硝酸還原酶基因啟動(dòng)子NRE2元件缺失對(duì)煙草氮代謝的影響

黨 偉 李 茜 葉歌斐 汪海燕 張玉寧 楊鐵釗 武兆云 楊惠娟,*

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地，河南 鄭州 450002；2 浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，浙江 杭州 310000； 3 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310000； 4洛陽(yáng)市煙草公司宜陽(yáng)縣分公司，河南 宜陽(yáng) 471000)

植物主要以無(wú)機(jī)氮(NO3--N、NH4+-N)為氮源，其中植物最易吸收的是硝態(tài)氮(NO3--N)。NO3-在葉片中通過(guò)無(wú)機(jī)氮的還原同化途徑，合成植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的含氮化合物，如氨基酸、核苷酸、多肽等[1]。研究表明，NO3-不僅是植物氮同化的代謝底物，同時(shí)也是一種信號(hào)分子[2]。一方面，NO3-是植物感應(yīng)外界氮營(yíng)養(yǎng)變化的關(guān)鍵信號(hào)分子；另一方面，NO3-對(duì)植物體內(nèi)部分生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因具有重要的調(diào)節(jié)作用，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、根系形態(tài)建成等[3]。這類基因最顯著的表達(dá)調(diào)控特征是可以迅速受到NO3-的誘導(dǎo)，不依賴于蛋白質(zhì)的從頭合成，因而被稱為NO3-初級(jí)響應(yīng)基因[4]，其中包括硝酸還原酶基因(nitrate reductase,NIA)。硝酸還原酶(nitrate reductase，NR，EC 1.6.6.1)是氮代謝途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，可將NO3-還原成NO2-。劉麗等[5]研究發(fā)現(xiàn)硝酸還原酶的合成和降解受到一系列復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的調(diào)節(jié)，其表達(dá)受到光、NO3-、蔗糖等外界因素的誘導(dǎo)以及氮代謝產(chǎn)物如谷氨酰胺(Gln)等的反饋抑制。

順式作用元件是啟動(dòng)子中的一段特異序列，通過(guò)與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，特定地促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄[6]。對(duì)啟動(dòng)子及其順式作用元件進(jìn)行研究，既可以在分子層面探究功能基因的誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制，又可以利用啟動(dòng)子為作物遺傳改良提供新的思路[7]。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥[8]、枳[9]、菠菜[10-11]等多種植物的亞硝酸還原酶基因(Nitrite reductase，NIR)啟動(dòng)子中都存在一個(gè)保守的長(zhǎng)度為43 bp的NO3-響應(yīng)順式作用元件(nitrate-responsive cis-element，NRE)，其核心序列為GACCCTT-N(9-10)-AAG，該序列參與調(diào)控NO3-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究發(fā)現(xiàn)NO3-信號(hào)可以激活根瘤感受基因類似蛋白(NIN-like proteins, NLPs)，NLPs蛋白可以與NIA1基因下游3′端的NRE元件以及NIR1基因啟動(dòng)子序列中的NRE元件結(jié)合，調(diào)控NIA1和NIR1基因的表達(dá)[12]。Wang等[13]使用小球藻NIA基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GUS基因表達(dá)水平在NO3-條件下顯著增加，在NH4+條件下顯著降低。同時(shí)，在杜氏鹽藻[14]的研究中也有類似的結(jié)果。以上研究表明煙草NIA基因啟動(dòng)子中可能存在NO3-響應(yīng)元件NRE。

本研究前期利用生物信息學(xué)技術(shù)在煙草NIA1和NIA2基因啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)一個(gè)GACCCTA-N(10)-AAG的核心序列，暫命名為NRE2元件(表1)，與菠菜和擬南芥相比，該元件在5′端第7個(gè)堿基處發(fā)生突變，堿基T被替換為堿基A，導(dǎo)致GUS報(bào)告基因表達(dá)量降低[15]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得煙草NIA1基因和NIA2基因啟動(dòng)子中NRE2元件缺失的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，對(duì)煙葉氮代謝相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，研究硝酸還原酶基因啟動(dòng)子NRE2元件在煙草植株生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，以期為選育低硝酸鹽含量的煙草新品種提供理論依據(jù)。

表1 煙草及其他物種NIR基因啟動(dòng)子NRE元件與煙草NIA基因啟動(dòng)子NRE2元件序列對(duì)比Table 1 Sequence comparison of NRE element of NIR gene promoter and NRE2 element of gene promoter in tobacco and other species

