荷斯坦牛免疫抗病相關(guān)Nramp1基因生物信息學(xué)分析

張夢帆，李耀東

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

Nramp基因?qū)儆谔烊豢剐韵嚓P(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（natural-resist-ance-associated macrophage protein,Nramp）家族，又稱為溶質(zhì)載體家族11成員（solute carrier11,SLC11）[1]。Nramp基因廣泛存在于細(xì)菌、真菌和動植物中，在所有生命體中具有高度保守的序列，主要分為Nramp1（SLC11A1）和Nramp2（SLC11A2）兩種，Nramp1基因主要在吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中特異性表達(dá)，Nramp2基因在眾多組織和細(xì)胞廣泛表達(dá)[2]。Nramp1基因長度為12kb，包含15個外顯子，有著高度同源性的氨基酸序列和相似的二級結(jié)構(gòu)[3]。其所編碼蛋白具有10～12個預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域，位于吞噬體膜，參與二價陽離子的轉(zhuǎn)運。通過轉(zhuǎn)運Fe2+、Mn2+等離子不僅保護(hù)巨噬細(xì)胞不產(chǎn)生活性氧，而且還可使細(xì)菌失去自身防御酶系統(tǒng)所必需的離子[4]。

荷斯坦牛屬于大型乳用牛品種，體格較大，乳房炎為其常見病之一。牛的Nramp1基因位于牛2號染色體q43-44區(qū)域，長度約10.1kb。研究表明，Nramp1基因與多種傳染病和細(xì)胞內(nèi)寄生蟲病抵抗力相關(guān)，不僅影響動物的IgM、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率等部分免疫指標(biāo)，還與動物的產(chǎn)奶量、體重等多種生產(chǎn)性能密切相關(guān)[5]。本文主要對荷斯坦牛的Nramp1基因展開研究，旨在通過對這一基因的生物信息學(xué)分析為今后牛的免疫抗病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

荷斯坦牛Nramp1基因編碼的氨基酸序列來自于GenBank，登錄號為DQ493965.1。

1.2 方法

對荷斯坦牛Nramp1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用軟件分析其編碼蛋白的基本理化特性和高級結(jié)構(gòu)，需要應(yīng)用的工具軟件與網(wǎng)址見表1。

表1 荷斯坦牛Nramp1基因生物信息學(xué)分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 荷斯坦牛Nramp1基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

由ProtParam軟件預(yù)測結(jié)果可知，荷斯坦牛Nramp1基因編碼蛋白質(zhì)的分子式為C2761H4300N680O742S21，氨基酸數(shù)為548個，所含的氨基酸數(shù)目及比例見表2。其分子質(zhì)量大小為59 565.88，理論等電點為6.39。帶負(fù)電殘基總數(shù)（Asp+Glu）為35個，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為33個。在體外，哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)，預(yù)估半衰期為30h；在體內(nèi)，在酵母中預(yù)估半衰期大于20h，大腸桿菌中預(yù)估半衰期大于10h。不穩(wěn)定指數(shù)為47.06，這說明荷斯坦牛的Nramp1基因編碼蛋白為不穩(wěn)定蛋白。疏水性總平均值（GRAVY）為0.554，這類蛋白為疏水蛋白。

表2 荷斯坦牛Nramp1基因編碼蛋白的氨基酸組成

2.2 荷斯坦牛Nramp1編碼蛋白質(zhì)疏水性/親水性分析

利用ProtScale在線預(yù)測荷斯坦牛Nramp1蛋白的親/疏水性，結(jié)果見圖1。由圖1可知，疏水區(qū)最大值為第472位氨基酸（+2.922），這一位置氨基酸為亮氨酸；親水區(qū)最小值為第541位氨基酸（-3.100），這一位置氨基酸為谷氨酰胺。由ProtParam對荷斯坦牛Nramp1蛋白的預(yù)測結(jié)果顯示，其平均疏水性為0.554。ProScale的預(yù)測結(jié)果顯示，荷斯坦牛Nramp1蛋白的疏水肽鏈分布在整個氨基酸序列中，且明顯多于親水性肽鏈，兩個預(yù)測結(jié)果均證明荷斯坦牛Nramp1蛋白是一種疏水蛋白質(zhì)。由此可推測荷斯坦牛Nramp1基因編碼的蛋白質(zhì)是一種不可溶性蛋白質(zhì)。

