尿素包合法富集八月瓜籽中不飽和脂肪酸工藝研究*

陳榮昌，張 迪，陳 青，王 妍，楊海鵬，李 挺

(貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

八月瓜(HolboellialatifoliaWall)為木通科八月瓜屬(Holboellia)雙子葉被子植物，主要分布于云南、四川雅安、貴州銅仁等地區(qū)。八月瓜生長(zhǎng)在山麓谷地、林緣灌木叢中，農(nóng)歷八月瓜熟開(kāi)口。野生八月瓜在貴州分布廣、種類(lèi)多[1]。研究表明，八月瓜葉、果皮和果肉中含有總酚、總黃酮、抗壞血酸及 9 種酚類(lèi)，八月瓜葉的抗氧化活性指數(shù)最高兒茶素、阿魏酸、總酚和總黃酮TRPA 值貢獻(xiàn)極強(qiáng)，兒茶素、香豆酸、阿魏酸、抗壞血酸和總酚對(duì)ABTS+自由基清除能力貢獻(xiàn)極強(qiáng)，阿魏酸、總酚和總黃酮對(duì)FRAP 值貢獻(xiàn)極強(qiáng)，兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸、抗壞血酸和總酚對(duì)ABTS+自由基清除能力貢獻(xiàn)極強(qiáng)。八月瓜具有較高的清除自由基和抑制 α-葡萄糖苷酶活性的能力，其中果皮和種籽提取物具有對(duì)DPPH自由基清除能力，說(shuō)明八月瓜是一種具有較高開(kāi)發(fā)價(jià)值的藥食同源資源[2-3]。八月瓜籽中不飽和脂肪烴主要是油酸及亞油酸兩種。其中亞油酸能降低血液膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化而倍受重視。而油酸除了供給人體所需的大量熱能外，還能調(diào)整人體血漿中高、低密度脂蛋白膽固醇的濃度比例[4-6]。尿素包合法是一種多不飽和脂肪酸的常用富集方法，具有所需設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，原料無(wú)毒害且可回收再利用的優(yōu)點(diǎn)，是符合一種綠色化學(xué)的[7]。目前，以八月瓜油為原料富集不飽和脂肪酸未見(jiàn)報(bào)道，鑒于此，本文以貴州產(chǎn)八月瓜籽為原料，采用尿素包合法富集八月瓜籽油不飽和脂肪酸，以表示脂肪酸不飽和程度的指標(biāo)碘值為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)富集工藝進(jìn)行優(yōu)化。研究可為八月瓜的綜合利用提供新的思路。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

八月瓜，購(gòu)于貴陽(yáng)市場(chǎng)；95%乙醇、石油醚、尿素、正己烷、環(huán)己烷、冰乙酸、濃鹽酸、碘化鉀、一氯化碘、氫氧化鉀、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、淀粉等均為分析純，重慶川東化工有限公司；14%三氟化硼-甲醇溶液、硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、蒸餾水，碘化鉀溶液均為實(shí)驗(yàn)室自制。

電數(shù)顯水浴鍋，國(guó)華(常州)儀器制造有限公司；循環(huán)水式真空泵，鄭州生化儀器有限公司；分析天平，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮；HGC-12A數(shù)顯恒溫水浴鍋氮吹儀，天津恒奧；Agilent 7890-5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent 7890氣相色譜儀配FID檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 八月瓜籽油的提取

鮮果購(gòu)回后，經(jīng)果肉分離，果籽自然干燥和真空干燥，用植物粉碎機(jī)粉碎至30目。然后將果籽粉用濾紙包裹后放入索式提取器中，將石油醚作為溶劑提取，把果籽粉和石油醚的比例設(shè)定為1:6(g:mL)，反應(yīng)時(shí)間保持為6 h。反應(yīng)結(jié)束后，將用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干提取后的溶液，以便除去溶液里含有的石油醚，這樣便可以得八月瓜籽油，瓜籽油呈淡黃色，得油率為8.3%。

1.2.2 尿素包合法富集八月瓜籽油不飽和脂肪酸[8]

稱(chēng)取10 g八月瓜籽油緩慢滴入40 mL濃度為5%氫氧化鉀乙醇溶液中，置于磁力攪拌器77 ℃水浴攪拌皂化82 min，靜置至室溫后加入蒸餾水至溶液澄清。用濃鹽酸調(diào)溶液pH至2.5，加入正己烷于分液漏斗中萃取兩次，靜置，棄水層。蒸餾水水洗有機(jī)層至中性，用無(wú)水硫酸鈉干燥脫水后，過(guò)濾，減壓回收溶劑，得到混合脂肪酸。

