E-cadherin在牦牛不同繁殖周期輸卵管不同部位中的表達(dá)與定位

楊珊珊 何翃閎 劉敏清 趙 凌 王靖雷 余四九 蔡得琪 潘陽(yáng)陽(yáng),*

(1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2甘肅省金昌市金川區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 甘肅 金昌 737100)

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高寒低氧地區(qū)的珍稀高原物種，與藏民的生產(chǎn)生活密切相關(guān)[1-2]。它以極強(qiáng)的生命力和適應(yīng)性豐富著青藏高原地區(qū)的物質(zhì)和文化生活[3-4]。但牦牛是一種季節(jié)性繁殖動(dòng)物，其繁殖能力低下，因此了解雌性牦牛生殖器官的分子生物學(xué)特性，可進(jìn)一步提高牦牛的繁殖率。在哺乳動(dòng)物中，輸卵管可發(fā)揮卵子攝取、精子儲(chǔ)存和獲能、受精以及受精卵發(fā)育和運(yùn)輸?shù)纫幌盗杏幸?guī)律的生物學(xué)功能，從而保證妊娠正常進(jìn)行[5-6]。輸卵管可根據(jù)其形態(tài)特征分為傘部、壺腹部和峽部，其中每一部分都參與特定的生理活動(dòng)。輸卵管傘部的主要功能是拾卵，壺腹部和峽部則有利于卵子、精子在輸卵管中順利轉(zhuǎn)運(yùn)及融合。卵子通過(guò)纖毛細(xì)胞的擺動(dòng)和管壁的收縮運(yùn)行至壺腹部，最終與獲能的精子相遇并發(fā)生結(jié)合[7-8]。因此，輸卵管整體為受精和胚胎早期的正常發(fā)育提供了良好的環(huán)境[9]。在哺乳動(dòng)物輸卵管中精子和卵子的運(yùn)送與結(jié)合依賴(lài)于母體分泌的蛋白和調(diào)節(jié)因子，因此鑒定與精卵相互作用有關(guān)的蛋白質(zhì)可幫助了解受精的分子基礎(chǔ)，從而有助于提高牦牛的繁殖性能[10]。

上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)為Ca2+依賴(lài)性單鏈跨膜糖蛋白，包含5個(gè)由110個(gè)氨基酸組成的胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)高度保守的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過(guò)適配器蛋白(如β-連環(huán)蛋白)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用，可介導(dǎo)鈣依賴(lài)性細(xì)胞間粘附[11]。E-cadherin主要分布在上皮細(xì)胞表面，介導(dǎo)同種或異種細(xì)胞間的粘附，參與形成和維護(hù)正常細(xì)胞間的連接，其在胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化以及成體組織結(jié)構(gòu)的維持中起著關(guān)鍵作用[12-13]。早期有研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin在人[14-15]和奶牛[16]的卵母細(xì)胞、精子、輸卵管上皮和子宮上皮中均有表達(dá)。另外，E-cadherin在大鼠配子中也有表達(dá)[17]。對(duì)與輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的精子中E-cadherin進(jìn)行重新定位后發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在輸卵管-精子庫(kù)的組裝或拆卸中發(fā)揮作用[18]。通過(guò)敲除E-cadherin的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，缺失E-cadherin的突變胚胎不能形成滋養(yǎng)層上皮[19]。Ideta等[20]研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin可參與配子的交互作用，也可促進(jìn)上皮細(xì)胞之間的選擇性粘附，并參與早期胚胎與子宮內(nèi)膜上皮的初步粘附。同時(shí)，針對(duì)功能的研究指出E-cadherin參與精卵的相互作用及精卵與女性生殖上皮細(xì)胞之間的粘附，從而促進(jìn)輸卵管受精[21-22]。此外，有研究證實(shí)E-cadherin可能與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，在發(fā)情周期調(diào)節(jié)配子或囊胚與輸卵管或子宮上皮之間的相互作用，提高細(xì)胞間粘附力，從而有助于配子在輸卵管中正常發(fā)育[23]。

