水稻側(cè)根突變體Oslrd2的表型分析和基因克隆

朱俊兆 陳宇杰 呂沈陽 陳星月 楊愈之 鄭文娟 朱世華 丁沃娜,*

(1 寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 浙江 寧波 315212；2 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

根系是植物獲取養(yǎng)分、水分以及穩(wěn)固植株的重要器官。根系構(gòu)型(root system architecture, RSA)具有高度可塑性，在植物物種之間和物種內(nèi)部存在很大的差異[1]。側(cè)根(lateral roots, LRs)是RSA的一個(gè)重要組成部分，起源于中柱鞘細(xì)胞[2]。LRs在根系中占有較高的比重，提供大部分根系養(yǎng)分吸收的能力[3]。在水稻根系中，LRs約占總根系長度的97%、總根系體積的30%和總根系表面積的78%[4]。因此，側(cè)根的發(fā)生發(fā)育一直是水稻根系發(fā)育研究的重要方向。

目前，在水稻中已分離并遺傳鑒定了一些側(cè)根發(fā)育相關(guān)的突變體，其中已克隆的許多基因與生長素信號(hào)通路相關(guān)[5]。如生長素輸入載體OsAUX1[6]，生長素信號(hào)負(fù)調(diào)控因子IAA基因OsIAA3[7]、OsIAA11[8]和OsIAA13[9]，生長素輸出載體OsPIN2[10]等。OsAUX1的T-DNA插入突變體和RNAi敲除轉(zhuǎn)基因植株側(cè)根的起始均減弱[6]；OsIAA3基因的突變體對(duì)生長素不敏感，側(cè)根數(shù)量顯著減少[7]；OsIAA11基因突變后中柱鞘細(xì)胞分裂缺陷，阻斷了側(cè)根原基的起始[8]；OsIAA13控制水稻側(cè)根啟動(dòng)，突變體Osiaa13側(cè)根數(shù)量顯著減少[9]；OsPIN2通過調(diào)控生長素分布參與側(cè)根形成[10]。此外，水稻復(fù)制起始識(shí)別復(fù)合體亞族基因OsORC3[11]、銨轉(zhuǎn)運(yùn)體OsAMT1[12]、肌醇多磷酸激酶OsIPK2[13]、親環(huán)蛋白基因OsCYP2[14]等都對(duì)水稻側(cè)根的起始發(fā)育起著重要作用。還有少數(shù)水稻側(cè)根突變體如RM109[15]、hts1[16]和k209[17]的基因尚未克隆。

本研究以從甲基磺酸乙酯(ethyl methyl sulfonate, EMS)誘變的秈稻品種Kasalath突變體庫中篩選得到的側(cè)根突變體Oslrd2(Oryzasativalateralrootdefective2)為材料，對(duì)其進(jìn)行表型和遺傳分析、圖位克隆、候選基因測(cè)序及轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)驗(yàn)證，旨在為深入解析水稻側(cè)根發(fā)生發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從EMS誘變的秈稻(indica)地方品種Kasalath突變體庫(種子來源：寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)中篩選獲得水稻側(cè)根突變體Oslrd2，連續(xù)自交得到穩(wěn)定遺傳的純合株系。將Oslrd2突變體和粳稻野生型品種Nipponbare(種子來源：寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)雜交，F(xiàn)1代自交產(chǎn)生的F2代用于遺傳分析和圖位克隆。在所有的溶液培養(yǎng)試驗(yàn)中，植物生長環(huán)境由溫室控制，具體條件為：12 h光照周期(30℃)/12 h黑暗周期(22℃)、光照強(qiáng)度3 000 lux、相對(duì)濕度70%。

1.2 表型分析

野生型(wild type, WT)與突變體幼苗使用《國際水稻所標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液配方》[18]進(jìn)行溶液培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)7 d的幼苗進(jìn)行表型測(cè)量，包括主根長、苗高、不定根長、側(cè)根數(shù)和側(cè)根長，對(duì)野生型及突變體分別隨機(jī)統(tǒng)計(jì)10株。

