高羊茅FeTOC1基因的克隆、差異表達(dá)及亞細(xì)胞定位分析

王 茜 吳佳海 陳 瑩 王小利,*

(1 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006；2 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，貴州 貴陽 550006)

開花是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵過程，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-2]。針對(duì)模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的研究發(fā)現(xiàn)，存在5條遺傳調(diào)控途徑，其能夠通過整合內(nèi)外部的信號(hào)，最終調(diào)節(jié)擬南芥的成花轉(zhuǎn)變，其中，光周期途徑作為該五大重要途徑之一而備受關(guān)注[3-5]。在光周期途徑中，植物通過感受光照刺激產(chǎn)生規(guī)律的自我調(diào)節(jié)，被稱為生物鐘。生物鐘在調(diào)控真核生物生理過程方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。此外，生物鐘還可以作為真核生物內(nèi)在的時(shí)間調(diào)節(jié)器，指導(dǎo)有機(jī)體不斷地自我調(diào)節(jié)，以達(dá)到最終適應(yīng)外界環(huán)境變化的目的[7-8]。大多數(shù)有機(jī)體都有保守的產(chǎn)生生物鐘節(jié)律的機(jī)制，即由中央振蕩器產(chǎn)生的基于轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[9]。已有研究結(jié)果表明，MYB類蛋白基因LHY(late elongated hypocotyll)和CCA1 (circadian clock assoiated1)，以及偽反應(yīng)調(diào)節(jié)因子TOC1 (timing of CAB expression 1)三者構(gòu)成了中央振蕩器的核心組分[10-11]。

TOC1和LHY/CCA1之間的反饋調(diào)節(jié)構(gòu)成了擬南芥生物鐘中央振蕩器的基本框架[12]。CCA1和LHY的mRNA表達(dá)水平通常在清晨達(dá)到高峰，其編碼的蛋白結(jié)合在TOC1啟動(dòng)子的夜晚元件上發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，使得TOC1的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào); 下調(diào)后的TOC1編碼的蛋白正向調(diào)控CCA1和LHY的表達(dá)水平，致使CCA1和LHY的表達(dá)水平隨之下調(diào)，最終在接近黃昏時(shí)，CCA1和LHY的表達(dá)再次通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)，使TOC1的mRNA和其編碼的蛋白水平均達(dá)到峰值[12-14]。其中TOC1主要負(fù)責(zé)穩(wěn)定中央振蕩器的調(diào)節(jié)作用，Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，中央振蕩器的性能在擬南芥TOC1超表達(dá)和突變體中均發(fā)生了極大的變化。TOC1作為APRRs家族(Arabidopsispseudo-response regulators)的重要成員，又名APRR1或PRR1，該家族還包括APRR3、APRR5、APRR7和APRR9等4個(gè)成員[16]。Matsushika等[10]研究指出，擬南芥中5個(gè)APRR基因呈現(xiàn)晝夜規(guī)律和時(shí)間表達(dá)順序模式，APRR9首先在黎明時(shí)開始表達(dá)，隨著時(shí)間的推移，APRR7、APRR5、APRR3依次相繼表達(dá)，直到夜間TOC1表達(dá)；Makino等[17]研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)光照條件下，APRR9、APRR7、APRR5和APRR3均因TOC1的超量表達(dá)而不同程度地失去了節(jié)律性表達(dá)模式; Sato等[18]發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)APRR5，致使APRR9和APRR7的表達(dá)水平急劇下降，APRR3和TOC1的表達(dá)水平則上調(diào)并達(dá)到峰值。Farré等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CCA1通過結(jié)合APRR7和APRR9基因啟動(dòng)子的CBS (CCA1-binding site)結(jié)構(gòu)域調(diào)控上述基因的表達(dá)。由此可見，APRRs家族成員的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均表現(xiàn)出晝夜節(jié)律變化，并在中央振蕩器中發(fā)揮一定的作用。此外，從APRR9到TOC1的這種調(diào)控提供了一種可變的輸出機(jī)制，導(dǎo)致從黎明到傍晚的任何時(shí)刻，都可以對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，最終調(diào)節(jié)TOC1的表達(dá)水平[20]。

