奶牛場(chǎng)結(jié)核病常用檢測(cè)技術(shù)的比較與應(yīng)用

郝振江，楊秀娟，張曉利，田光，崔大江，邢春偉

（1.河北省唐山市漢沽管理區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，唐山 301501；2.河北省唐山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，唐山 063000）

奶牛結(jié)核病是一種人畜共患的慢性消耗性傳染病，嚴(yán)重威脅乳制品質(zhì)量安全和人體健康，OIE將其列為B類(lèi)疫病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物傳染病。結(jié)核分枝桿菌能在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活，屬于胞內(nèi)菌，因此淘汰感染牛群是消除結(jié)核病最有效的措施[1]。臨床上有可見(jiàn)病變的牛占感染牛的少數(shù)，如有臨床癥狀，差異也較大，經(jīng)常無(wú)特異性癥狀出現(xiàn)[1]。因此對(duì)牛結(jié)核病的診斷主要靠檢測(cè)的方法發(fā)現(xiàn)感染牛。多年來(lái)，該病一直是我國(guó)奶牛場(chǎng)必須檢測(cè)凈化的傳染病，對(duì)其實(shí)施嚴(yán)格的檢疫、凈化等控制措施，也取得了明顯成效。但是隨著我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，規(guī)?；?、集約化已經(jīng)成為奶牛養(yǎng)殖業(yè)的主要形式，養(yǎng)殖規(guī)模不斷加大。隨之而來(lái)的牛場(chǎng)結(jié)核病檢測(cè)及凈化工作壓力也逐步加大，按照常規(guī)的PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)一年兩次的檢測(cè)方式已經(jīng)不能完全適應(yīng)現(xiàn)代化奶牛場(chǎng)結(jié)核病檢測(cè)的需要，因此需要探索建立一套科學(xué)高效的結(jié)核病檢測(cè)程序加以解決。

本文僅就當(dāng)前幾種常用的結(jié)核病檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行比較分析與探討，以期建立起一套適合于我國(guó)規(guī)?；膛?chǎng)結(jié)核病檢測(cè)的科學(xué)有效的程序，提高結(jié)核病檢測(cè)的質(zhì)量和效率，從而加快推進(jìn)全國(guó)規(guī)?；膛?chǎng)凈化工作。

1 結(jié)核病檢測(cè)方法

目前結(jié)核病常用檢測(cè)方法主要有結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室γ-干擾素（INF-γ）ELISA檢測(cè)技術(shù)。按照注射部位不同，PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)又分為PPD頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（Sin-gle Intradermal Cervical Tuberculin,SICT）和PPD尾根腹面皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（Caudal Fold Test,CFT），SICT被OIE確定為牛結(jié)核病法定檢疫方法，被世界各國(guó)接受和采用[2]，也是我國(guó)結(jié)核病檢測(cè)的法定方法，是目前國(guó)內(nèi)基層結(jié)核病檢測(cè)普遍采用的主要方法。CFT是OIE推薦的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)中的一種，澳大利亞等國(guó)家采用CFT進(jìn)行牛結(jié)核病篩查工作[3]，近年來(lái)國(guó)內(nèi)基層也在逐步摸索推廣驗(yàn)證使用。INF-γ試驗(yàn)作為OIE推薦的結(jié)核病檢測(cè)方法之一[4]，是近幾年來(lái)開(kāi)發(fā)的一種針對(duì)結(jié)核病檢測(cè)的快速檢測(cè)方法，美國(guó)、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國(guó)家均利用其輔助診斷牛結(jié)核病[5,6]，但限于檢測(cè)成本昂貴，在我國(guó)仍未大范圍普及推廣應(yīng)用。

2 三種結(jié)核病檢測(cè)方法的敏感性、特異性、假陽(yáng)性率、符合率比較

SICT和CFT主要是用提純的PPD進(jìn)行牛皮內(nèi)接種，在72h后觀察有無(wú)熱、痛、腫脹等反應(yīng)，對(duì)可疑牛需60d后再次復(fù)檢。該方法檢出率和準(zhǔn)確率都比較高。目前PPD結(jié)核菌素試驗(yàn)的敏感性為85%，特異性為98%[1]。但是作為皮膚試驗(yàn)最大的缺點(diǎn)就是容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性反應(yīng)。而IFN-γ試驗(yàn)主要是通過(guò)檢測(cè)牛感染牛結(jié)核分枝桿菌后，機(jī)體通過(guò)細(xì)胞免疫產(chǎn)生的高水平IFN-γ含量的多少，來(lái)反映機(jī)體是否感染結(jié)核病[7]，是將試驗(yàn)牛血樣的淋巴細(xì)胞加入特異性PPD一起孵育16～24h，由于致敏的淋巴細(xì)胞能夠釋放出INF-γ，因此可用于INF-γ-ELISA進(jìn)行定量測(cè)定[8]。國(guó)外大量臨床研究表明，該檢測(cè)方法具有較高的敏感性和特異性，可以降低假陽(yáng)性率，可以檢測(cè)結(jié)核病早期感染[9]。其優(yōu)點(diǎn)是敏感性高、特異性高，可以區(qū)分牛分枝桿菌和副結(jié)核或禽分枝桿菌感染，而且重復(fù)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化。