將溶液培養(yǎng)21 d的水稻幼苗轉(zhuǎn)移至大田土培，待成熟時(shí)選取生長狀況良好且無病害的野生型和突變體，對(duì)全株拍照，并記錄株高、分蘗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)等農(nóng)藝性狀，對(duì)野生型及突變體分別隨機(jī)統(tǒng)計(jì)10株。

1.3 側(cè)根原基形成的觀察

取溶液培養(yǎng)3 d的野生型和突變體Oslrd2主根，參考Wang等[19]的方法進(jìn)行亞甲基藍(lán)染色：將切下的根固定在4℃的無水乙醇∶冰醋酸(3∶1，v/v)溶液中24 h以上，取出后用蒸餾水沖洗5 min，用0.01%的亞甲基藍(lán)對(duì)根進(jìn)行染色。體視鏡觀察側(cè)根原基的發(fā)生情況。

取溶液培養(yǎng)5 d的野生型和突變體Oslrd2主根，按照以下方法進(jìn)行解剖觀察：蒸餾水沖洗后，截取主根伸長區(qū)到成熟區(qū)的區(qū)段，用解剖針剝?nèi)ケ砥ず痛蟛糠制?，使?cè)根原基顯露出來。將處理后的根系置于載玻片上，添加一滴水合氯醛透明劑(4 g水合三氯乙醛、1 mL甘油、2 mL H2O)，蓋上蓋玻片于顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.4 突變基因的圖位克隆

1.4.1 分子標(biāo)記的選擇和設(shè)計(jì) 根據(jù)Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)中已公布的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)分子標(biāo)記，選擇水稻12條染色體上的多態(tài)性SSR引物，對(duì)OsLRD2突變基因進(jìn)行初定位。確定突變基因所在染色體大致位置后，逐步擴(kuò)大群體，以粳稻Nipponbare和秈稻Kasalath間的序列差異為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)該區(qū)間內(nèi)具有多態(tài)性的插入缺失標(biāo)記(insertion-deletion, InDel)，進(jìn)行精細(xì)定位。

1.4.2 基因定位 取Kasalath、Nipponbare、F1和F2分離群體的水稻葉片，使用水稻基因組DNA快速微量提取法(TPS法)[20]提取DNA。篩選F2分離群體具有側(cè)根突變性狀株系的DNA，后通過PCR擴(kuò)增靶基因。PCR總體系為20 μL：2×Es Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 7.0 μL，10 μmol·L-1上游引物1.0 μL，10 μmol·L-1下游引物1.0 μL，模板DNA 1.0 μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。再用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，通過硝酸銀染色后鑒定帶型，分析突變位點(diǎn)和分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系，驗(yàn)證疑似連鎖的標(biāo)記。根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/)和EST數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析定位區(qū)間內(nèi)的候選基因，測(cè)序驗(yàn)證其突變位點(diǎn)。

1.5 轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)驗(yàn)證

根據(jù)OsLRD2基因編碼區(qū)序列(coding sequence, CDS)，設(shè)計(jì)分別包括XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線表示)的上下游引物：OsLRD2-F(5′-A A AG G T A C CC G C C A T G A G G G A G T G C AT-3′)和OsLRD2-R(5′-A A AT C T A G AA G A T A G A A G C C C A C A C G G A C AG-3′)。以野生型葉片的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR總體系為50 μL：2×PCR buffer for KOD FX 25 μL，ddH2O 10 μL，2 mmol·L-1dNTPs 10 μL，10 μmol·L-1上游引物1.5 μL，10 μmol·L-1下游引物1.5 μL，模板DNA 1.0 μL，1.0 unit·μL-1KOD FX DNA Polymerase 1.0 μL。PCR程序：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；68℃終延伸5 min。將擴(kuò)增得到的CDS片段與超表達(dá)載體pCAMBIA1300連接，通過農(nóng)桿菌將已構(gòu)建好的超表達(dá)載體導(dǎo)入突變體Oslrd2成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織中，經(jīng)過植物組織培養(yǎng)分化成苗。選擇生長情況良好且根系表型正常的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繁種，獲得純合株系后進(jìn)行表型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體Oslrd2的表型鑒定