圖1 荷斯坦牛Nramp1基因編碼蛋白質(zhì)的親/疏水性預(yù)測

2.3 荷斯坦牛Nramp1基因編碼蛋白質(zhì)的信號肽預(yù)測

用以引導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜移動的氨基酸序列的N-末端在新合成多肽鏈中稱為信號肽，是指導(dǎo)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上分泌蛋白合成的決定性因素[6]。經(jīng)過分析可以看出，使用SignalP5.0在線軟件對Nramp1基因編碼的氨基酸序列的信號肽進(jìn)行預(yù)測（圖2），荷斯坦牛Nramp1基因編碼序列不存在任何信號肽的概率為0.9948，因此可知Nramp1蛋白不具有分泌信號肽的特征。

圖2 荷斯坦牛Nramp1基因編碼蛋白質(zhì)的信號肽預(yù)測

2.4 荷斯坦牛Nramp1基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過在線工具TMHMM進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，預(yù)測結(jié)果如圖3顯示?？梢钥闯龊伤固古ramp1蛋白存在11處明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域（81～103、133～155、165～184、196～218、238～260、281～303、346～368、398～415、430～452、459～481、491～513），其余非跨膜結(jié)構(gòu)域中有6處（1～80、156～164、219～237、304～345、416～429、482～490）位于膜外，6處（104～132、185～195、261～280、369～397、453～458、514～548）位于膜內(nèi)。

圖3 荷斯坦牛Nramp1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 荷斯坦牛Nramp1蛋白N-糖基化位點及磷酸化位點預(yù)測

N-糖基化位點和磷酸化位點分別經(jīng)NetNGlyc 1.0 Server和NetPhos 3.1 Server軟件進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，荷斯坦牛Nramp1蛋白第335位氨基酸處存在1處N-糖基化修飾位點（如圖4所示），且存在41個潛在磷酸化位點（閾值＞0.5）。位點預(yù)測得分若僅略高于閾值（0.5），則表明該預(yù)測位點作為一個真正磷酸化位點的可信度較低。一般來說，位點預(yù)測得分越高，預(yù)測的可信度越高。結(jié)果如圖5所示，包括27個Ser(Ser17、Ser19、Ser20、Ser23、Ser37、Ser51、Ser77、Ser145、Ser158、Ser161、Ser229、Ser258、Ser263、Ser269、Ser290、Ser322、Ser323、Ser371、Ser393、Ser403、Ser422、Ser433、Ser468、Ser487、Ser527、Ser528、Ser547);13個Thr(Thr34、Thr45、Thr59、Thr114、Thr153、Thr206、Thr311、Thr375、Thr377、Thr401、Thr409、Thr514、Thr522)及1個Try（Thr211）。

圖4 荷斯坦牛Nramp1蛋白N-糖基化位點預(yù)測

圖5 荷斯坦牛Nramp1蛋白磷酸化位點預(yù)測

2.6 荷斯坦牛Nramp1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要是借助多肽鏈空間盤曲折疊而產(chǎn)生，其氫鍵的組成部分是C=O以及N-H基團(tuán)[6]。經(jīng)過對其二級結(jié)構(gòu)的預(yù)估結(jié)果（圖6）觀察可以發(fā)現(xiàn)，其中無規(guī)則卷曲（Cc）的數(shù)值是40.69%，α-螺旋（Hh）的數(shù)值是42.88%，延伸鏈（Ee）為16.42%，其中不存在β轉(zhuǎn)角（Tt）。三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果見圖7，經(jīng)采用ExPASy-SWISS-MODEL在線軟件，選取與氨基酸序列相似性最高序列，顯示荷斯坦牛Nramp1蛋白三維模型QMEAN值為－6.25，GMQE值為0.63，模型相似性為31.72%。

圖6 荷斯坦牛Nramp1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖7 荷斯坦牛Nramp1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7 荷斯坦牛Nramp1基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