綜上所述，E-cadherin對(duì)精卵的相互作用及早期的胚胎發(fā)育具有重要作用。然而，該蛋白在牦牛不同繁殖周期輸卵管不同部位的表達(dá)研究在國(guó)內(nèi)外尚鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以牦牛輸卵管為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)、蛋白免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法對(duì)E-cadherin基因及蛋白在牦牛不同繁殖周期輸卵管中不同部位的表達(dá)和定位進(jìn)行研究，為E-cadherin在牦牛不同繁殖周期輸卵管中的作用研究提供先決條件，從而為進(jìn)一步探討E-cadherin在牦牛生殖過(guò)程中發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取無(wú)臨床病理表現(xiàn)的卵泡期、黃體期和妊娠期母牦牛(3～6歲)各6頭(樣品采于青海省西寧市百德屠宰場(chǎng))，頸動(dòng)脈放血處死，并分別采取卵泡期后期(有優(yōu)勢(shì)卵泡>6 mm)、黃體期后期(可見(jiàn)多個(gè)黃體)同側(cè)以及妊娠期早期(胚胎約長(zhǎng)2～3 cm)妊娠側(cè)[24]的輸卵管傘部、壺腹部和峽部樣品，并用0.9%生理鹽水沖洗數(shù)次，一部分用錫箔紙包裹作為組織樣品放進(jìn)有標(biāo)記的布袋中，置于液氮中4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?；另一部分置?%多聚甲醛溶液中固定，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

E-cadherin(4A2)mouse mAb(#14472)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell SignalinGTechnology公司；二抗(Goat Anti-Mouse IgG/HRP)、Mo a beta-Actin(bsm-33 036M)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TransZol試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Go ScriptTMReverse Transcription System)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；蛋白裂解液購(gòu)自北京索萊寶公司；GoTaq?Green Master Mix 2×購(gòu)自美國(guó)Promega公司；BeyoEcl曝光液購(gòu)自中國(guó)Beyotime公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自日本寶生物公司；陽(yáng)離子防脫片購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；T100TMThermal Cycler PCR儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司；LighTCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士Roche公司；DP71顯微照相裝置購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 E-cadherin基因的表達(dá)檢測(cè)

參照GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索牛E-cadherin基因(NM_001002763.1)和牦牛β-actin基因(DQ838049.1)的mRNA序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)E-cadherin和β-actin的引物(引物信息見(jiàn)表1)(E-cadherin引物濃度為10 μmol·L-1；β-actin引物濃度為10 μmol·L-1)，引物序列均在上海生工基因科技有限公司合成。將保存于-80℃的卵泡期、黃體期和妊娠期的牦牛輸卵管不同部位的組織研成粉末狀并稱(chēng)量0.1 g后裝入標(biāo)記好的無(wú)RNA酶的EP管中，用TransZol試劑盒法提取總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟于PCR儀中將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并保存于-20℃?zhèn)溆?。將卵泡期、黃體期和妊娠期輸卵管分別按照傘部、壺腹部和峽部分為9組，每組3個(gè)復(fù)孔，分別為待測(cè)孔、內(nèi)參對(duì)照孔和空白對(duì)照孔，以cDNA為模板，E-cadherin基因和β-actin基因?yàn)橐镞M(jìn)行qRT-PCR的擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為20 μL：cDNA 1 μL、上下游引物各0.8 μL、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL、無(wú)菌去離子水7.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)4次，根據(jù)每個(gè)樣品的循環(huán)定量值(Cq)，經(jīng)2-ΔΔCt法計(jì)算E-cadherin基因在牦牛不同繁殖時(shí)期輸卵管不同部位中的相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列Table 1 Primer sequences of targeTGene and housekeepinGGene