對(duì)培育7 d的野生型(WT)和突變體Oslrd2幼苗進(jìn)行表型觀察(表1)，發(fā)現(xiàn)Oslrd2的地上部和根系發(fā)育均存在缺陷，苗高只有野生型的45.52%(圖1-A)，主根和不定根的長度都受到明顯抑制，分別只有野生型的73.65%和51.34%(圖1-B)。Oslrd2側(cè)根的生長存在嚴(yán)重缺陷，體視鏡觀察并測(cè)量發(fā)現(xiàn)Oslrd2的側(cè)根長度只有野生型的9.04%(圖1-C～D、表1)，側(cè)根數(shù)目也極顯著減少，只有野生型的36.49%。

注：A：WT和突變體Oslrd2全株表型，標(biāo)尺為2 cm；B：WT和突變體Oslrd2根部表型，標(biāo)尺為2 cm；C：WT主根的體視鏡照，標(biāo)尺為1 mm；D：突變體Oslrd2主根的體視鏡照，標(biāo)尺為1 mm。Note: A: Seedlings of the WT and Oslrd2, bar=2 cm. B: The root of the WT and Oslrd2, bar=2 cm. C: The primary root of the WT under the stereoscope, bar=1 mm. D: The primary root of Oslrd2 under the stereoscope, bar=1 mm.圖1 野生型和突變體Oslrd2水培7 d幼苗表型Fig.1 The phenotype of 7-day-old hydroponic seedlings of the WT and mutant Oslrd2

進(jìn)一步通過亞甲基藍(lán)染色方法對(duì)生長3 d的側(cè)根原基進(jìn)行觀察(圖2-A、B)，發(fā)現(xiàn)突變體Oslrd2側(cè)根原基的數(shù)量較野生型明顯減少，只有野生型的63.40%(圖2-C)，表明Oslrd2側(cè)根數(shù)目的減少與側(cè)根原基發(fā)生相關(guān)。

表1 野生型和突變體Oslrd2水培7 d幼苗表型比較Table 1 Characteristics of 7-day-old hydroponic seedlings of the WT and mutant Oslrd2

2.2 突變體Oslrd2側(cè)根原基的解剖觀察

通過解剖學(xué)方法對(duì)野生型和突變體Oslrd2生長5 d的側(cè)根原基進(jìn)行觀察(圖3-A、B)。野生型的側(cè)根原基在整個(gè)發(fā)育過程中細(xì)胞排列較為緊密，細(xì)胞大小均一，連貫性較好，且較為圓潤(圖3-A)；而突變體Oslrd2的側(cè)根原基隨著發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)，形狀逐漸不規(guī)則，膨脹較為明顯，形成側(cè)根的直徑比野生型粗，側(cè)根原基的細(xì)胞排列混亂(圖3-B)，側(cè)根的伸長受到明顯抑制。

2.3 突變體Oslrd2的農(nóng)藝性狀分析

比較成熟期農(nóng)藝性狀可知，Oslrd2的株高只有野生型的52.97%(圖4-A、C、E)，葉片寬度明顯變窄(圖4-B)；有效穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)和千粒重都顯著或極顯著降低，分別為野生型的26.09%、30.08%和85.21%(圖4-E)；突變體種子長度與野生型相比無明顯差別，但寬度較野生型窄(圖4-D)。

2.4 突變體Oslrd2的遺傳分析

表2 突變體Oslrd2的遺傳分析Table 2 Genetic analysis of mutant Oslrd2

注：A：3 d苗齡的WT側(cè)根原基形成圖，標(biāo)尺為1 mm；B：3 d苗齡的突變體Oslrd2側(cè)根原基形成圖，標(biāo)尺為1 mm。C：WT和突變體Oslrd2側(cè)根原基數(shù)比較。*表示在0.05水平上差異顯著； **表示在0.01水平上差異極顯著。Note: A: Lateral root primordia formation of 3-day-old WT, bar=1 mm. B: Lateral root primordia formation of 3-day-old Oslrd2, bar=1 mm. C: Comparison of lateral root primordia between the WT and Oslrd2. * indicate significant difference at 0.05 level. ** indicate significant difference at 0.01 level.圖2 野生型和突變體Oslrd2水培3 d幼苗的側(cè)根原基觀察Fig.2 Lateral root primordia of 3-day-old hydroponic WT and mutant Oslrd2 seedlings