稱(chēng)取5 g尿素、2 g八月瓜油混合脂肪酸，加入20 mL 95%乙醇溶液于100 mL燒瓶，置77 ℃的恒溫水浴中磁力攪拌并回流40 min至混合溶液呈透明的淡黃色后，冷卻至室溫，冰箱中沉淀；沉淀抽濾后，濾液減壓回收溶劑，加入去離子水洗滌殘留尿素，加入無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，過(guò)濾得到富集的八月瓜籽油不飽和脂肪酸。

1.2.3 碘值的測(cè)定

碘值的測(cè)定參照 GB/T 5532—2008標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。

1.2.4 脂肪酸組成測(cè)定

以未富集的八月瓜籽油及富集后的八月瓜籽油為樣品，甲酯化后，采用GC-MS聯(lián)用法進(jìn)行組成測(cè)定。

甲酯化方法：稱(chēng)取100 mg不飽和脂肪酸加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，60 ℃水浴30 min進(jìn)行甲酯化，冷卻至室溫，加1 mL蒸溜水和2 mL正己烷振蕩，靜置分層后吸取上層有機(jī)層，氮?dú)獯祿]干溶劑后用1 mL正己烷溶解，樣品進(jìn)行GC-MS分析。

氣相色譜條件：色譜柱：HF-5MS,60 m×250 μm× 0.25 μm；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；載氣：He；流速：恒流 1.5 mL/min；傳輸線溫度：260 ℃；升溫程序：初始110 ℃，5 ℃/min升到140 ℃，維持5 min；5 ℃/min升到180 ℃，維持5 min； 5 ℃/min升到250 ℃，維持5 min； 5 ℃/min升到 280 ℃，維持5 min。

質(zhì)譜條件：GC/MS接口溫度280 ℃，EI離子源，電離能量70 eV,離子源溫度230 ℃，掃描周期2.48 次/s，質(zhì)量掃描范圍m/z50-500 u。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

每次實(shí)驗(yàn)稱(chēng)取八月瓜籽油脂肪酸2 g，分別以尿醇比(脂肪酸：尿素：乙醇(95%))(1:2.5:7、1:2.5:9、1:2.5:11、1:2.5:13、1:2.5:15)，包合時(shí)間(1 h、6 h、12 h、18 h、24 h)，包合溫度(-24 ℃、-16 ℃、-8 ℃、0 ℃、8 ℃、16 ℃)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以碘值為指標(biāo)，選出最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[9-10]

響應(yīng)面法是通過(guò)回歸方程擬合單因素實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件，根據(jù) Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇尿醇比，包合時(shí)間，包合溫度三個(gè)因素為自變量，碘值為響應(yīng)值，用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)三因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)，以?xún)?yōu)化八月瓜籽油尿素包合法富集工藝，實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental factor level table

2 結(jié)果與討論

2.1 尿素富集單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 尿素與乙醇質(zhì)量體積比對(duì)包合反應(yīng)的影響

八月瓜籽油分別在尿素與乙醇質(zhì)量體積比為2.5:7、2.5:9、2.5:11、2.5:13、2.5:15、2.5:17 的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行非均相反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間18 h，反應(yīng)溫度0 ℃，對(duì)不飽和脂肪酸進(jìn)行碘值測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 尿醇比對(duì)包合反應(yīng)的影響Fig.1 Influence of urea to ethanol ratio on inclusion reaction

隨著尿醇比的變化碘值呈現(xiàn)出先增大后減小的變化趨勢(shì)，且2.5:7～2.5:13的實(shí)驗(yàn)條件下碘值上升迅速，而2.5: 13～2.5:17下降趨勢(shì)緩慢。原因可能是由于溶劑用量增大，八月瓜籽油脂肪酸將更多地溶解在95%乙醇中，減少了過(guò)濾過(guò)程中晶粒對(duì)其的包藏；同時(shí)溶劑作為提供結(jié)晶過(guò)程質(zhì)量傳遞的場(chǎng)所，溶劑用量越大，尿包對(duì)脂肪酸的包合度將會(huì)增大，故在尿醇比為2.5:13后碘值會(huì)下降[9]。因此選用2.5:13為最佳尿醇比條件。

2.1.2 包合時(shí)間對(duì)包合反應(yīng)的影響

八月瓜籽油在尿素與乙醇質(zhì)量體積比2.5:13，包合溫度 0 ℃的條件下進(jìn)行包合，包合時(shí)間分別為1、6、12、18、24、30 h，對(duì)不飽和脂肪酸進(jìn)行碘值測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 包合時(shí)間對(duì)包合反應(yīng)的影響Fig.2 Influence of inclusion time on inclusion reaction

隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)，碘值緩慢上升，當(dāng)反應(yīng)到12 h后，碘值迅速上升，包合時(shí)間為18 h 時(shí)，碘值達(dá)到最高值，隨后再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間碘值下降。因此選用18 h為最佳包合反應(yīng)時(shí)間。

2.1.3 包合溫度對(duì)包合反應(yīng)的影響

八月瓜籽油在尿素與乙醇質(zhì)量體積比2.5:13，包合時(shí)間 18 h 的條件下進(jìn)行包合，包合溫度分別為 -24、-16、-8、 0、8、16、24 ℃，對(duì)不飽和脂肪酸 進(jìn)行碘值測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)3。

圖3 包合溫度對(duì)包合反應(yīng)的影響Fig.3 Influence of inclusion temperature on inclusion reaction

尿素包合為放熱反應(yīng)，故隨著溫度的降低，碘值逐漸增大，在-24～0 ℃碘值趨近于平緩，隨后下降，-24 ℃包合效果最好，碘值達(dá)到123.76 g/100 g。因此選用-24 ℃為最佳包合反應(yīng)溫度。

2.2 尿素富集響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 工藝模型建立及檢驗(yàn)

采用 Box-Behnken 原理設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)對(duì)八月瓜籽油富集不飽和脂肪酸工以藝進(jìn)行優(yōu)化，A為尿醇比、B為包合時(shí)間、C為包合溫度，響應(yīng)值(Y)為碘值，確定最富集工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，回歸模型方差分析見(jiàn)表4。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 2 Response surface test factor levels

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

通過(guò) Design Expert 8.0.6 回歸擬合表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到的擬合函數(shù)模型為： Y=+123.51+9.42 * A+5.43* B-10.72 * C-0.64* A * B+10.37* A * C-23.40* B * C+7.60* A2-6.91* B2+21.96* C2。

由表3、表4可知，該模型影響極顯著(P<0.0001)，且其失擬項(xiàng)不顯著(P=0.0935>0.05)，回歸系數(shù) R2為0.9993，表明回歸模型的擬合效果越好，其校正決定系數(shù) R2Adj為0.9981，表明該模型能解釋99.81%響應(yīng)值的變化,模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值能較好地吻合。包合溫度、尿素乙醇添加量、包合反應(yīng)時(shí)間的Prob>F值都<0.0001，說(shuō)明A、B、C對(duì)Y值的影響達(dá)到了高度顯著的水平。尿素包合法富集八月瓜籽中不飽和脂肪酸實(shí)驗(yàn)條件中，C對(duì)Y的影響最大，B對(duì)Y的影響最小。在富集不飽和脂肪酸實(shí)驗(yàn)研究的參數(shù)中，各因素對(duì)碘值的影響從大到小依次為： 包合溫度>尿素乙醇添加量>包合反應(yīng)時(shí)間。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果和綜合因素影響得到尿素包合法富集八月瓜籽中不飽和脂肪酸的最佳工藝條件為尿醇比2.5:11、包合溫度-24 ℃、包合時(shí)間24 h，在此條件下碘值的預(yù)測(cè)值為187.03 g/100 mg。在最佳條件下進(jìn)行平行三次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，碘值平均值為189.85 g/100 mg，與預(yù)測(cè)值誤差率為1.51%，證明模型可靠，具有實(shí)際意義。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

如圖4～圖6所示，通過(guò) Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)得到了各影響因素之間對(duì)碘值影響的響應(yīng)面圖及其等高線圖，能夠較為直觀地反映包合溫度、尿素乙醇添加量 、 包合反應(yīng)時(shí)間的相互作用對(duì)八月瓜籽中不飽和脂肪酸富集程度。在響應(yīng)面圖中，圓形等高線表示參數(shù)之間交互怍用不顯著,而橢圓型圖 或馬鞍型圖 等高線則表示參數(shù)之間交互性能較強(qiáng)，故包合溫度與尿醇比、包合溫度與包合時(shí)間交互作用強(qiáng)[12-13]。

圖4 尿醇比和包合時(shí)間對(duì)碘值影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface and contour of the effect of urea ethanol ratio and inclusion time on iodine value

圖5 尿醇比和包合溫度對(duì)碘值的影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour of the effect of urea ethanol ratio and inclusion temperature on iodine value

