花生籽仁中蔗糖含量近紅外預(yù)測(cè)群體模型的建立及在突變體篩選中的應(yīng)用

卞能飛 童 飛 鞏佳莉 孫東雷 沈 一 王 幸 邢興華 王曉軍,*

(1 江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 徐州 221131；2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210014)

花生(ArachishypogaeaL.)是重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。我國花生年均總產(chǎn)量約1 690萬噸[1]，居世界第一[2]，其中約50.3%用于榨油[3]。近年來，花生消費(fèi)呈現(xiàn)多元化趨勢(shì)，以花生為原料的食品需求量不斷上升[4-5]，我國鮮食、烘烤等食用花生消費(fèi)比例由原來的30.0%左右逐步提高到39.6%[3]，而歐美等發(fā)達(dá)國家用于食用和食品加工原料的花生比例更是高達(dá)70%以上[6]，其中只有13.0%用于榨油[3]。食用花生消費(fèi)比例快速提升且潛力巨大，這對(duì)花生品種的食味品質(zhì)提出了更高的要求。我國在花生育種中較多關(guān)注產(chǎn)量和含油量，對(duì)花生食味品質(zhì)關(guān)注度低，導(dǎo)致生產(chǎn)上缺乏優(yōu)質(zhì)食用型花生品種。

前人研究發(fā)現(xiàn)，花生籽仁的甜度與食味品質(zhì)呈顯著相關(guān)性，兩者的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.88，其中蔗糖是籽仁甜味的主要來源[7-8]。Coleman等[9]研究表明，烘烤花生的風(fēng)味物質(zhì)主要來源于氨基酸與糖之間的美拉德反應(yīng)、脂肪的氧化和熱降解及糖的熱降解反應(yīng)3個(gè)方面，花生中蔗糖含量越高，烘烤花生的風(fēng)味越好，這個(gè)趨勢(shì)在花生蔗糖含量高于5%時(shí)尤為顯著。王傳堂等[10]、羅虹等[11]研究表明，甜味是評(píng)價(jià)鮮食花生總體喜歡度，最重要的指標(biāo)，且當(dāng)籽仁中蔗糖含量大于6%時(shí)，帶殼水煮的鮮食花生更受歡迎。

高蔗糖含量是食用花生育種的主要目標(biāo)性狀，如何快速、高通量地檢測(cè)種質(zhì)資源和育種品系中的蔗糖含量，是高蔗糖育種工作中的首要問題。近紅外光譜分析技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)物理測(cè)試技術(shù)，具有成本低、檢測(cè)快、不損壞樣品等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于水稻[12-14]、油菜[15]、玉米[16]等農(nóng)作物的品質(zhì)分析。在花生品質(zhì)分析中，水分[17]、脂肪含量及脂肪酸組成[18-19]、蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成[20]等近紅外檢測(cè)技術(shù)較為成熟，籽仁中蔗糖含量檢測(cè)的應(yīng)用研究還較少。雷永等[6]和唐月異等[21]分別利用美國 Unity的 SpectraStar XL型近紅外光譜儀和德國布魯克Matrix-I型傅立葉變換近紅外光譜儀構(gòu)建花生籽仁的蔗糖含量近紅外模型，但無法在其他公司生產(chǎn)的光譜儀上應(yīng)用。秦利等[22]對(duì)72份花生材料采用偏最小二乘法(partial least squares, PLS)建立適用瑞典波通DA7200型近紅外分析儀的蔗糖預(yù)測(cè)模型，但品種數(shù)量較少，準(zhǔn)確度有待提高。

為了建立更準(zhǔn)確的適用于波通DA7200型近紅外分析儀的花生籽仁蔗糖含量近紅外預(yù)測(cè)模型，本研究選用149個(gè)花生品種(系)，利用波通DA7200型近紅外分析儀采集光譜數(shù)據(jù)，間苯二酚法測(cè)定籽仁蔗糖含量，采用PLS建立預(yù)測(cè)模型，旨在為花生食味品質(zhì)種質(zhì)資源的篩選和育種提供高效、無損的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于建立籽仁蔗糖含量預(yù)測(cè)模型的標(biāo)準(zhǔn)樣品集材料為我國各產(chǎn)區(qū)選育的花生品種(系)和外國引進(jìn)的品種共149份籽仁(表1)，模型外部驗(yàn)證樣品集T1～T20為江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的20個(gè)高代品系單株籽仁。

