GC-MS/MS對尿液中18種濫用藥物的定性檢測*

譚 潔，陳思伊，梁善范，陸亦在，黃 麗，蘇 穎

(南寧市疾病預防控制中心，廣西 南寧 530023)

藥物濫用幾乎在每個國家都是越來越多，它們常與犯罪行為、健康危害、事故、災難等聯(lián)系在一起，危害極大[1-2]。因此，社會需要付出巨大的財力去減少或制止這種濫用。大多數(shù)藥物濫用都是非法的。目前測定人尿中濫用藥物的方法主要有液相色譜法(LC)[3]、液質聯(lián)用法(LC-MS)[4]、氣相色譜法(GC)[5]和氣質聯(lián)用法(GC-MS)[6-7]。GC-MS聯(lián)用技術以其特有的優(yōu)勢在添加藥物檢測中發(fā)揮著重要的作用[8]，其同時具有氣相色譜高分離性能及質譜準確鑒定化合物結構的特點，既快速又準確。而當前GC-MS聯(lián)用法大多建立在全掃描(Scan)和選擇離子(SIM)模式基礎上，建立多反應監(jiān)測(MRM)模式的測定方法卻鮮有報道。在此基礎上，本試驗將建立一種快捷、準確可靠且能同時測定人尿中18種濫用藥物以多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測的GC-MS/MS聯(lián)用法，提高檢驗靈敏度的同時更好的消除直接溶劑提取產生的基質干擾，為常見18種濫用藥物監(jiān)測提供參考依據。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B氣相色譜-串聯(lián)7000D質譜儀，Agilent公司；冷凍高速離心機，Sigma公司；氮吹儀，北京中惠普分析技術研究所。18種對照標準品(單標，濃度均為1.0 mg/mL)，Cerilliant公司；烯丙異丙基巴比妥(1.0 mg/mL)，Cerilliant公司；SKF525(1.0 mg/mL)，Cerilliant公司；N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA，With 1%TMCS)，Cerilliant公司；甲醇(色譜純)，F(xiàn)isher公司；乙酸乙脂(色譜純)，F(xiàn)isher公司；無水乙醚(分析純)，成都市科隆化學品有限公司；氫氧化鈉(優(yōu)級純)，成都市科龍化工試劑廠；鹽酸(優(yōu)級純)，太倉滬試試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.2 方 法

1.2.1 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5 ms(30 m × 250 μm× 0.25 μm，Agilent公司)；進樣口溫：250 ℃；進樣量：1 μL；分流方式：不分流；柱溫：80 ℃保持1 min，以15 ℃/min程序升溫至300 ℃保持 2 min；流速：3 mL/min(He，99.999%)。

1.2.2 質譜分析條件

離子源：EI，70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；四級桿溫度MS2、MS1：150 ℃；采集方式：多反應監(jiān)測(MRM)模式；溶劑延遲3 min。

1.2.3 樣品前處理

取待測尿液2 mL，加入10 μL不同濃度的2種內標混合液，混勻，先加入1 mol/L鹽酸調節(jié)pH 3～4，用3 mL乙醚:乙酸乙酯(1:2)萃取溶劑，漩渦振蕩提取10 min，8000 r/min下離心5 min，轉移有機相，尿液再加10%氫氧化鈉調pH 11～12，加入3 mL乙醚-乙酸乙酯(1:2)溶劑，渦振蕩提取 10 min，8000 r/min下離心5 min，最后將有機相與酸性條件提取的有機相合并，40 ℃下氮氣吹干，用200 μL乙酸乙酯定容后供GC-MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 溶劑對萃取率的影響

實驗中考察了3種不同極性(乙醚，乙酸乙酯，乙醚-乙酸乙酯(1:2))的萃取劑對尿樣種18種濫用藥物的提取效果的影響。取3份加標尿樣樣本，調節(jié)pH 3～4，加入3 mL上述3種萃取溶劑提取第一次，再調節(jié)pH 11～12，加入3 mL上述3種萃取溶劑提取第二次。結果表明：以乙醚為萃取溶劑時，苯丙胺、甲基苯丙胺和3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺未檢出，即乙醚未能將它們從尿液中有效提??；以乙酸乙酯為萃取溶劑時，18種濫用藥物均檢出，但氮吹去溶劑過程耗時較長；以乙醚-乙酸乙酯(1:2)為萃取溶劑時，18種濫用藥物均被有效提取，且氮吹過程比純乙酸乙酯溶劑用時短。因此選擇乙醚-乙酸乙酯(1:2)為萃取溶劑。