在大多數(shù)植物體內(nèi)光周期基因都是相對(duì)保守的，然而隨著進(jìn)化的推移及生活環(huán)境的不斷變化，植物體內(nèi)基因(甚至是同源基因)的生物學(xué)功能會(huì)表現(xiàn)出不同程度的差異性[20]。雖然TOC1已被公認(rèn)為是重要的開花調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，但其在生物鐘維持方面的具體作用仍存在眾多爭(zhēng)議，且目前針對(duì)其功能的研究主要集中于雙子葉植物，特別是模式植物擬南芥[21-22]。高羊茅(Festucaelata)作為單子葉植物，其發(fā)育性狀與雙子葉植物存在很大差異。高羊茅是一種重要的冷季型牧草及草坪草，具有很強(qiáng)的抗逆性，被廣泛應(yīng)用于水土保持、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)建植、城市綠化和環(huán)境保護(hù)等方面，已成為我國(guó)使用量增長(zhǎng)最快的草種。然而，目前我國(guó)高羊茅草坪草品種基本依賴于歐美進(jìn)口，亟待選育適應(yīng)我國(guó)氣候環(huán)境，特別是適應(yīng)南方典型短日照地區(qū)(如貴州省)條件的新品種。基于此，本研究克隆獲得高羊茅TOC1基因的cDNA全長(zhǎng)，將其命名為高羊茅FeTOC1，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；隨后，利用熒光蛋白對(duì)FeTOC1進(jìn)行亞細(xì)胞定位；最后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)對(duì)高羊茅葉片中FeTOC1在3種不同光周期模式下(長(zhǎng)/短日照、連續(xù)光照/黑暗和晝夜顛倒)的表達(dá)水平進(jìn)行分析，旨在從分子調(diào)控層面揭示FeTOC1在維持高羊茅生物鐘方面發(fā)揮的作用，為培育適應(yīng)短日照地區(qū)牧草新品種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為高羊茅(FestucaelataKeng ex E. Alexeev)獵狗五號(hào)(百綠草種公司，貴陽)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料培養(yǎng) 挑選籽粒飽滿的高羊茅獵狗五號(hào)種子播種于泥炭土和蛭石混合(1∶1)基質(zhì)中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每4 d更換一次。培養(yǎng)箱晝/夜溫度為(22±2℃)/(20±2℃)，光強(qiáng)約230～300 μmol·m-2·s-1，相對(duì)空氣濕度為60%～70%。

1.2.2 材料處理與取樣 將高羊茅進(jìn)行以下3種不同光周期模式處理(表1)。處理結(jié)束后，每4 h收集各處理下高羊茅葉片于液氮中速凍，連續(xù)取樣48 h，保存于-80℃冰箱中，用于檢測(cè)FeTOC1基因在不同光周期模式下的表達(dá)水平。

表1 不同光周期模式處理Table 1 Treatments of diverse photoperiod patterns

1.2.3 高羊茅FeTOC1基因全長(zhǎng)的cDNA克隆 選擇NCBI網(wǎng)站上已公布的其他植物TOC1核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，根據(jù)同源性高簡(jiǎn)并性低的原則，使用DNAMAN和Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增高羊茅TOC1基因片段，再結(jié)合3′和5′ RACE試劑盒(Inivtrogen，美國(guó))的引物進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增 (引物見表2)。

表2 高羊茅FeTOC1基因克隆及qRT-PCR引物序列Table 2 Sequences of primers used for cloning and qRT-PCR amplification of FeTOC1

參照TRIZOLTMKit(上海生工)RNA法提取高羊茅葉片RNA，詳細(xì)流程參見文獻(xiàn)[23]。使用Fermentas公司(加拿大)的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。利用設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并性引物TOC1F2和TOC1F2進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火50 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min，保存于4℃冰箱中。目的片段按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明進(jìn)行回收和純化，再將篩選獲得的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序(寶生物工程，大連)。該結(jié)果經(jīng)比對(duì)確定為TOC1基因后，采用RACE技術(shù)獲得TOC1基因的5′和3′端。將克隆獲得的中間片段、5′RACE和3′RACE結(jié)果在DNAMAN軟件中進(jìn)行拼接，最終獲得高羊茅TOC1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

1.2.4 生物信息學(xué)分析FeTOC1的BLAST搜索在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 網(wǎng)站上完成；等電點(diǎn)、分子質(zhì)量及穩(wěn)定系數(shù)分析在ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html)網(wǎng)站上完成；使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建FeTOC1的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對(duì)其氨基酸序的同源性進(jìn)行分析。

1.2.5 亞細(xì)胞定位 將目的蛋白與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)融合表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，選擇陽性轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌GV3101菌液注射入本氏煙草(Nicotianaattenuata)葉片，其中空載體為對(duì)照，共同在黑暗條件下培養(yǎng)48 h，隨后在共聚焦顯微鏡下檢測(cè)熒光信號(hào)。