2.5 OsLRD2基因的圖位克隆

利用Kasalath、Nipponbare、F1和F2分離群體，通過水稻12條染色體上均勻分布的SSR引物對(duì)OsLRD2基因進(jìn)行初步定位，將突變基因定位在第11條染色體上SSR標(biāo)記RM120與RM3701之間。在此區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)4對(duì)多態(tài)性的InDel標(biāo)記(InDel 1～4，附表1)，同時(shí)擴(kuò)大群體到1 330個(gè)，最終將突變基因鎖定在InDel 3和InDel 4之間約10 kb的區(qū)間內(nèi)(圖5-A)。候選基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，基因號(hào)為LOC_Os11g14220的CDS序列中1 176 bp處(位于第4個(gè)外顯子)缺失了一個(gè)胞嘧啶(C)以及在1 179 bp處的胞嘧啶(C)突變?yōu)橄汆堰?A)(圖5-B)，導(dǎo)致氨基酸序列中第392位的天冬氨酸(D)變成了谷氨酸(E)和第393位的異亮氨酸(Ⅰ)變成終止密碼子TAA，導(dǎo)致翻譯提前終止(圖5-C)，編碼產(chǎn)物只有392個(gè)氨基酸。LOC_Os11g14220基因編碼α-微管蛋白，DNA全長2 885 bp，CDS全長1 356 bp，編碼451個(gè)氨基酸，含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。經(jīng)過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：Tubulin和Tubulin_C(圖5-C)，其中的Tubulin屬于Tubulin/FtsZ 家族的GTP酶結(jié)構(gòu)域，在第49～第246位氨基酸區(qū)間，是核苷酸結(jié)合位置。Tubulin_C屬于Tubulin/FtsZ家族的C末端結(jié)構(gòu)域，包含第248～第393位氨基酸區(qū)間，是微管結(jié)合蛋白結(jié)合的位置，突變體Oslrd2的突變位點(diǎn)在此結(jié)構(gòu)域中。

注：A：5 d苗齡的WT側(cè)根原基，A1～3為未突破主根表皮的側(cè)根原基，A4為側(cè)根原基頂端剛剛突破主根表皮，A5為開始伸長的側(cè)根，標(biāo)尺為100 μm；B：5 d苗齡的突變體Oslrd2側(cè)根原基，B1～3為未突破主根表皮的側(cè)根原基，B4為側(cè)根原基頂端剛剛突破主根 表皮，B5為開始伸長的側(cè)根，標(biāo)尺為100 μm。Note: A: Lateral root primordia at 5-day-old WT. A1～3 are the lateral root primordia that have not broken through the primary root epidermis, A4 is the lateral root primordium whose top just broke through the primary root epidermis, A5 is the lateral root that begins to elongate, bar=100 μm. B： Lateral root primordia of 5-day-old Oslrd2, B1～B3 are the lateral root primordia that have not broken through the primary root epidermis, B4 is the lateral root primordium whose top just broke through the primary root epidermis, B5 is the lateral root that begins to elongate, bar=100 μm.圖3 野生型和突變體Oslrd2的側(cè)根原基形態(tài)觀察Fig.3 Morphology of lateral root primordia in the WT and mutant Oslrd2

注：A：WT和突變體Oslrd2水培50 d地上部表型；B：WT和突變體Oslrd2水培50 d葉片表型；C：WT和突變體Oslrd2大田成熟全株，標(biāo)尺為15 cm；D：WT和突變體Oslrd2種子形態(tài)比較；E：WT和突變體Oslrd2成熟期農(nóng)藝性狀比較。*表示在0.05水平上差異顯著；**表示在0.01水平 上差異極顯著。Note: A: The aboveground part of 50-day-old hydroponic WT and Oslrd2 seedlings. B: The leaf of 50-day-old hydroponic WT and Oslrd2 seedlings. C: Mature plants of the WT and Oslrd2 cultivated in soil, bar=15 cm. D: Seeds of WT and Oslrd2, bar=1 cm. E: Agronomic traits of the WT and Oslrd2 at the maturation stage. * indicate significant difference at 0.05 level. ** indicate significant difference at 0.01 level.圖4 野生型和突變體Oslrd2成熟期表型Fig.4 The phenotype of the WT and mutant Oslrd2 at the maturation stage