1.4 E-cadherin蛋白表達(dá)檢測(cè)

將-80℃保存的卵泡期、黃體期和妊娠期牦牛輸卵管傘部、壺腹部和峽部的組織樣品低溫研磨成粉末，并稱(chēng)取0.1 g并加入裂解液[1 mL高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(radio immunoprecipitation assay, RIPA)]+[10 μL苯甲基磺酰氟(phenylm methane sulfonyl fluoride, PMSF)]，渦旋后在冰上裂解2 h、4℃，1 500 r·min-1離心5 min后吸取上清，提取總蛋白于-80℃保存。將卵泡期、黃體期和妊娠期牦牛輸卵管傘部、壺腹部和峽部的蛋白樣品與4×蛋白上樣緩沖液按照3∶1的比例配置蛋白工作液，金屬浴變性(100℃，10 min)，冰上靜置5 min。制備好聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)并進(jìn)行電泳分離；將依次按照濾紙、膠、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜、濾紙從下到上的順序?qū)⑵涔潭ㄓ谵D(zhuǎn)膜夾上，并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h；一抗[E-cadherin(4A2)mouse mAb∶PBST=1∶1 000；Mo a beta-Actin∶PBST=1∶1 000]孵育在4℃環(huán)境中過(guò)夜，PBST清洗3次，每次5 min；二抗(Goat Anti-Mouse IgG/HRP∶PBST=1∶1 000)孵育2 h，PBST清洗5次，每次5 min；在膜上滴加電化學(xué)發(fā)光液(electro-chemi-luminescence, ECL)進(jìn)行條帶曝光顯影，試驗(yàn)重復(fù)3次，并用ImageJ軟件掃描蛋白印跡條帶進(jìn)行圖像分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5 免疫組織化學(xué)法對(duì)E-cadherin蛋白進(jìn)行定位

取多聚甲醛中充分固定好的不同繁殖周期輸卵管傘部、壺腹部和峽部組織塊樣品，根據(jù)常規(guī)方法制作4 μm石蠟切片貼附于包被過(guò)的切片上，下行酒精脫蠟至水，蒸餾水清洗5 min，PBS浸泡5 min。將切片置于0.1 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液中抗原修復(fù)，高溫加熱8 min至沸騰后轉(zhuǎn)中高溫加熱12 min，待其冷卻至室溫。滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑(3% H2O2溶液)于組織上進(jìn)行阻斷，37℃烘箱中孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。滴加正常山羊血清工作液(SP試劑盒A液)于組織上進(jìn)行封閉，室溫作用15 min。添加一抗[E-cadherin(4A2)mouse mAb∶PBS=1∶100]孵育，陰性對(duì)照組用PBS代替一抗工作液，在4℃環(huán)境中過(guò)夜，陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照組分開(kāi)清洗，PBS清洗3次，每次3 min。添加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(SP試劑盒B液)孵育，37℃烘箱孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。添加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(SP試劑盒C液)孵育，37℃烘箱孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。DAB顯色液適度顯色，自來(lái)水沖洗10 min終止顯色，蒸餾水浸泡5 min。蘇木精復(fù)染2 min并通過(guò)鹽酸酒精分化10 s。上行酒精脫水透明，樹(shù)脂封片，待晾干用顯微鏡照相。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，分析不同繁殖周期輸卵管不同部位中E-cadherin基因及蛋白的表達(dá)差異，相對(duì)表達(dá)水平為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SE)表示，每組至少3個(gè)重復(fù)。P>0.05為差異不顯著，0.01≤P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 E-cadherin基因的表達(dá)情況

普通PCR試驗(yàn)結(jié)果表明，E-cadherin基因和β-actin基因產(chǎn)物條帶單一并無(wú)二聚體，驗(yàn)證了引物E-cadherin基因和β-actin基因的特異性良好(圖1)。通過(guò)對(duì)qRT-PCR的Cq值進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在卵泡期和妊娠期，E-cadherin基因在輸卵管壺腹部的表達(dá)量最高，顯著高于傘部；而在黃體期，E-cadherin基因在輸卵管峽部的表達(dá)量最高，顯著高于傘部和壺腹部。在輸卵管傘部，E-cadherin基因在黃體期的表達(dá)量最高，顯著高于卵泡期和妊娠期；在輸卵管壺腹部，E-cadherin基因在妊娠期的表達(dá)量最高，顯著高于卵泡期和黃體期；在輸卵管峽部，E-cadherin基因在黃體期的表達(dá)量最高，顯著高于卵泡期和妊娠期(圖2)。

注：M：DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：卵泡期輸卵管傘部；2：卵泡期輸卵管壺腹部；3：卵泡期輸卵管峽部；4：黃體期輸卵管傘部； 5：黃體期輸卵管壺腹部；6：黃體期輸卵管峽部；7：妊娠期輸卵管傘部；8：妊娠期輸卵管壺腹部；9：妊娠期輸卵管峽部。Note: M: D2000 DNA marker. 1: Oviduct umbrella durinGThe follicular phase. 2: Oviduct ampulla durinGThe follicular phase. 3: Oviduct isthmus durinGThe follicular phase. 4: Oviduct umbrella durinGThe luteal phase. 5: Oviduct ampulla durinGThe luteal phase. 6: Oviduct isthmus durinGThe luteal phase. 7: Oviduct umbrella durinGThe pregnant phase. 8: Oviduct ampulla durinGThe pregnant phase. 9: Oviduct isthmus durinGThe pregnant phase.圖1 E-cadherin和β-actin基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results for E-cadherin and β-actin genes