1.2.6 不同光周期處理下高羊茅FeTOC1基因表達(dá)模式分析 按照1.2.3的方法獲得cDNA，并稀釋20倍作為qRT-PCR的模板。使用DNAMAN和Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性表達(dá)引物，用于擴(kuò)增高羊茅FeTOC1基因片段，GAPDH作為內(nèi)參基因(引物見表2)，反應(yīng)條件同1.2.3。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物重復(fù)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法[24]計(jì)算FeTOC1基因在各處理下的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 高羊茅FeTOC1基因全長(zhǎng)cDNA序列分析

將引物TOC1F2和TOC1R2擴(kuò)增獲得的核心片段、5′ RACE和3′ RACE結(jié)果在DNAMAN軟件中進(jìn)行拼接，最終獲得高羊茅FeTOC1基因的全長(zhǎng)cDNA序列為1 557 bp，編碼517個(gè)氨基酸(圖1、2)。在NCBI上進(jìn)行BLAST搜索，比較結(jié)果顯示該基因與小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、水稻(Oryzasativa)、山羊草(Aegilopstauschii)等禾本科單子葉植物的TOC1基因具有較高的同源性，同源性程度依次為99%、94%、99%、99%，與擬南芥、玉米(Zeamays)、馬甲竹(Bambusatulda)、高粱(Sorghumbicolor)等雙子葉植物的TOC1基因亦具有較高的同源性，均為93%以上。

圖1 半定量RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of semi-quantitative reverse transcription-PCR products

圖2 高羊茅FeTOC1核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of FeTOC1 from Festuca elata

2.2 高羊茅FeTOC1基因生物信息學(xué)分析

將獲得的FeTOC1基因全序列通過在線軟件ProtParam進(jìn)行預(yù)測(cè)，F(xiàn)eTOC1基因編碼517個(gè)氨基酸，其分子式為C2506H3921N729O794S24，分子質(zhì)量為57.735 55 kDa。 編碼的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為6.12，親水性為-0.635，不穩(wěn)定系數(shù)為46.55。隨后，將高羊茅FeTOC1氨基酸序列與山羊草、小麥、大麥、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)和擬南芥氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示，與其他植物同源基因一致，保守區(qū)PR (peudoreceiver domain)和CCT結(jié)構(gòu)域[CONSTANS (CO), CO-like, TOC1]分別位于高羊茅FeTOC1氨基酸序列的N、C兩端，并且C端呈酸性(圖3)。

注：紅色和綠色下劃線區(qū)域分別代表保守區(qū)PR和CCT結(jié)構(gòu)域。Note: The red and green underlined regions represent the conserved PR and CCT domains, respectively.圖3 高羊茅FeTOC1與其他植物TOC1的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Amino acid sequence alignment of FeTOC1 from Festuca elata with others from hight plants

2.3 高羊茅FeTOC1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用Mega 5.0軟件制作21種植物TOC1蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示。相比雙子葉植物擬南芥、煙草、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等，高羊茅FeTOC1蛋白質(zhì)與禾本科植物更為相近，其中與大麥、小麥及粗山羊草親緣關(guān)系最近，均達(dá)到99%。

圖4 高羊茅FeTOC1蛋白質(zhì)序列與其他植物TOC1蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of FeTOC1 from Festuca elata and those from other plants

2.4 高羊茅FeTOC1的亞細(xì)胞定位分析

構(gòu)建目的蛋白與GFP融合表達(dá)載體，結(jié)果如圖5所示。從左到右依次為目的基因/空載體的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、葉綠體自發(fā)熒光(chloroplast auto-fluorescence, CHI)、明場(chǎng)(bright field, DIC)和三通道疊加場(chǎng)(Merge)。對(duì)照組在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜均檢測(cè)到熒光信號(hào)，試驗(yàn)組僅在細(xì)胞核中檢測(cè)到熒光信號(hào)。經(jīng)亞細(xì)胞定位分析可知，F(xiàn)eTOC1位于細(xì)胞核。