2.1.2 pH值對萃取率的影響

取5份加標尿樣樣本，分別調節(jié)pH 3～4、pH 5～6、pH 7～8、pH 9～10、pH 11～12，以3 mL乙醚-乙酸乙酯(1:2)為萃取劑，漩渦振蕩萃取10 min。結果表明，巴比妥、異戊巴比妥和苯巴比妥在pH 3～4時能被有效提取，其余的15種濫用藥物則在pH 11～12時被有效提取，而在pH 5～10條件下，苯巴比妥、苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺和哌替啶均未檢出，即未被有效提取。因此在萃取時，選擇pH 3～4、pH 11～12條件下各提取一次。

2.2 18種濫用藥物和兩種內標的保留時間和離子對

采用多步程序確定和優(yōu)化質譜條件。第一步，獲取每一個分析物質的全掃描(Scan)圖譜。在選擇了合適的母離子后，采集不同碰撞能量(10 eV和25 eV)下的子離子全掃描質譜。選擇合適的子離子并確定MRM離子對。最后在MRM模式下，最終子離子(每種物質至少兩個離子對)的選擇和碰撞能量的優(yōu)化以最佳的信噪比(S/N)確定。結果見表1。

確定18種濫用藥物和2種內標的離子對和碰撞能后，通過對柱溫程序、分流比、載氣流速等色譜條件進行優(yōu)化，在1.2.1的色譜條件和1.2.2質譜分析條件下，取不同質量濃度的20種混合標樣進樣，獲得理想峰形，其色譜圖如圖2所示，出峰時間見表1。

表1 18種標準品和2種內標的保留時間、定性離子對和碰撞能量、檢出限Table 1 Retention time, qualitative ion pairs, collision energy, and detection limit of eighteen standard compounds and two internal standard compounds

續(xù)表1

2.3 定性分析

按1.2.3.1處理樣品時，同時進行空白和空白加標實驗(色譜圖見圖1、圖2)。根據分析物的保留時間與標準物質的保留時間比較(相對誤差在±5%內)，以及分析物所選的離子對相對豐度比與對應標準物質的離子對相對豐度比的比較(偏差不大于20%)，對18種濫用藥物進行鑒定。

圖1 添加2種內標空白樣品的MRM圖(RT烯丙基異丙基巴比妥=8.040 min，RTSKF525=12.760 min)Fig.1 The MRM spectra of Blank sample with two internal standard compounds.

圖2 添加18種濫用標準物質和2種內標物質空白樣品的MRM圖Fig.2 The MRM spectra of Blank sample with eighteen standard compounds and two internal standard compounds.

2.4 方法靈敏度

取空白健康人尿液2 mL，準確加入哌替啶、美沙酮、甲基苯丙胺、苯丙胺、3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺、氯胺酮、巴比妥、地西泮、異戊巴比妥標準物質0.3 μg，可卡因、可待因、苯巴比妥、艾司唑侖標準物質0.6 μg，硝西泮、咪達唑侖、阿普唑侖標準物質3 μg，氯硝西泮、勞拉西泮標準物質5 μg作為計算檢出限樣品。按照1.2.3部分提及的方法進行提取和檢驗，以3倍信噪比計算檢出限，結果見表1。檢出限在0.06～1.8 μg/mL，滿足尿樣檢測的需求。

2.5 應用舉例

本方法已成功應用于能力驗證《尿液中濫用藥物的定性分析測定》，檢出尿樣中3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺和氯胺酮。其色譜圖見圖3。

圖3 添加2種內標的樣品MRM圖Fig.3 The MRM spectra of sample with two internal standard compounds.

3 結 論

本試驗建立了同時測定人尿中18種濫用藥物的GC-MS/MS多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測分析法，方法的檢出限為 0.06～1.8 μg/mL，滿足尿樣檢測的需求。通過優(yōu)化樣品前處理和儀器的測定條件，方法快速準確、靈敏度高、基質干擾少，為人尿樣樣品中18種常見濫用藥物監(jiān)測提供了可靠參考依據。