注：A：OsLRD2在11號(hào)染色體上的精細(xì)定位；B：OsLRD2基因結(jié)構(gòu)，黑框代表外顯子；C：OsLRD2結(jié)構(gòu)功能域，黑色框代表結(jié)構(gòu)域，白色框代表盤繞線圈區(qū)域。Note: A: The fine mapping of OsLRD2 on chromosome 11. B: The gene structure of OsLRD2, black boxes represent exons. C: The structure and functional domain of OsLRD2, black boxes represent domain, and the white box represents Coiled-coil region.圖5 OsLRD2基因的圖位克隆Fig.5 The map-based cloning of OsLRD2

2.6 OsLRD2基因的互補(bǔ)驗(yàn)證分析

為了進(jìn)一步證明突變體的突變表型是由OsLRD2基因突變導(dǎo)致的，對(duì)突變體Oslrd2進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因回復(fù)驗(yàn)證。構(gòu)建的含有OsLRD2基因的超表達(dá)載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染突變體Oslrd2誘導(dǎo)的愈傷組織并成功獲得轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系，經(jīng)過繁種并篩選獲得純合植株，純合的轉(zhuǎn)基因水稻的地上部和根系表型與野生型一致(圖6-A)，體視鏡觀察側(cè)根數(shù)目和長度均為正常(圖6-B)。逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)分析結(jié)果表明，陽性轉(zhuǎn)基因植株中OsLRD2基因的表達(dá)增強(qiáng)(圖6-C)。上述結(jié)果證明突變體Oslrd2的突變表型是由OsLRD2的突變引起的。

注：A：WT、突變體Oslrd2和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系(Comp1、Comp2)的全株表型，標(biāo)尺為2 cm；B：WT、突變體Oslrd2和兩個(gè)轉(zhuǎn) 基因回復(fù)株系(Comp1、Comp2)主根的體視鏡照，標(biāo)尺為1 mm；C：RT-PCR分析結(jié)果。Note: A: Seedlings of the WT, Oslrd2, and two lines of transgenic plants (Comp1 and Comp2) in the Oslrd2 mutant background, bar=2 cm. B: The primary root of the WT, Oslrd2, and two lines of transgenic plants(Comp1 and Comp2) under the stereoscope, bar=1 mm. C: RT-PCR analysis result.圖6 OsLRD2 轉(zhuǎn)基因回復(fù)結(jié)果Fig.6 Transgenic complementation analysis of Oslrd2 result

3 討論

微管(microtubules, MTs)是細(xì)胞骨架的核心組成部分，參與細(xì)胞的形狀構(gòu)成、運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)和分裂[21]。MTs是真核細(xì)胞骨架的主要組成部分，由α和β微管蛋白異質(zhì)二聚體組成，在聚合和解聚合之間相互轉(zhuǎn)換[22]。微管束形成是真核生物間期和有絲分裂微管系統(tǒng)有序排列的重要機(jī)制[23]。在植物生長發(fā)育過程中，MTs參與植物生長和形態(tài)建成的控制和重構(gòu)[24]。雖然MTs的基本結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)特性在真核生物中是保守的，但植物已經(jīng)進(jìn)化出幾種獨(dú)特的微管系統(tǒng)控制植物特異的細(xì)胞分裂和擴(kuò)張方式，從而影響細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和分化[25-26]。本研究克隆的OsLRD2基因編碼一個(gè)α-微管蛋白，該基因突變后造成水稻側(cè)根原基的細(xì)胞排列混亂，側(cè)根的伸長受到明顯抑制(圖3)；此外，葉片和種子寬度均變窄(圖4-B、D)。表明α-微管蛋白參與水稻細(xì)胞分裂過程，控制細(xì)胞膨脹的方向，在細(xì)胞擴(kuò)張生長過程中起重要作用。