圖5 高羊茅FeTOC1的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of FeTOC1

2.5 高羊茅FeTOC1基因在不同光周期下表達(dá)模式分析

2.5.1FeTOC1基因在長(zhǎng)日照和短日照條件下的晝夜表達(dá)模式分析 長(zhǎng)日照條件下，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)展現(xiàn)出規(guī)則的晝夜振蕩節(jié)律，且周期為24 h。第一個(gè)光周期內(nèi)，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)的水平從光照處理時(shí)間(zetgeber time, ZT)凌晨4點(diǎn)后開始急劇增加，于中午12點(diǎn)達(dá)到峰值，隨后其表達(dá)水平急劇下降；第二個(gè)光周期內(nèi)，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)水平呈現(xiàn)同樣的變化趨勢(shì)，但其表達(dá)峰值提前了4 h，出現(xiàn)于早晨8點(diǎn)(圖6-A)。短日照條件下，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)的模式與長(zhǎng)日照下相同(圖6-B)。由此表明，F(xiàn)eTOC1基因的表達(dá)水平受光周期的調(diào)控，與生物鐘控制的晝夜節(jié)律相關(guān)，但日照長(zhǎng)短對(duì)該基因表達(dá)模式并無明顯影響。

注：橫坐標(biāo)下黑色條形代表黑暗處理；白色條形代表光照處理。下同。Note: The black bar on the horizontal axis represents the dark treatment. The white bars represent light treatment. The same as following.圖6 高羊茅葉片F(xiàn)eTOC1基因在長(zhǎng)日照(A)和短日照(B)下的表達(dá)Fig.6 FeTOC1 gene expression level under long-(A) and short-days (B) in Festuca elata leaves

2.5.2FeTOC1基因在連續(xù)光照和連續(xù)黑暗條件下表達(dá)模式分析 長(zhǎng)日照培養(yǎng)3周后，連續(xù)光照1周，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)水平在48 h內(nèi)呈現(xiàn)較弱的振蕩趨勢(shì)，但其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異(P< 0.05) (圖7-A)；而連續(xù)黑暗1周后，其表達(dá)水平呈現(xiàn)規(guī)則的震蕩節(jié)律且周期為24 h，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)峰值分別出現(xiàn)于第一個(gè)光周期的凌晨4點(diǎn)和第二個(gè)光周期的凌晨0點(diǎn)，相比于第一個(gè)光周期，第二個(gè)光周期的峰值提前了4 h (圖7-B)。短日照培養(yǎng)3周后，連續(xù)光照1周，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降的振蕩規(guī)律，變化周期為24 h，其表達(dá)峰值分別出現(xiàn)于第一個(gè)光周期的中午2點(diǎn)和第二個(gè)光周期的早晨8點(diǎn)，同樣，第二個(gè)光周期的峰值比第一個(gè)光周期提前了4 h (圖7-C)；連續(xù)黑暗1周后，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)模式與連續(xù)光照相似，峰值分別出現(xiàn)于ZT4和ZT8，相比于第一個(gè)光周期，第二個(gè)光周期的峰值滯后了4 h (圖7-D)。綜上可知，外界光照條件的變化直接影響FeTOC1基因的表達(dá)水平。植株在接受連續(xù)光照或連續(xù)黑暗的處理后，F(xiàn)eTOC1基因的表達(dá)模式與正常光照處理一致，表現(xiàn)出一定的晝夜振蕩節(jié)律，其周期為24 h?？梢奆eTOC1基因在適應(yīng)外界環(huán)境變化時(shí)，其表達(dá)水平受到一定程度的影響，但能夠保持一定的穩(wěn)定節(jié)律，以保障植物正常開花生長(zhǎng)。值得注意的是，相比于其他日照處理，長(zhǎng)日照后持續(xù)光照極大地削弱了FeTOC1基因的振蕩節(jié)律，說明該基因的表達(dá)對(duì)黑暗的積累有一定程度的依賴。

圖7 高羊茅葉片F(xiàn)eTOC1基因在長(zhǎng)日照(A和B)和短日照(C和D)后連續(xù)光照(A和C)和連續(xù)黑暗(B和D)下的表達(dá)Fig.7 FeTOC1 gene expression level under continual illumination (A and C) and continual darkness (B and D) in Festuca elata leaves after long-(A and B) and short-days (C and D)