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

普通栽培煙草K326種子由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草栽培生理實(shí)驗(yàn)室提供。農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草栽培生理實(shí)驗(yàn)室保存菌株；Murashig-Skoog營(yíng)養(yǎng)液(Murashig and Skoog Medium，MS)配制參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[16]；DNA marker購(gòu)自北京Biomed公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自成都FOREGENE公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；特異性引物由鄭州擎科生物公司合成；硝酸還原酶活性和亞硝酸還原酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AA3型連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀，德國(guó)BRAN LUEBBE公司；ZHWY-200H型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；Mastercycler pro型常規(guī)梯度PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；SPARK 10M型酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 gRNA設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索和下載NIA1(GenBank ID：X14058.1)和NIA2(GenBank ID：X14059.1)基因的ATG上游啟動(dòng)子序列，使用在線分析工具CRISPR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)在NRE2元件附近選擇合適的靶點(diǎn)，并設(shè)計(jì)編輯位點(diǎn)(表2)。重組CRISPR/Cas9敲除載體由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草栽培生理實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

表2 用于NIA1和NIA2基因啟動(dòng)子中NRE2元件敲除的gRNA寡聚核苷酸序列及附近序列Table 2 The gRNA oligonucleotide sequence and nearby sequences for knockout of the NRE2 element in the promoters of NIA1 and NIA2 genes

1.3.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 采用凍融法[17]將載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，在不含抗生素的農(nóng)桿菌YEB培養(yǎng)基(yeast mannitol medium)中28℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)2～3 h，5 000 r·min-1離心1 min收集菌體。重懸后，將菌液均勻涂布在含有抗生素的YEB培養(yǎng)基(含50 mg·mL-1Kana，100 mg·mL-1Strep，50 mg·mL-1Rif)中，28℃恒溫倒置培養(yǎng)48～72 h；挑取單菌落振蕩培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶Pml Ⅰ和Apa Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得可用于遺傳轉(zhuǎn)化的重組農(nóng)桿菌。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的獲得 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法[18]轉(zhuǎn)化煙草。侵染后，用濾紙吸去葉盤表面的殘留菌液，在MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2～3 d。之后用頭孢溶液清洗葉盤，并轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基(MS+0.15 mg·mL-1NAA+1 mg·mL-16-BA+0.5 mg·mL-1Cef+8 μg·mL-1Hyg)上進(jìn)行篩選，每7 d更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)愈傷組織分化成芽時(shí)，將芽移至生根培養(yǎng)基中(1/2MS+0.15 mg·mL-1NAA+0.5 mg·mL-1Cef+30 μg·mL-1Kana+8 μg·mL-1Hyg)。當(dāng)煙苗長(zhǎng)至五葉一心時(shí)進(jìn)行緩苗處理，后移植到育苗盆中并置于光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)。按煙草專用肥∶水=1∶3的比例對(duì)煙株施肥，每周施肥一次。獲得的煙草NIA1、NIA2啟動(dòng)子NRE2元件缺失的單突變體品系命名為△NIA1、△NIA2，雙突變體品系命名為△NIA1+2。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性鑒定 以T0代煙草葉片基因組DNA為模板，依次用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hygriomycin phosphotransferase,HYG)和Cas9(CRISPR-associated nucle-ase9)基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增引物及擴(kuò)增程序分別如下：

HYG正向引物：5′-G C T C C A T A C A A G C C A A C C A C G-3′

HYG反向引物：5′-C C T G C C T G A A A C C G A A C T G C-3′

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存。

Cas9正向引物：5′-G A G G T C G T G A A G A A G A T G A A G A A-3′

Cas9反向引物：5′-G G T C A G G G T A A A C A G G T G G A T-3′

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

在T0代煙株最大功能葉片長(zhǎng)至18 cm左右時(shí)，摘取中部煙葉并分成兩份，一份于液氮中速凍后保存于-80℃冰箱中，用于NR和NiR活性測(cè)定；另一份在殺青后將其磨碎過(guò)60目篩，用于葉中NO3-、NO2-和總氮含量測(cè)定。每種基因型分別選取5株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗進(jìn)行測(cè)定。

