以層次分析及多指標(biāo)正交法優(yōu)選丁半顆粒提取工藝*

傅靜娟，鄒愷平，倪文澎，王 迅，吳旭彤

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院&江蘇省中醫(yī)院，南京 210000

丁半顆粒由紫花地丁[1]和半邊蓮[2]兩味中藥組成，由江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑丁半合劑改良而來，目的為使患者服用方便并改進(jìn)其口感。原制劑丁半合劑具有清熱解毒功效，臨床用于一般感染和毒蛇咬傷，療效顯著。處方中重用紫花地丁為君藥，以清熱解毒，涼血消腫；輔以半邊蓮為臣藥，清熱解毒，利水消腫；共奏清熱解毒消腫之功。

為了保證臨床療效，本研究以浸膏得率、總黃酮含量、秦皮乙素[3，4]含量作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用層次分析法[5]，根據(jù)處方中各藥材的作用計(jì)算各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，進(jìn)行多指標(biāo)性成分綜合評(píng)價(jià)，以綜合評(píng)分進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，對(duì)溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察，優(yōu)選最佳提取工藝。

1 儀器與藥品、試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀，四元泵（G1311A）；BP-211D 十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius）；AX224ZH/E 萬分之一電子天平（美國OHAUS Corp）；Cary 50 Conc 紫外可見分光光度計(jì)（美國Varian）。

紫花地?。ㄅ?hào)：20180701）、半邊蓮（批號(hào)：20181101）為安徽井泉中藥飲片有限公司產(chǎn)品，均經(jīng)過本院主任中藥師吳旭彤鑒別及薄層色譜驗(yàn)證；秦皮乙素對(duì)照品（南京聚康醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)180929）；蘆丁對(duì)照品（南京聚康醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)181024）；硅膠G 板（青島海洋化工廠分廠）；試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

所用藥材飲片為紫花地丁和半邊蓮，按文獻(xiàn)[6]方法操作甄鑒。

2.2 總黃酮的測(cè)定

以蘆丁為對(duì)照品溶液，測(cè)定其吸光度，繪制總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，為Y=9.732 1X+0.013 9，r2=0.993 5。

2.3 單因素考察[7]

2.3.1 加水量在其他煎煮條件不變的情況下，考察溶劑為8、12、20 倍量的煎液中浸膏得率和總黃酮含量（一劑處方量）。結(jié)果見圖1。

圖1 提取溶劑用量對(duì)浸膏得率（A）及總黃酮含量（B）的影響

從圖1 可知，在藥材條件不變情況下，對(duì)丁半顆粒浸膏得率和總黃酮含量的影響來看，當(dāng)溶劑用量為20 倍時(shí)，浸膏得率與總黃酮含量均最高。

2.3.2 提取時(shí)間在其他煎煮條件不變的情況下，考察提取時(shí)間為30、60、120 min 的煎液中浸膏得率和總黃酮含量。結(jié)果見圖2。

從圖2 可知，提取時(shí)間越長，浸膏得率含量越高；當(dāng)提取時(shí)間為60 min 時(shí)，總黃酮含量最高，而提取時(shí)間為120 min 時(shí)總黃酮含量變低。

圖2 提取時(shí)間對(duì)浸膏得率（A）及總黃酮含量（B）的影響

2.3.3 浸泡時(shí)間分別考察浸泡30、60、90min 藥材的吸水率。結(jié)果見圖3。

圖3 浸泡時(shí)間對(duì)吸水率的影響

從圖3 可知，60 min 之前，浸泡時(shí)間越長，吸水率高；此后，吸水率基本不變，因此確定浸泡時(shí)間為60 min。

2.4 提取工藝優(yōu)選

用層次分析法計(jì)算權(quán)重，根據(jù)復(fù)方活性成分的藥理作用強(qiáng)弱和君臣佐使的配伍規(guī)律，將秦皮乙素含量、總黃酮含量和浸膏得率作為權(quán)重指標(biāo)[5，7]。因藥材均含總黃酮成分，且起到抗菌、抗病毒作用[1-4]，故總黃酮權(quán)重系數(shù)最高；秦皮乙素含量稍低，具有抗菌作用[2]，故權(quán)重系數(shù)次之；而浸膏中雜質(zhì)含量較多，故權(quán)重系數(shù)最低。從主觀上將其比較列為總黃酮＞秦皮乙素＞浸膏得率，參考相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)表1各層次評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，建立層次結(jié)構(gòu)模型，見圖4，并構(gòu)成兩兩比較矩陣，見表2。

圖4 層次結(jié)構(gòu)模型

表1 各層次評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)表2 中判斷的結(jié)果對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算浸膏得率、總黃酮、秦皮乙素所得權(quán)重系數(shù)分別為0.2937、0.4230、0.2833。一致性比例因子CR=0.040 9＜0.10，表明此判斷矩陣滿足一致性要求，權(quán)重系數(shù)有效[8]。

表2 指標(biāo)成分對(duì)比判斷優(yōu)選矩陣

2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)對(duì)單因素考察結(jié)果的分析，最終選擇浸膏得率、總黃酮含量、秦皮乙素含量作為正交試驗(yàn)考察指標(biāo)，以提取時(shí)間，溶劑用量及提取次數(shù)為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，篩選丁半顆粒水提取最優(yōu)工藝條件。因素與水平見表3。9 組提取液均通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至每毫升濃縮提取液相當(dāng)于1 g 飲片量。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

2.4.2 正交試驗(yàn)由表4、表5 可知，正交試驗(yàn)考察因素對(duì)綜合評(píng)分的影響順序?yàn)锽>C>A，根據(jù)方差分析結(jié)果，因素B 受到顯著影響，而A 和C 對(duì)結(jié)果的影響沒有顯著性差異。從直觀分析和方差分析，最佳工藝條件為A3B3C2；但結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，最終選擇工藝A1B2C1為丁半顆粒的提取工藝，即加水量為15倍，提取2 次，每次提取0.5 h。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 正交試驗(yàn)方差分析

2.4.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)按處方量稱取紫花地丁和半邊蓮藥材，平行3 份，采用最佳提取工藝煎煮提取，即用15 倍量的水回流提取2 次，每次提取0.5 h；合并濾液，濃縮至500 mL，滅菌。測(cè)定浸膏得率、總黃酮含量，秦皮乙素含量。見表6。

表6 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)處方中原藥材的性質(zhì)和實(shí)際生產(chǎn)情況分析，最終采用水提取方法。以紫花地丁中秦皮乙素含量，提取液中總黃酮的含量和浸膏得率為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確定最佳水提工藝為將藥材先浸泡1 h，用15 倍量的水回流提取0.5 h，提取2 次。

在秦皮乙素含量測(cè)定中，對(duì)溶劑選擇進(jìn)行了考察，即比較了50%、100%甲醇以及50%、100%乙醇等4 種溶劑對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果顯示，100%甲醇提取效率高，峰形好。還對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行多次試驗(yàn)調(diào)整，最終確定流動(dòng)相為0.1%磷酸水-甲醇（70∶30），秦皮乙素峰形較好，方法簡單可行，且流動(dòng)相配制簡潔。

基于層次分析法的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以往對(duì)中藥處方分析提取效果的優(yōu)劣常以主觀評(píng)價(jià)為主；隨著檢測(cè)水平的逐漸提升，越來越多的指標(biāo)性成分能夠?qū)崿F(xiàn)同步測(cè)定。根據(jù)中藥多成分、多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)，對(duì)多指標(biāo)做出合理的綜合評(píng)價(jià)是最終確立提取工藝的關(guān)鍵，可使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。