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖2 牦牛E-cadherin基因在不同繁殖周期輸卵管不同部位中的表達(dá)差異Fig.2 Differential expression of E-cadherin gene in different parts of the oviduct at different reproduction cycles of yak

2.2 E-cadherin蛋白的表達(dá)情況

Western-blotting試驗(yàn)分析結(jié)果顯示，E-cadherin蛋白在不同時(shí)期輸卵管的不同部位均有表達(dá)且存在差異(圖3)。在卵泡期和妊娠期，E-cadherin蛋白在輸卵管壺腹部的表達(dá)量最高，顯著高于傘部和峽部；在黃體期，E-cadherin蛋白在輸卵管峽部的表達(dá)量最高，顯著高于傘部和壺腹部。在輸卵管傘部，E-cadherin 蛋白在卵泡期的表達(dá)量最高，顯著高于黃體期和妊娠期；在輸卵管壺腹部，E-cadherin蛋白在妊娠期的表達(dá)量最高，顯著高于卵泡期和黃體期；在輸卵管峽部，E-cadherin蛋白在黃體期的表達(dá)量最高，顯著高于卵泡期和妊娠期(圖4)。

注：1：卵泡期輸卵管傘部；2：卵泡期輸卵管壺腹部；3：卵泡期輸卵管峽部；4：黃體期輸卵管傘部；5：黃體期輸卵管壺腹部；6：黃體期輸卵管峽部；7：妊娠期輸卵管傘部；8：妊娠期輸卵管壺腹 部；9：妊娠期輸卵管峽部。Note: 1: Oviduct umbrella durinGThe follicular phase. 2: Oviduct ampulla durinGThe follicular phase. 3: Oviduct isthmus durinGThe follicular phase. 4: Oviduct umbrella durinGThe luteal phase. 5: Oviduct ampulla durinGThe luteal phase. 6: Oviduct isthmus durinGThe luteal phase. 7: Oviduct umbrella durinGThe pregnant phase. 8: Oviduct ampulla durinGThe pregnant phase. 9: Oviduct isthmus durinGThe pregnant phase.圖3 E-cadherin和β-actin蛋白的免疫蛋白印跡條帶Fig.3 The Western-blotting bands of E-cadherin and β-actin proteins

2.3 E-cadherin蛋白的定位

免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在輸卵管中均有分布，在卵泡期、黃體期和妊娠期，E-cadherin主要在輸卵管傘部、壺腹部和峽部的纖毛細(xì)胞、分泌細(xì)胞、基細(xì)胞、肌層和漿液腺中有表達(dá)(圖5-a～i)；陰性對(duì)照試驗(yàn)未見(jiàn)棕褐色陽(yáng)性表達(dá)(圖5-j～l)。

3 討論

圖4 牦牛E-cadherin蛋白在不同繁殖周期輸卵管不同部位中的表達(dá)差異Fig.4 Differential expression of E-cadherin protein in different parts of the oviduct at different reproduction cycles of yak