宋之波[10]等利用上述三種方法對(duì)大型奶牛場(chǎng)牛群結(jié)核病進(jìn)行了分組檢測(cè)對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果表明，在群體陰性牛比例、陽(yáng)性牛比例、可疑牛比例指標(biāo)上，SICT測(cè)定結(jié)果與CFT測(cè)定結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）；均可反映群體結(jié)核病感染率。SICT測(cè)定結(jié)果與INF-γ試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）；在陽(yáng)性牛頭數(shù)、可疑牛頭數(shù)指標(biāo)上INF-γ試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果與SICT檢測(cè)結(jié)果差異不顯著，但是檢測(cè)敏感性要高于SICT。王曲直[11]等也對(duì)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和IFN-γ試驗(yàn)進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)SICT和CFT在試驗(yàn)牛中陽(yáng)性檢出率一致性高。國(guó)內(nèi)一些研究者在結(jié)核污染牛群進(jìn)行IFN-γ試驗(yàn)和皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的比對(duì)，陽(yáng)性符合率很高[12,13]。筆者也曾經(jīng)于2017-2019年期間對(duì)用IFN-γ試驗(yàn)檢測(cè)出的38頭結(jié)核病陽(yáng)性牛開(kāi)展了SICT和CFT比較檢測(cè)，SICT檢測(cè)陽(yáng)性牛為35頭，CFT檢測(cè)陽(yáng)性牛36頭，陽(yáng)性符合率分別為92.11%和94.74%。這也證明了三種檢測(cè)方法的陽(yáng)性牛符合率較高。

3 三種檢測(cè)方法操作特點(diǎn)及檢測(cè)效能比較

3.1 SICT檢測(cè)

SICT試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)是對(duì)操作人員專(zhuān)業(yè)水平要求較低，一般經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)就能操作[14]，所需設(shè)備簡(jiǎn)單，檢疫費(fèi)用較低。缺點(diǎn)是因牛只保定、剪毛、量皮厚、消毒、注射等操作步驟較多且繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且因在奶牛軀體前部進(jìn)行檢測(cè)操作，需有專(zhuān)人對(duì)牛頭部進(jìn)行固定，對(duì)奶牛刺激很大，容易造成較大應(yīng)激反應(yīng)而嚴(yán)重影響奶牛生產(chǎn)性能，嚴(yán)重時(shí)甚至可造成機(jī)械損傷或孕畜流產(chǎn)。所以實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用本方法檢測(cè)工作效能較低。同時(shí)結(jié)果判定過(guò)程中容易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，且人為因素影響較大，重復(fù)性較差。

3.2 CFT檢測(cè)

CFT試驗(yàn)相對(duì)于SICT試驗(yàn)，因減少了剪毛、測(cè)原始皮厚等步驟，操作起來(lái)更為簡(jiǎn)單容易、方便。牛只保定只需頸枷即可，且在生產(chǎn)中由于奶牛已經(jīng)比較適應(yīng)直腸檢查、輸精、擠奶等操作刺激，因此本方法從牛只后面操作也對(duì)牛只應(yīng)激較小。尾根腹面無(wú)毛更便于觀察注射后的皮膚變態(tài)反應(yīng)，結(jié)果判定時(shí)陰性通過(guò)肉眼觀察或者觸診即可判定，可疑或陽(yáng)性只需測(cè)量尾中褶厚度或者測(cè)量?jī)蓚?cè)尾褶厚度進(jìn)行比較即可，受人為因素影響相對(duì)較小。這大大提高了結(jié)核病檢測(cè)工作的效率和質(zhì)量。據(jù)了解這種結(jié)核病檢測(cè)技術(shù)已在國(guó)內(nèi)某些大型牧場(chǎng)中常規(guī)應(yīng)用。

3.3 INF-γ檢測(cè)

其優(yōu)點(diǎn)是操作相對(duì)簡(jiǎn)單、敏感性高，可以區(qū)分牛結(jié)核分枝桿菌和副結(jié)核分枝桿菌或禽分枝桿菌感染，而且重復(fù)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化；缺點(diǎn)是采血后必須在8h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)[15]，試劑盒價(jià)格昂貴，成本高，需在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)才能完成最終檢測(cè)。

4 討論與分析

根據(jù)以上對(duì)三種牛結(jié)核病檢測(cè)技術(shù)的比較，可以看出，三種檢測(cè)技術(shù)均適用于我國(guó)規(guī)?；膛?chǎng)的檢測(cè)工作。但鑒于三種方法的自身特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用上應(yīng)靈活機(jī)動(dòng)使用。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)PPD主要用于規(guī)模牛群的結(jié)核病普檢，從而發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性牛群體，為后續(xù)相應(yīng)處置措施提供初步數(shù)據(jù)。陽(yáng)性牛個(gè)體確診應(yīng)平行使用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、INF-γ試驗(yàn)、病原菌分離培養(yǎng)等方法。