表1 建模所用花生品種(系)及其蔗糖含量化學(xué)值Table 1 The peanut accessions and their chemical values of sucrose content used for developing near infrared(NIR) model

表1(續(xù))

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品集光譜采集 采用瑞典波通DA7200型近紅外品質(zhì)分析儀對(duì)樣品進(jìn)行光譜信息采集。采集光譜前，所有樣品需自然風(fēng)干至含水量5%以下，于密閉環(huán)境中放置48 h以上，平衡水分。光譜儀掃描波長(zhǎng)范圍950～1 650 nm，分辨率5 nm，挑選飽滿籽仁裝滿樣品杯，輕輕搖勻，掃描3次，重新裝樣后重復(fù)2次，每個(gè)樣品共得到9次掃描結(jié)果。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品集蔗糖含量測(cè)定 采用間苯二酚法[23]測(cè)量蔗糖含量。使用DFT-50型磨樣機(jī)(林大機(jī)械有限公司，臺(tái)州)研磨籽仁成粉末狀，稱取50 mg 樣品(重復(fù)3次)放入離心管中，加入3 mL 80%乙醇溶液作為提取液，13 000 r·min-1離心15 min，取上清液，重復(fù)3次，合并上清液，80%乙醇溶液定容至9 mL 作為待測(cè)液。取待測(cè)液0.15 mL，加入0.15 mL 2 mol·L-1NaOH溶液，混勻，沸水浴10 min，冰水冷卻，加入2.1 mL 30%鹽酸和0.6 mL 0.1%間苯二酚溶液，混勻，80℃水浴10 min，冰水冷卻，于480 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定，記錄OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得反應(yīng)液中的蔗糖含量，計(jì)算樣品中蔗糖含量。

籽仁中蔗糖含量=[標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蔗糖的量(μg) × 定容體積(mL)]/[反應(yīng)液體積(mL) × 樣品重量(g) × 106] × 100%。

1.2.3 模型構(gòu)建 該步驟在波通DA7200型隨機(jī)附帶建模軟件中完成。采用導(dǎo)數(shù)(derivative)處理和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(standard normal variate transform, SNV)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品集光譜信息進(jìn)行預(yù)處理，將光譜信息與間苯二酚法測(cè)定的籽仁蔗糖含量建立相關(guān)關(guān)系，用PLS建立預(yù)測(cè)模型，反復(fù)采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證剔除奇異值。通過模型的校正決定系數(shù)(R2)、交叉檢驗(yàn)決定系數(shù)(cross-validation correlation coefficient, 1-VR)、校正標(biāo)準(zhǔn)偏差(squared error of calibration, SEC)和交叉檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard error of cross-validation, SECV)來衡量模型的質(zhì)量。

1.2.4 模型外部驗(yàn)證 選取20個(gè)育種高代品系的單株籽仁，利用新建預(yù)測(cè)模型對(duì)籽仁中蔗糖含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用間苯二酚法測(cè)量籽仁中蔗糖含量，比較近紅外預(yù)測(cè)值和化學(xué)值的相關(guān)性和準(zhǔn)確性。

1.2.5 模型應(yīng)用 2017年春，以甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS) 誘變徐花17號(hào)得到誘變1代(M1)，種子混收。2018年春，單粒播種，分單株收獲誘變2代(M2)，獲得籽仁1 965份。運(yùn)用建立的近紅外預(yù)測(cè)模型對(duì)1 965份M2代單株籽仁中蔗糖含量進(jìn)行測(cè)定，采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 20.0完成數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生籽仁的近紅外反射光譜分析

149份標(biāo)準(zhǔn)樣品籽仁在950～1 650 nm區(qū)間內(nèi)的近紅外光譜曲線趨勢(shì)大致相同，均存在多個(gè)吸收峰，但不同的樣品吸收峰強(qiáng)度不同(圖1)，表明花生籽仁的近紅外光譜可以用于花生籽仁中蔗糖含量的定量分析。