注：a：卵泡期輸卵管傘部；b：卵泡期輸卵管壺腹部；c：卵泡期輸卵管峽部；d：黃體期輸卵管傘部；e：黃體期輸卵管壺腹部；f：黃體期輸卵管峽部；g：妊娠期輸卵管傘部；h：妊娠期輸卵管壺腹部；i：妊娠期輸卵管峽部；j：輸卵管傘部陰性對(duì)照；k：輸卵管壺腹部陰性對(duì)照；l：輸卵管峽部陰性對(duì)照。LP：固有層；TM：肌層；EP：黏膜上皮；P：初級(jí)皺襞；S：次級(jí)皺襞；C：纖毛細(xì)胞。黑色五角星：分泌細(xì)胞；黑色 細(xì)箭頭：基細(xì)胞；黑色三角形：漿液腺。Note: a: Tubal umbrella durinGThe follicular phase. b: Tubal ampulla durinGThe follicular phase. c: Tubal isthmus durinGThe follicular phase. d: Tubal umbrella durinGThe luteal phase. e: Tubal ampulla durinGThe luteal phase. f: Tubal isthmus durinGThe luteal phase. g: Tubal umbrella durinGThe pregnant phase. h: Tubal ampulla durinGThe pregnant phase. i: Tubal isthmus durinGThe pregnant phase. j: Tubal umbrella negative control. k: Tubal ampulla negative control. l: Tubal isthmus negative control. LP: Lamina propria. TM: Muscular layer. EP: Mucosal epithelium. P: Primary wrinkles. S: Secondary wrinkles. C: Ciliated cell. Black five-pointed star: Secretory cell. Black thin arrow: Basal cell. Black triangle: Serous gland.圖5 牦牛E-cadherin蛋白在不同繁殖周期輸卵管不同部位中的免疫組織化學(xué)染色Fig.5 Immunohistochemical staining of E-cadherin protein in different parts of the oviduct at different reproductive cycles of yak

在細(xì)胞粘附分子超家族成員中，E-cadherin是鈣依賴(lài)性細(xì)胞間粘附相關(guān)的跨膜糖蛋白，在維持上皮結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和細(xì)胞間粘附等方面起著重要作用[25-26]。有研究表明，在人的精子、卵母細(xì)胞、卵丘細(xì)胞以及輸卵管上皮細(xì)胞中檢測(cè)到E-cadherin[27]。本研究發(fā)現(xiàn)其主要在牦牛輸卵管的纖毛細(xì)胞、分泌細(xì)胞、基細(xì)胞、肌層和漿液腺中表達(dá)。研究結(jié)果顯示，E-cadherin主要參與多種鈣依賴(lài)嗜同性細(xì)胞之間粘附事件，銜接蛋白β-catenin可與E-cadherin胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將粘附蛋白連接到細(xì)胞骨架上[28]，從而發(fā)揮信號(hào)傳遞和細(xì)胞穩(wěn)定的作用。本研究在牦牛輸卵管的相應(yīng)部位發(fā)現(xiàn)了E-cadherin的表達(dá)，這與在人體中的報(bào)道相一致[27]，由此可推測(cè)，E-cadherin在牦牛輸卵管中也發(fā)揮著重要的作用。

為了進(jìn)一步探究E-cadherin在牦牛輸卵管中的表達(dá)情況，本試驗(yàn)分別在卵泡期、黃體期和妊娠期檢測(cè)了E-cadherin基因及蛋白在輸卵管傘部、壺腹部及峽部的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在卵泡期，E-cadherin基因及蛋白在輸卵管壺腹部的表達(dá)量最高，峽部表達(dá)量最低。在輸卵管傘部，E-cadherin蛋白在卵泡期的表達(dá)量最高，在妊娠期的表達(dá)量最低。然而，E-cadherin基因在黃體期的表達(dá)量最高，妊娠期的表達(dá)量最低。有研究報(bào)道，基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的翻譯存在時(shí)空差異[29]，這可能是造成E-cadherin基因及蛋白存在表達(dá)差異的主要原因。有報(bào)道稱(chēng)E-cadherin主要參與同型細(xì)胞與細(xì)胞間粘附進(jìn)而完成細(xì)胞間的相互作用[30]。同時(shí)，在繁殖周期母體中，E-cadherin也會(huì)協(xié)同某些激素和細(xì)胞因子，使輸卵管微環(huán)境發(fā)生變化[31]。因此，卵泡期E-cadherin在輸卵管傘部表達(dá)高可能是因?yàn)槁涯讣?xì)胞被輸卵管傘部細(xì)胞的表面受體粘附并接收，從而通過(guò)傘部粘膜的擺動(dòng)將卵子運(yùn)輸至輸卵管中，在相關(guān)細(xì)胞因子的作用下，卵母細(xì)胞在輸卵管中成熟并與獲能精子相遇并融合。