2.5.3FeTOC1基因在晝夜顛倒下的表達(dá)模式分析 圖8-A為試驗(yàn)對(duì)照組，即植株自播種之日起，遵循外界晝夜規(guī)律長(zhǎng)日照4周。長(zhǎng)日照培養(yǎng)3周后，晝夜顛倒處理1周，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)水平呈現(xiàn)規(guī)則的振蕩節(jié)律，且周期為24 h，其表達(dá)峰值均出現(xiàn)在ZT0，且與對(duì)照組相比，其表達(dá)模式呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)(圖8-B)。植株自播種之日起，顛倒晝夜培養(yǎng)4周后，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)水平依然呈現(xiàn)規(guī)則的振蕩節(jié)律且周期為24 h，其表達(dá)峰值均出現(xiàn)在ZT20，同樣與對(duì)照組相比，表達(dá)模式相反(圖8-C)。顛倒晝夜培養(yǎng)3周后，遵循外界晝夜規(guī)律長(zhǎng)日照1周，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)模式與對(duì)照組一致(圖8-D)。由此可見，F(xiàn)eTOC1基因表達(dá)水平隨著外界環(huán)境晝夜節(jié)律的變化表現(xiàn)出規(guī)律的晝夜振蕩周期，且其周期為24 h。

圖8 高羊茅葉片F(xiàn)eTOC1基因在晝夜顛倒下的表達(dá)Fig.8 FeTOC1 gene expression level under day and night inversion in Festuca elata leaves

3 討論

自TOC1首次從擬南芥中分離獲得以來，其在植物生物鐘調(diào)節(jié)中的重要地位備受關(guān)注[12-13, 25]。TOC1屬于擬南芥APRR基因家族，與其他成員結(jié)構(gòu)類似，其編碼的蛋白質(zhì)N端存在大約120個(gè)氨基酸組成的非典型PR結(jié)構(gòu)域，C端則存在大約50個(gè)氨基酸構(gòu)成的CCT結(jié)構(gòu)域，但與其他成員不同的是TOC1不存在IR區(qū)域(intermediate region)[26-27]。本研究將高羊茅FeTOC1氨基酸序列與其他植物TOC1氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們具有高度的相似性，在PR結(jié)構(gòu)域中心的周圍，均含有一個(gè)獨(dú)特的谷氨酸殘基(E) (圖3)，這是偽接收器的標(biāo)志性特征之一，真正的接受器在同樣的位置包含的是接受磷酸的天冬氨酸殘基(D)[28]。預(yù)測(cè)的高羊茅CCT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列經(jīng)比對(duì)，與禾本科山羊草、大麥、小麥及二穗短柄草的CCT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有高度一致性(圖3)。進(jìn)一步通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，高羊茅FeTOC1蛋白質(zhì)與禾本科大麥、小麥及粗山羊草TOC1蛋白質(zhì)親緣關(guān)系最近(圖4)。TOC1基因通常編碼含有非典型接受結(jié)構(gòu)域的定位于細(xì)胞核的蛋白[25, 29]。本研究亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，F(xiàn)eTOC1表達(dá)的蛋白定位在細(xì)胞核中(圖5)，表明TOC1可能參與功能重要的復(fù)合物合成，如轉(zhuǎn)錄體、剪接體或蛋白體[30]。

生物鐘通過整合外界環(huán)境和植物內(nèi)部信號(hào)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的各種生理活動(dòng)[31-32]。其中中央振蕩器通過輸入光信號(hào)產(chǎn)生節(jié)律，隨后向下游通路進(jìn)行傳遞，使其識(shí)別晝夜信號(hào)，由此可知中央振蕩器是生物鐘不可或缺的組分[29]。Alabadí等[12]發(fā)現(xiàn)，TOC1在維持生物鐘穩(wěn)定調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。針對(duì)TOC1基因在植物不同組織中表達(dá)豐度的研究發(fā)現(xiàn)，在單子葉植物小麥中，以15 d小麥的莖尖、幼根、幼葉和90 d小麥的節(jié)、莖、葉鞘、老根、老葉、幼穗為測(cè)定對(duì)象，其中幼根、幼葉和老葉中TOC1的表達(dá)豐度最高，且其表達(dá)水平相當(dāng)[32]；在雙子葉植物玉米中，以花粉、雄蕊、穗軸、穗位葉、氣生根、莖、花絲、胚芽鞘、胚根、根和苞葉為測(cè)定對(duì)象，其中從胚根和穗位葉提取的TOC1表達(dá)豐度最高[29]?；诖?，本研究在高羊茅葉片中檢測(cè)TOC1基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明在長(zhǎng)日照(16L/8D)、短日照(8L/16D) 條件下，其表達(dá)均表現(xiàn)出一定的晝夜節(jié)律性(圖6)，與擬南芥TOC1、小麥TaTOC1和水稻OsTOC1的表達(dá)特性基本相似[25,33-35]。FeTOC1基因在長(zhǎng)日照(圖6-A)和短日照(圖6-B)下表達(dá)量的高峰均在第一個(gè)振蕩周期出現(xiàn)在光照后4 h (中午12點(diǎn)ZT12)，第二個(gè)振蕩周期出現(xiàn)在開始給予光照(早晨8點(diǎn)ZT8)，這兩個(gè)點(diǎn)在長(zhǎng)短日照的晝夜交替變化中都處于黎明時(shí)分，可見高羊茅FeTOC1基因的表達(dá)相位不受日照長(zhǎng)度變化的影響，同時(shí)它還保持了晚間積累性表達(dá)的特點(diǎn)。