在水稻中，已報(bào)道的α-微管蛋白基因的功能研究較少。目前已有研究如水稻TID1基因[27]編碼α-微管蛋白，突變體Tid1-1表現(xiàn)為矮化和扭曲生長，葉片和莖呈螺旋狀生長，莖尖分生組織細(xì)胞數(shù)量增加，根細(xì)胞伸長受抑制，根尖分生組織細(xì)胞擴(kuò)大，根部縮短；SRS5[28]編碼的α-微管蛋白調(diào)控了水稻種子細(xì)胞的伸長，突變體srs5與野生型相比，種子更短更圓，穗更短且植株表型半矮化；Liu等[29]通過CRISPR基因編輯技術(shù)對(duì)α-微管蛋白同源基因OsTubA2進(jìn)行精確堿基編輯，形成一個(gè)點(diǎn)突變，突變后的水稻植株具有二硝基苯胺類除草劑抗性。

通過分析發(fā)現(xiàn)，上述三種α-微管蛋白基因TID1、SRS5、OsTubA2和本研究中的OsLRD2為同一個(gè)基因位點(diǎn)，但突變方式和對(duì)應(yīng)性狀不同。TID1基因編碼的蛋白第56個(gè)氨基酸由蘇氨酸(T)突變?yōu)楫惲涟彼?I)和第180個(gè)氨基酸由絲氨酸(S)突變?yōu)楸奖彼?F)都造成水稻葉片螺旋生長[27]。SRS5編碼的第308位氨基酸由精氨酸(R)突變?yōu)榱涟彼?L)，導(dǎo)致外稃細(xì)胞長度減少，種子表現(xiàn)為小而圓[28]。TID1和SRS5都為單一氨基酸改變，本研究克隆的OsLRD2涉及多個(gè)氨基酸改變，其中第392位的天冬氨酸(D)突變?yōu)楣劝彼?E)和第393位的異亮氨酸(I)突變?yōu)榻K止密碼子(圖5-C)。OsLRD2突變后嚴(yán)重影響側(cè)根原基發(fā)生和側(cè)根伸長(圖1)，但突變體Oslrd2的葉片正常，未出現(xiàn)螺旋生長的表型(圖4-B)，其種子長度正常，寬度變窄(圖4-D)。以上結(jié)果表明α-微管蛋白基因的不同突變方式，會(huì)造成水稻不同的性狀改變。

目前水稻側(cè)根發(fā)育的分子生物學(xué)研究已取得較大進(jìn)展，但對(duì)水稻側(cè)根的發(fā)生和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。本研究對(duì)Oslrd2的表型和遺傳分析、圖位克隆、候選基因測(cè)序及轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)驗(yàn)證等試驗(yàn)證明OsLRD2基因所編碼的α-微管蛋白是水稻側(cè)根起始生長和伸長所必需的。本研究為α-微管蛋白調(diào)控水稻生長發(fā)育的作用機(jī)制提供了一個(gè)新的認(rèn)識(shí)。

4 結(jié)論

本研究從水稻側(cè)根突變體Oslrd2中克隆得到一個(gè)編碼α-微管蛋白的OsLRD2基因。通過亞甲基藍(lán)染色和解剖觀察發(fā)現(xiàn)突變體Oslrd2側(cè)根原基數(shù)目減少，且原基和側(cè)根的形態(tài)發(fā)生膨脹變形，表明OsLRD2突變抑制了水稻側(cè)根原基的發(fā)生和側(cè)根突破表皮，導(dǎo)致側(cè)根數(shù)目減少以及長度變短。成熟期農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，突變體Oslrd2的株高、有效穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重等重要的農(nóng)藝性狀都受到影響，表明OsLRD2基因與水稻產(chǎn)量密切相關(guān)。

附表1 用于OsLRD2基因定位的分子標(biāo)記序列Supplementary table 1 Molecular markers and primers used to map OsLRD2