圖6 包合溫度和包合時(shí)間對(duì)碘值的影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour of the effect of inclusion temperature and inclusion time on iodine value

由圖4可知，當(dāng)溫度不變時(shí)，隨尿醇比的增加，碘值呈減小趨勢(shì)，包合時(shí)間逐漸減小時(shí)，碘值減小的趨勢(shì)變得平緩，且整體的碘值偏大。如尿醇比0.17 g/mL時(shí)間12.24 h時(shí)碘值163.12 g/100 mg；尿醇比0.17 g/mL時(shí)間23.53 h時(shí)碘值129.46 g/100 mg；尿醇比0.23 g/mL時(shí)間23.53 h時(shí)碘值98.89 g/100 mg。故較適宜的包合時(shí)間在12～18 h，這與單因素的結(jié)論一致。

由圖5可以看出，當(dāng)特征值均為正值時(shí)，響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面，存在極小值。隨著溫度與尿醇比的增加，脫酸率先減小后增大，說(shuō)明增加包合溫度并增大尿醇比，不利于不飽和脂肪酸的富集，持續(xù)增加兩個(gè)因素，會(huì)使得碘值略微增加。

由圖6可得，當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)，響應(yīng)面分析圖為馬鞍形曲面，無(wú)極值存在。包合溫度較高時(shí)，包合時(shí)間適宜較長(zhǎng)，而包合溫度較低時(shí)，包合時(shí)間適宜較短，如溫度-23.71 ℃時(shí)間23.63 h時(shí)碘值181.226 g/100 mg；但溫度-23.71 ℃時(shí)間12.92 h時(shí)碘值132.97 g/100 mg；溫度-8.34 ℃時(shí)間12.99 h時(shí)碘值164.05 g/100 mg；但溫度-8.34 ℃時(shí)間23.63 h時(shí)碘值130.30 g/100 mg。

2.3 脂肪酸組成測(cè)定結(jié)果

按照GC-MS分析條件對(duì)八月瓜籽油富集前后脂肪酸化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如圖7、圖8和表7所示。

圖7 八月瓜籽油富集前脂肪酸總離子流圖Fig.7 Total ion flow of fatty acids before Holboellia latifoliaWall seed oil enrichment

圖8 八月瓜籽油富集后脂肪酸總離子流圖Fig.8 Total ion flow of fatty acids after Holboellia latifoliaWall seed oil enrichment

表7 八月瓜籽油富集前后的脂肪酸化學(xué)成分Table 7 Chemical composition of fatty acids before and after enrichment of Holboellia latifolia Wall seed oil

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，八月瓜籽油富集前主要含有5種脂肪酸，分別為棕櫚酸、亞油酸、油酸、反油酸及硬脂酸，其中不飽和脂肪酸總含量為72.78%，富集后的八月瓜籽油中主要含有亞油酸和油酸，不飽和脂肪酸總含量提高到95.81%，通過(guò)尿素包合法達(dá)到富集不飽和脂肪酸的目的。亞油酸是人體各器官正常工作的必須的脂肪酸，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇必須與亞油酸結(jié)合才能在體內(nèi)進(jìn)行正常的運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝；當(dāng)人體缺乏亞油酸時(shí)，膽固醇與飽和脂肪酸結(jié)合將發(fā)生代謝上的障礙，并沉積在血管壁上，形成動(dòng)脈粥樣硬化，從而引發(fā)心腦血管疾病[11]。用尿素包合富集的方法可以大大提高提取不飽和脂肪酸的含量[12-13]，八月瓜籽油富集后亞油酸的含量提高到61.79%，可以作為亞油酸的植物來(lái)源使用。

3 結(jié) 論

采用索氏提取和尿素包合法對(duì)八月瓜籽中的脂肪酸進(jìn)行提取，提取的籽油經(jīng)過(guò)皂化反應(yīng)和尿素包合反應(yīng)可以得到高純度的不飽和脂肪酸，純化后八月瓜籽中不飽和脂肪酸含量從72.78%提高到95.81%，碘值也由44.52 g/100 mg 提升到189.85 g/100 mg，達(dá)到富集純化的目的。響應(yīng)面法優(yōu)化后的富集工藝條件為：尿素與95 %乙醇質(zhì)量體積比2.5:11、包合溫度-24 ℃、包合時(shí)間24 h，在最佳條件下碘值平均值為189.85 g/100 mg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近，各因素對(duì)碘值的影響次序?yàn)榘蠝囟?尿素乙醇添加量>包合反應(yīng)時(shí)間。研究可為八月瓜籽的綜合利用提供新思路。