CFT試驗(yàn)相較于SICT試驗(yàn)，因其操作相對(duì)容易，檢測(cè)效率較高，更適合于大型規(guī)?；膛?chǎng)用于對(duì)整體牛群的結(jié)核病普檢工作，適宜在全國(guó)規(guī)?；膛?chǎng)的結(jié)核病檢測(cè)中普及推廣，從而提升奶牛場(chǎng)的結(jié)核病檢測(cè)工作效率和檢測(cè)質(zhì)量。因此建議將其也納入到牛結(jié)核病檢測(cè)的國(guó)家法定方法之中，以便于基層靈活選擇使用。

SICT試驗(yàn)比較適應(yīng)于中小型奶牛場(chǎng)或者大型規(guī)模化奶牛場(chǎng)對(duì)檢出的可疑陽(yáng)性牛進(jìn)行復(fù)檢復(fù)核，也可應(yīng)用于基層獸醫(yī)技術(shù)部門(mén)對(duì)規(guī)模奶牛場(chǎng)的結(jié)核病的抽樣檢測(cè)。

INF-γ試驗(yàn)，雖敏感性較高僅需抗凝血就可以進(jìn)行檢測(cè)，適合于實(shí)驗(yàn)室診斷和結(jié)核病早期診斷。但鑒于目前價(jià)格較高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用，當(dāng)前主要用于對(duì)可疑陽(yáng)性牛的復(fù)核確診或者用于職能部門(mén)少量抽樣檢測(cè)。將來(lái)隨著商品化檢測(cè)試劑盒價(jià)格下降，該檢測(cè)方法有望在臨床結(jié)核病檢測(cè)中得到普及和推廣。

5 結(jié)論

鑒于以上總結(jié)分析，為了更好地開(kāi)展奶牛結(jié)核病檢測(cè)凈化工作，應(yīng)采取企業(yè)全面自檢和職能部門(mén)抽檢相結(jié)合的方式加以推進(jìn)。企業(yè)自檢可以根據(jù)需要自行組織開(kāi)展或者委托有資質(zhì)的第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)開(kāi)展結(jié)核病檢測(cè)工作，檢測(cè)方法用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，并有詳細(xì)的檢測(cè)記錄存檔備查。為此建議奶牛場(chǎng)自檢或者委托檢測(cè)結(jié)核病的檢測(cè)程序可以這樣實(shí)施：首先采用CFT試驗(yàn)進(jìn)行普檢注射，72h后進(jìn)行普檢結(jié)果判定；發(fā)現(xiàn)可疑或者陽(yáng)性牛只60d后對(duì)其進(jìn)行SICT試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)檢注射，復(fù)檢結(jié)果仍為可疑或者陽(yáng)性的，則判定為陽(yáng)性牛并嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行處置，企業(yè)自檢應(yīng)每年2次。獸醫(yī)主管部門(mén)抽檢：每年進(jìn)行1～2次奶牛結(jié)核病抽檢，其工作程序?yàn)椋簩彶槠髽I(yè)結(jié)核病自檢檔案了解奶牛結(jié)核病感染情況，并根據(jù)結(jié)核病感染情況按照牛群存欄10%～20%的抽檢比例（注意抽檢采樣要覆蓋所有年齡段的牛群，以確保抽檢的覆蓋面和代表性）進(jìn)行監(jiān)督抽檢，抽檢可以采用PPD皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)，也可以采用INF-γ試驗(yàn)檢測(cè)。經(jīng)過(guò)上述方式連續(xù)檢測(cè)2～3年，并嚴(yán)格實(shí)施陽(yáng)性牛撲殺無(wú)害化處理，待群體奶牛結(jié)核病陽(yáng)性率低于0.1%后，確定為結(jié)核病凈化群。以后轉(zhuǎn)為結(jié)核病凈化維持檢測(cè)階段，企業(yè)每年自行普檢1～2次，職能部門(mén)按照5%～10%的抽檢比例每年抽檢1～2次。

誠(chéng)然，奶牛牛結(jié)核病檢測(cè)技術(shù)不僅限于筆者以上所述三種方法，其他細(xì)菌學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)等新型檢測(cè)方法也不斷出現(xiàn)。因篇幅所限，本文僅就筆者所在地區(qū)常用的這三種方法進(jìn)行了論述?？傊?，在奶牛結(jié)核病檢測(cè)檢疫的實(shí)踐中，應(yīng)借鑒國(guó)內(nèi)外結(jié)核病檢測(cè)的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，不斷摸索奶牛結(jié)核病檢測(cè)的新方法和新技術(shù)，逐步建立起一套適合中國(guó)國(guó)情的奶牛結(jié)核病檢測(cè)凈化新模式，并在全國(guó)范圍內(nèi)得到推廣應(yīng)用，保障我國(guó)乳業(yè)健康發(fā)展。