NR和NiR活性利用檢測(cè)試劑盒在酶標(biāo)儀上測(cè)定；總氮含量在連續(xù)流動(dòng)分析儀[19]上測(cè)定。葉中硝酸鹽含量采用濃硫酸-水楊酸比色法測(cè)定，亞硝酸鹽含量采用磺胺—α-萘胺法測(cè)定[20]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016和SPSS Statistics 23軟件分析，采用LSD法和Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著水平為0.05，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NRE2元件敲除靶位點(diǎn)的gRNA設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得NIA1和NIA2基因的ATG上游序列和2個(gè)NIA基因啟動(dòng)子的同源序列，通過(guò)在線分析工具CRISPR-P在NRE2元件附近的PAM區(qū)設(shè)計(jì)了敲除載體的gRNA寡聚核苷酸序列。在CRISPR/Cas9載體的At U6 啟動(dòng)子和Pol Ⅲ終止子之間插入gRNA片段后，獲得用于敲除NIA1和NIA2基因啟動(dòng)子中NRE2元件的單敲除載體與雙敲除載體(NIA1-Cas9-gRNA、NIA2-Cas9-gRNA、NIA1/NIA2-Cas9-gRNA)。重組CRISPR/Cas9載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 重組CRISPR/Cas9敲除載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of recombinant CRISPR/Cas9 knockout vector structure

2.2 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌陽(yáng)性鑒定與T0代轉(zhuǎn)基因K326煙株檢測(cè)

2.2.1 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌陽(yáng)性鑒定 利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，得到1 430 bp的序列片段，結(jié)果如圖2所示。表明重組CRISPR/Cas9載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株內(nèi)。

注：M：DL2000 DNA 標(biāo)記。1～3、4～6、7～9分別為重組載體NIA1-Cas9-gRNA、NIA2-Cas9-gRNA、NIA1/NIA2-Cas9-gRNA的農(nóng)桿菌菌落雙酶切產(chǎn)物。Note: M: DL2000 DNA Marker. 1～3, 4～6 and 7～9 are the double digestion products of Agrobacterium colonies of recombinant vectors NIA1-Cas9-gRNA, NIA2-Cas9-gRNA, NIA1/NIA2-Cas9-gRNA, respectively.圖2 重組CRISPR/Cas9載體雙酶切電泳圖Fig.2 Double enzyme digestion electrophoresis diagram of recombinant CRISPR/Cas9 vector

2.2.2 T0代轉(zhuǎn)基因K326煙株檢測(cè) 由圖3和圖4可知，從再生煙苗中擴(kuò)增得到425 bp的HYG基因片段和1 329 bp的Cas9基因片段，表明構(gòu)建的重組CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入K326 植株中。

注：M: DL 2000 DNA Maker；1～5：△NIA1突變體品系；6～10：△NIA2突變體品系；11～15：△NIA1+2突變體品系。Note: M: DL 2000 DNA Maker. 1～5: △NIA1 mutant strain. 6～10: △NIA2 mutant strain. 11～15: △NIA1+2 mutant strain.圖3 轉(zhuǎn)基因煙苗的HYG基因陽(yáng)性鑒定電泳圖Fig.3 Electrophoresis of HYG gene positive identification of transgenic tobacco seedlings

注：M: DL 2000 DNA Maker；1～5：△NIA1突變體品系；6～10：△NIA2突變體品系；11～15：△NIA1+2突變體品系。Note: M: DL 2000 DNA Maker. 1～5: △NIA1 mutant strain. 6～10: △NIA2 mutant strain. 11～15: △NIA1+2 mutant strain.圖4 對(duì)HYG基因鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙苗的Cas基因鑒定電泳圖Fig.4 Cas gene identification electrophoresis of transgenic tobacco seedlings identified as positive for HYG gene

2.3 煙葉硝酸還原酶活性和亞硝酸還原酶活性

由表3可知，NIA1和NIA2基因啟動(dòng)子序列中的NRE2元件被敲除后，與野生型K326相比，突變體△NIA1、△NIA2和△NIA1+2的NR活性分別下降了18.8、25.6和18.1個(gè)百分點(diǎn)。△NIA1和△NIA1+2的NiR活性與野生型相比分別升高了2.2和0.2個(gè)百分點(diǎn)，△NIA2的NiR活性相比野生型下降了16.6個(gè)百分點(diǎn)。

表3 不同基因型煙苗的葉中硝酸還原酶活性和亞硝酸還原酶活性Table 3 Nitrate reductase activity and nitrite reductase activities in leaves of different genotypes of tobacco seedlings /(μmol·h-1·g-1)

2.4 煙葉中硝酸鹽、亞硝酸鹽和總氮含量

表4 不同基因型煙苗的葉中硝酸鹽(NO3-)、亞硝酸鹽(NO2-)和總氮含量Table 4 Nitrate (NO3-), Nitrite (NO2-) and Total nitrogen contents in leaves of different genotypes tobacco seedlings

3 討論

本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除煙草NIA基因啟動(dòng)子中的NRE2元件后，與野生型相比，突變體葉片的NR活性與NO3-含量出現(xiàn)不同程度的降低(表3、表4)，表明NRE2元件與煙葉NR活性有關(guān)，該結(jié)果與Gao等[21]發(fā)現(xiàn)水稻OsNR2基因表達(dá)水平降低會(huì)引起葉片NR活性與NO3-積累量降低的結(jié)果相一致，說(shuō)明NRE2元件可能參與調(diào)控?zé)煵軳IA基因的轉(zhuǎn)錄。