圖1 花生籽仁樣品的近紅外掃描光譜圖Fig.1 Near infra-red (NIR) spectrums of peanut kernel samples

2.2 花生籽仁蔗糖含量化學(xué)測(cè)定

149份標(biāo)準(zhǔn)樣品籽仁中蔗糖含量詳見表1，蔗糖含量均值為3.54%，含量范圍為2.15%～7.93%，變異系數(shù)為22.03% (表2)，蔗糖含量的變幅較寬，變異系數(shù)較大，滿足建立近紅外模型的要求。

表2 花生籽仁中蔗糖含量的化學(xué)測(cè)定結(jié)果Table 2 Chemical determination of sucrose content in peanut kernel

2.3 近紅外模型構(gòu)建

對(duì)149份標(biāo)準(zhǔn)樣品籽仁中蔗糖含量的化學(xué)值和采集的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合光譜處理，采用PLS法的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立預(yù)測(cè)模型。得到的校正決定系數(shù)(R2)為0.898，交叉檢驗(yàn)決定系數(shù)(1-VR)為0.792、校正標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEC)為0.253，交叉檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SECV)為0.363(表3、圖2)。模型的決定系數(shù)較高，標(biāo)準(zhǔn)誤偏差較小，表明該蔗糖含量檢測(cè)模型可以進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。

表3 花生籽仁中蔗糖含量的近紅外定標(biāo)參數(shù)Table 3 Parameters of NIR calibration for sucrose contents in peanut kernel

圖2 蔗糖含量的近紅外與化學(xué)測(cè)定散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter diagram between NIR and chemical value of sucrose content

2.4 模型外部驗(yàn)證

選取20個(gè)育種高代品系的單株籽仁進(jìn)行外部驗(yàn)證，蔗糖含量的化學(xué)值和預(yù)測(cè)值見表4，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，t=0.464

表4 花生種子蔗糖含量近紅外模型的驗(yàn)證Table 4 Validation of near infrared model for sucrose content in peanut seed

圖3 外部驗(yàn)證花生樣品的蔗糖含量預(yù)測(cè)值與化學(xué)值的相關(guān)性Fig.3 The coefficient of determination of sucrose content between NIR and chemical values in the external peanut samples

2.5 預(yù)測(cè)模型在突變體篩選中的應(yīng)用

徐花17號(hào)是由江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的小果型炒貨花生品種，在蘇北地區(qū)種植面積較大，籽仁中蔗糖含量的化學(xué)值為4.33%。為進(jìn)一步改善徐花17號(hào)的食味品質(zhì)，使用EMS對(duì)徐花17號(hào)種子進(jìn)行誘變，利用建立的籽仁中蔗糖近紅外模型對(duì)M2單株籽仁進(jìn)行預(yù)測(cè)。徐花17號(hào)的近紅外預(yù)測(cè)值為4.07%，M2單株的預(yù)測(cè)平均值為4.12%，略大于徐花17號(hào)，預(yù)測(cè)范圍為2.33%～6.45%，符合正態(tài)分布(表5、圖4)，其中預(yù)測(cè)值大于徐花17號(hào)的有1 038份，大于5.00%的有71份，大于6.00%的有4份。4份預(yù)測(cè)值大于6.00%的突變體經(jīng)化學(xué)法驗(yàn)證，其蔗糖含量分別為6.12%、6.18%、6.37%和6.63%，通過多人品嘗評(píng)價(jià)，籽仁甜味度優(yōu)于徐花17號(hào)，證明在育種實(shí)踐中，該模型適用于突變體、種質(zhì)資源、雜交后代等籽仁甜味的篩選，可提高優(yōu)質(zhì)食味品種的育種效率。

