“2.1”項下色譜條件測定超濾液中連翹苷供試品溶液濃度，計算血漿蛋白結(jié)合率，結(jié)果見表3。

(血漿蛋白結(jié)合率=(總血藥濃度-游離型藥物濃度)/總血藥濃度×100%)

結(jié)果表明，連翹苷的血漿蛋白結(jié)合率在不同濃度下均大于60%，屬于中等強度結(jié)合，且不同濃度下的連翹苷血漿蛋白結(jié)合率無顯著性差異，無濃度依賴性。

表3 連翹苷血漿蛋白結(jié)合率試驗結(jié)果

3 討 論

目前測定游離型血藥濃度的方法主要有兩種：平衡透析法和超濾法[9-12]，平衡透析法的測定一般需要十幾個小時，時間長，操作繁瑣，而超濾法方法簡單，耗時較少，基于此，本實驗選取超濾法作為測定血漿蛋白結(jié)合率的方法，不僅提高了效率，在一定程度上還減小了物質(zhì)不穩(wěn)定所帶來的干擾。

本實驗分別考察了不同轉(zhuǎn)速及不同超濾時間對超濾液的影響，以超濾液體積占總體積0.3～0.6為指導原則，并且用10%高氯酸檢查是否有蛋白漏出[13]，結(jié)果表明在8000 r/min離心15 min較為適宜。同時對37 ℃水浴孵育時間(0.5、1、2、 4 h)進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連翹苷對照品溶液在2 h后與血漿蛋白結(jié)合達到動態(tài)平衡，因此確定孵育時間為2 h。

研究結(jié)果表明連翹苷的血漿蛋白結(jié)合率在60%以上，屬于中等強度結(jié)合，這與連翹苷在大鼠體內(nèi)藥代動力學特征“快速釋放，緩慢消除[14]”相互佐證，藥物在進入體內(nèi)后主要是游離型藥物發(fā)揮療效，當游離型藥物由于組織分布濃度下降，結(jié)合型部分又可逆性的進行補充，延緩藥物在體內(nèi)的消除，使作用時間延長[15]。

4 結(jié) 論

本實驗建立了超濾法結(jié)合高效液相色譜法測定連翹苷中游離型藥物濃度，該方法穩(wěn)定可行，測得的連翹苷血漿蛋白結(jié)合率均達到了60%以上，無濃度依賴性。臨床上血漿蛋白結(jié)合率高的物質(zhì)可能會因為聯(lián)合用藥發(fā)生毒性反應，本實驗連翹苷的結(jié)合率不足70%，發(fā)生因血藥濃度突然升高導致的毒性反應的可能性較小。另外，實驗測得的連翹苷游離型藥物濃度達到了30%以上，在一定程度上也說明了連翹苷在體內(nèi)可以很好的被吸收利用，但僅僅從連翹苷游離型藥物濃度來判斷連翹苷在體內(nèi)的可利用程度具有局限性，接下來可結(jié)合藥代動力學進行進一步深入研究，為連翹苷新藥研發(fā)應用于臨床提供理論指導。