黃體作為卵泡破裂后形成的臨時(shí)器官，可分泌大量孕酮以維持雌性動(dòng)物正常的生殖機(jī)能。本研究發(fā)現(xiàn)在黃體期，E-cadherin基因及蛋白在輸卵管峽部的表達(dá)量最高，壺腹部表達(dá)量最低。同時(shí)對(duì)于輸卵管峽部來(lái)說(shuō)，E-cadherin基因及蛋白在黃體期表達(dá)量最高，卵泡期表達(dá)量最低。精子在尾端峽部和子宮輸卵管連接部?jī)?chǔ)存且獲能啟動(dòng)，并被準(zhǔn)確釋放到受精部位[32]，E-cadherin作為復(fù)雜膜蛋白的一部分，在精子獲能事件中發(fā)揮著重要作用。在精子通過(guò)女性生殖道的過(guò)程中，E-cadherin可確保精子與輸卵管上皮進(jìn)行結(jié)合和釋放[33]。同時(shí)，E-cadherin還能夠誘導(dǎo)與輸卵管上皮細(xì)胞結(jié)合的精子中某些蛋白激酶的酪氨酸磷酸化及細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的增加，使其能夠被釋放并繼續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)到壺腹部與卵子結(jié)合。這證明了E-cadherin在精卵相互作用過(guò)程參與粘附事件[34-35]。另外，有研究采用DECMA-1抗E-cadherin單克隆抗體后發(fā)現(xiàn)，精子與卵母細(xì)胞的相互作用明顯受損[36]。綜上可以推測(cè)E-cadherin參與了輸卵管峽部發(fā)揮精子儲(chǔ)存庫(kù)的功能，從而有助于精卵結(jié)合，但其輸卵管峽部精子“儲(chǔ)存器”的形成及精子釋放并與卵子結(jié)合的具體機(jī)制仍有待深入研究。

精卵在輸卵管壺腹部結(jié)合后被運(yùn)送至子宮著床，動(dòng)物進(jìn)入妊娠期。在妊娠期，E-cadherin在輸卵管壺腹部的表達(dá)量最高，在輸卵管傘部的表達(dá)量最少。同時(shí)對(duì)于輸卵管壺腹部而言，E-cadherin基因及蛋白在妊娠期的表達(dá)量相對(duì)較高，在黃體期的表達(dá)量最少。在附植前的人胚胎表面可檢測(cè)到E-cadherin的表達(dá)，胚胎表面的E-cadherin能與子宮內(nèi)膜細(xì)胞表面的同類(lèi)分子互為配體，形成細(xì)胞間分子連接，使胚胎能夠粘附于內(nèi)膜，為進(jìn)一步植入提供前提條件[20]。子宮內(nèi)膜“植入窗”的形成，除了受卵巢激素控制外，胚胎在其中也有著主要作用，二者發(fā)育相互影響、相互調(diào)節(jié)以達(dá)到同步，同時(shí)具有容受性和粘附性，胚胎著床才能夠進(jìn)行。胚胎上的E-cadherin可能影響內(nèi)膜上皮E-cadherin的表達(dá)，相互調(diào)節(jié)以達(dá)到理想的植入窗狀態(tài),最終目的是利于胚胎著床[37-38]。另外有數(shù)據(jù)也顯示在犬中，輸卵管細(xì)胞可支持胚胎通過(guò)關(guān)鍵的細(xì)胞分裂M期[39]。與單獨(dú)培養(yǎng)相比，犬胚胎與輸卵管組織或輸卵管細(xì)胞共培養(yǎng)可增強(qiáng)其早期發(fā)育。因此，本研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin在輸卵管壺腹部表達(dá)量高，推測(cè)其參與妊娠早期的胚胎發(fā)育與運(yùn)輸過(guò)程，以待更好地完成整個(gè)繁殖周期的發(fā)展過(guò)程。

本研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin基因和蛋白在牦牛不同繁殖周期輸卵管不同部位中的表達(dá)存在顯著差異，推測(cè)E-cadherin在牦牛接收卵子、儲(chǔ)存精子、受精及早期胚胎發(fā)育方面可能發(fā)揮著重要作用。本研究為牦牛的繁殖性能研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

在牦牛不同繁殖周期中E-cadherin在輸卵管傘部、壺腹部和峽部中均有表達(dá)且存在表達(dá)差異，其主要在不同繁殖周期輸卵管傘部、壺腹部和峽部的纖毛細(xì)胞、分泌細(xì)胞、基細(xì)胞、肌層和漿液腺等中有分布。由此推測(cè)E-cadherin可能參與了輸卵管受精及早期胚胎發(fā)育等生殖過(guò)程。