表5 M2單株籽仁蔗糖含量近紅外預(yù)測(cè)值Table 5 Sucrose contents of M2 by NIR test

圖4 M2單株蔗糖含量近紅外預(yù)測(cè)值分布圖Fig.4 Histogram of sucrose content of M2 by NIR test

3 討論

花生籽仁品質(zhì)是花生育種的重要組成部分，花生籽仁中不同成分的含量決定了花生的加工品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)，傳統(tǒng)的化學(xué)檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要損壞花生種子，很難在種質(zhì)篩選和品質(zhì)育種中起到作用[24]。近年來，近紅外分析技術(shù)在花生品質(zhì)分析中快速應(yīng)用[19-20]，針對(duì)不同的近紅外儀器型號(hào)，花生籽仁中各成分的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度也越來越高。唐月異等[21]利用167份花生材料建立適用德國布魯克Matrix-I型近紅外光譜儀的蔗糖預(yù)測(cè)模型，決定系數(shù)R2為0.816；雷永等[6]利用185份花生材料建立適用美國 Unity的 SpectraStar XL型近紅外光譜儀模型，決定系數(shù)R2為0.962；秦利等[22]利用72份花生材料建立適用瑞典波通 DA7200型近紅外分析儀的蔗糖預(yù)測(cè)模型，決定系數(shù)R2為 0.822。不同研究模型的決定系數(shù)不同，與建模所用品種數(shù)量、蔗糖含量變異范圍、化學(xué)值準(zhǔn)確度、儀器型號(hào)等因素有關(guān)。本研究建立的花生籽仁中蔗糖含量預(yù)測(cè)模型，其決定系數(shù)R2為0.898，校正標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.253，提高了波通 DA7200型近紅外分析儀預(yù)測(cè)籽仁中蔗糖含量的準(zhǔn)確性。但標(biāo)準(zhǔn)樣品集中蔗糖含量高的極端品種較少，對(duì)模型的準(zhǔn)確度產(chǎn)生了一定的影響，下一步將繼續(xù)收集和創(chuàng)制極端種質(zhì)補(bǔ)充至該模型，提高該模型的準(zhǔn)確度。

傳統(tǒng)花生育種存在育種效率低、周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)[25]，特別是品質(zhì)育種。在常規(guī)雜交育種過程中，低世代材料往往只進(jìn)行表型農(nóng)藝性狀選擇，綜合表現(xiàn)較好的高世代品系再進(jìn)行品質(zhì)性狀選擇，造成許多品質(zhì)優(yōu)良的材料被淘汰。本研究建立的預(yù)測(cè)模型適用于小樣品量單株籽仁的無損測(cè)定，育種早代即可選擇，增加品質(zhì)育種的針對(duì)性，縮短育種年限。蔗糖含量預(yù)測(cè)模型可同已建立的脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、油酸含量等其他近紅外模型整合，單次試驗(yàn)即可得到多種化學(xué)成分的檢測(cè)結(jié)果，便于育種者選育兼具高糖、高油酸、低脂、高蛋白性狀的食用花生新品種。

本研究建模所用的149個(gè)品種(系)是我國花生主產(chǎn)區(qū)推廣的品種，蔗糖含量大于5.00%的只有5個(gè)，大于6.00%的只有2個(gè)，可見我國花生品種中蔗糖含量普遍較低，高糖種質(zhì)資源匱乏，同Wang等[26]的結(jié)論一致。為解決這一問題，可以通過兩條途徑：一是普通糖含量品種雜交產(chǎn)生超親現(xiàn)象，雷永等[6]在吉花 02-1-4(蔗糖含量4.00%)和中花 26(蔗糖含量2.30%)的雜交后代中篩選出一批蔗糖含量超過7.00%的優(yōu)良品系，利用本研究建立的預(yù)測(cè)模型也在徐花紫1號(hào)(蔗糖含量4.77%)和四粒紅(蔗糖含量4.36%)雜交后代篩選出徐花甜29(蔗糖含量8.80%)和徐花甜30(蔗糖含量8.90%)2個(gè)高糖品系；另一種是利用誘變技術(shù)創(chuàng)制高蔗糖含量的種質(zhì)資源，崔光軍等[27]、王秀貞等[28]分別通過花粉管通道法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒和EMS誘變得到花生高蔗糖含量突變體；本研究篩選了徐花17號(hào)(蔗糖含量4.33%)經(jīng)EMS誘變得到的M2單株籽仁，得到4份蔗糖含量大于6.00%的突變材料。

4 結(jié)論

本研究利用149個(gè)花生品種(系)，構(gòu)建花生籽仁中蔗糖含量的近紅外預(yù)測(cè)群體模型，該模型的決定系數(shù)為0.898，校正標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.253，通過外部驗(yàn)證可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)花生籽仁中的蔗糖含量。運(yùn)用該模型篩選徐花17號(hào)誘變?nèi)后w，從1 965份M2單株籽仁中獲得4份蔗糖含量大于6.00%的突變體。