生物鐘基因通常在沒有晝夜交替信號(hào)的刺激下，仍然能通過自身內(nèi)在的生物鐘節(jié)律維持一定時(shí)間的規(guī)律性表達(dá)[7-8]。本研究分別將長(zhǎng)短日照培養(yǎng)3周的高羊茅轉(zhuǎn)移至持續(xù)光照或持續(xù)黑暗條件下適應(yīng)1周，F(xiàn)eTOC1基因的表達(dá)仍然具有不同程度的節(jié)律性，但是基因表達(dá)的整體水平與長(zhǎng)短日照條件下相比，有明顯的削弱趨勢(shì)(圖7)，說明FeTOC1基因的表達(dá)強(qiáng)烈依賴外界晝夜交替的信號(hào)刺激。值得注意的是，F(xiàn)eTOC1基因在高羊茅長(zhǎng)日照培養(yǎng)后移至持續(xù)光照48 h環(huán)境，雖然呈現(xiàn)出一定的振蕩節(jié)律，但其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著(圖7-A)，這與小麥TaTOC1和水稻OsTOC1持續(xù)黑暗條件下的表現(xiàn)類似[33-35]。暗示即便同為單子葉植物，高羊茅FeTOC1基因表達(dá)的調(diào)控對(duì)于光照的需求弱于小麥和水稻。如圖7-B、D所示，無論長(zhǎng)或短日照培養(yǎng)，持續(xù)黑暗48 h，F(xiàn)eTOC1基因依然維持其表達(dá)水平和晝夜節(jié)律性，這與擬南芥TOC1基因相似[24]。由此進(jìn)一步說明黑暗可能是啟動(dòng)并維持高羊茅FeTOC1基因節(jié)律性表達(dá)的重要因素。

Strayer等[25]研究擬南芥toc1-1突變體發(fā)現(xiàn)，TOC1功能的缺失導(dǎo)致植物體內(nèi)在的生物鐘節(jié)律縮短，從正常的24 h變?yōu)?1 h?；诖?，本研究分析晝夜顛倒后FeTOC1的表達(dá)模式，以期了解TOC1如何響應(yīng)外界晝夜交替的信號(hào)刺激，結(jié)果顯示，無論是遵循外界晝夜規(guī)律，還是顛倒外界晝夜規(guī)律，F(xiàn)eTOC1基因的表達(dá)均表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性振蕩，其振蕩周期為24 h；同時(shí)，F(xiàn)eTOC1基因的表達(dá)均在黑暗時(shí)開始積累，并在給予光照0～4 h后達(dá)到峰值(圖8)。由此可見，相比于遵循植物體內(nèi)穩(wěn)定的內(nèi)在生物鐘節(jié)律，F(xiàn)eTOC1基因的表達(dá)首先受外界晝夜交替信號(hào)的調(diào)節(jié)，說明TOC1在植物適應(yīng)外界環(huán)境變化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得了高羊茅生物鐘基因FeTOC1，該基因編碼的蛋白質(zhì)FeTOC1包含APRR家族保守的PR結(jié)構(gòu)域和CCT結(jié)構(gòu)域，且主要定位在細(xì)胞核中。在長(zhǎng)、短日照下，高羊茅葉片中FeTOC1表達(dá)具有一定的晝夜節(jié)律性，但表達(dá)相位不受日照長(zhǎng)度變化的影響，保持了晚間積累性表達(dá)的特性；持續(xù)光照顯著抑制了FeTOC1表達(dá)的振蕩節(jié)律，而持續(xù)黑暗下FeTOC1基因依然維持其表達(dá)水平和晝夜節(jié)律性，揭示了黑暗可能是啟動(dòng)并維持該基因節(jié)律性表達(dá)的重要因素；顛倒晝夜節(jié)律后，相比于植物內(nèi)在的生物鐘節(jié)律，F(xiàn)eTOC1基因優(yōu)先響應(yīng)外界晝夜交替信號(hào)。