由STRING分析發(fā)現(xiàn)，Nramp1基因編碼蛋白與其互作蛋白相關(guān)性均在0.95以下。Nramp1與CYBB的相關(guān)性最高，高達(dá)0.937。CYBB為細(xì)胞色素b-245重鏈，是呼吸鏈的末端組成部分，是吞噬細(xì)胞膜結(jié)合氧化酶的關(guān)鍵成分。它將單個電子從細(xì)胞質(zhì)NADPH穿過質(zhì)膜傳遞到外部，也作為電壓門控質(zhì)子通道，介導(dǎo)靜息吞噬細(xì)胞的H（+）電流。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，與Nramp1基因編碼蛋白相互作用的蛋白質(zhì)有非特征蛋白(CD300A)、整合素β-2（ITGB2）、C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員D（CLEC4D）、溶質(zhì)載體家族2易化葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白成員3（SLC2A3）、細(xì)胞色素b-245輕鏈（CYBA）、IgA的Fc片段（FCAR）、細(xì)胞色素b-245重鏈（CYBB）、高親和力免疫球蛋白ε受體亞單位γ（FCER1G）、ATPaseⅥ類11A型(ATP11A）、ATPaseⅠ類8B型成員4（ATP8B4）等。

圖8 荷斯坦牛Nramp1基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

3 討論

在免疫學(xué)中，一般認(rèn)為結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子質(zhì)量在10ku以上的物質(zhì)具有免疫原性，而荷斯坦牛Nramp1基因編碼蛋白分子質(zhì)量達(dá)到近60ku，這證明荷斯坦牛Nramp1蛋白具有一定的免疫作用。Nramp1基因主要在巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及外周血細(xì)胞等吞噬細(xì)胞中表達(dá)[7]，因而在先天性免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。Gruenheid等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Nramp1蛋白主要位于巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞小體和溶酶體的膜上。Nramp1蛋白可通過螯合Fe2+和Mn2+調(diào)節(jié)細(xì)菌和真核細(xì)胞酶的活性。一方面保護(hù)巨噬細(xì)胞自身的抗氧化作用，另一方面可以降低病原體合成自身保護(hù)酶的能力[9]。且通過離子轉(zhuǎn)運激活動物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，可引起“多向性效應(yīng)”的發(fā)生，從而使動物對疾病具有較強(qiáng)的天然抵抗力[10～12]。Vidal等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，在Nramp1基因突變至其功能喪失的情況下，小鼠只在感染早期時免疫力低下，而感染后期功能正常，說明Nramp1基因在巨噬細(xì)胞和寄生蟲互作的早期免疫階段發(fā)揮著重要作用[14]。Nramp基因和多種細(xì)胞內(nèi)菌體的抗性感染相關(guān)聯(lián)。在紅綢魚受到致病弧菌侵襲時，Nramp1基因mRNA的表達(dá)量顯著升高[15]。團(tuán)頭魴受脂多糖刺激時，Nramp1基因mRNA水平也有所上調(diào)[16]。Nramp1基因在小鼠抵抗弗朗西斯菌中起著重要作用，且對沙門氏菌、結(jié)核分枝桿菌及利什曼原蟲也有著顯著抗性[17]。Paixao等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Nramp1基因3′UTR區(qū)序列的多態(tài)性與牛對布魯氏桿菌抗性和易感性有關(guān)。Joo等[19]研究結(jié)果表明，抗乳腺炎奶牛的Nramp1基因表達(dá)水平高于易感奶牛，這說明Nramp1基因活性高的個體不易患乳腺炎。郭洋等[20]發(fā)現(xiàn)，Nramp1基因與牛的乳腺炎抗性相關(guān)。

本研究主要從生物信息學(xué)角度解析了荷斯坦牛Nramp1基因的部分信息。預(yù)測結(jié)果表明其本質(zhì)是一種不穩(wěn)定疏水蛋白，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示以無規(guī)則卷曲與α-螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)為主。荷斯坦牛Nramp1蛋白有27個Ser和13個Try和1個Try，總計41個潛在的磷酸化位點，這些位點可能影響到某些細(xì)胞的代謝過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過利用生物軟件分析荷斯坦牛Nramp1基因的生物信息學(xué)內(nèi)容，有利于輔助開展關(guān)于Nramp1基因的相關(guān)科學(xué)研究，并且能為其深入研究提供一些基礎(chǔ)資料。