亞硝酸還原酶(NiR)是硝酸鹽同化途徑中的第二個(gè)關(guān)鍵酶，可將NO2-進(jìn)一步還原成NH4+，以供給植物進(jìn)行氮素同化[1]。在本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的NR活性與野生型相比下降了18.1～25.6個(gè)百分點(diǎn)，但NiR活性和NO2-含量與野生型相比仍保持在較高水平，這種現(xiàn)象與擬南芥[22]、豌豆[23]、煙草[24]、大麥[25-26]等植物的研究結(jié)果一致，表明NRE2元件的缺失對(duì)NO2-還原過(guò)程無(wú)明顯影響。

植株全氮含量相對(duì)穩(wěn)定，可以很好地反映作物氮素營(yíng)養(yǎng)狀況[27]。本研究中，單敲除突變體的葉中總氮含量與野生型相比無(wú)顯著差異，雙敲除突變體的總氮含量與野生型相比顯著降低，表明單敲除突變體的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況正常，植株能夠正常生長(zhǎng)，雙敲除突變體則與之相反。該結(jié)果與Warner等[25]和Wilkinson等[28]發(fā)現(xiàn)硝酸還原酶單突變體能夠在以NO3-為唯一氮源的培養(yǎng)條件下正常生長(zhǎng)，而硝酸還原酶雙突變體卻不能正常生長(zhǎng)的結(jié)果相一致。推測(cè)敲除掉一個(gè)NIA基因啟動(dòng)子的NRE2元件，不影響突變體對(duì)氮素的同化利用；當(dāng)完全敲除掉NRE2元件后，將降低煙株對(duì)硝酸鹽的吸收同化能力，導(dǎo)致氮素營(yíng)養(yǎng)不足。

與野生型相比，單敲除突變體的NR活性低、NO3-積累量少，但總氮含量之間差異不明顯，表明單敲除突變體煙草植株可能會(huì)通過(guò)其他途徑補(bǔ)償因氮素吸收同化能力下降而導(dǎo)致的氮素營(yíng)養(yǎng)不足。已有研究表明，使用鎢酸鹽處理煙草植株，導(dǎo)致植株體內(nèi)NR活性降低，但NR-mRNA持續(xù)高表達(dá)，NR蛋白水平大幅提高[29]。結(jié)合Scheible等[30]和Signore等[31]的研究結(jié)果認(rèn)為，造成本試驗(yàn)中單敲除突變體的總氮含量與野生型一致的原因可能是：其一，突變體根系NR活性被誘導(dǎo)增加，即NR活性降低的突變體可以通過(guò)改變根部NR的調(diào)節(jié)來(lái)補(bǔ)償，而且在黑暗中的硝酸鹽還原同化能力比野生型更強(qiáng)，同化產(chǎn)物(谷氨酰胺、氨基酸等)能被更快地輸出，減弱了產(chǎn)物的反饋抑制。其二，NIA基因表達(dá)數(shù)量減少的突變體可以通過(guò)增加剩余NIA基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上改變NR的更新和翻譯后調(diào)控以獲得氮素同化能力補(bǔ)償。

Wilkinson等[28]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中NR活性主要與NIA2基因表達(dá)量有關(guān)。本研究中△NIA1的NR活性高于△NIA2，NO3-含量低于△NIA2，推測(cè)NIA2是煙草NIA基因中的主效基因。另外還發(fā)現(xiàn)，△NIA1+2突變體仍具有較高的NR活性，這可能與NLPs蛋白可作用于硝酸還原酶NIA1基因下游3′端的NRE元件有關(guān)[12]，認(rèn)為NIA1基因下游的NRE元件在NRE2缺失時(shí)起替補(bǔ)作用，但NRE元件和NRE2元件在調(diào)控NIA1基因表達(dá)過(guò)程中的主次作用尚不可知，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了硝酸還原酶基因啟動(dòng)子的NRE2元件缺失突變載體，并轉(zhuǎn)化煙草獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。突變植株的氮代謝相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，敲除硝酸還原酶基因啟動(dòng)子的NRE2元件后，煙草植株的葉中NR活性與NO3-含量降低，NiR活性與NO2-含量仍保持在較高水平。僅敲除NIA1和NIA2基因啟動(dòng)子中的一個(gè)NRE2元件，不會(huì)對(duì)煙株整體的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況產(chǎn)生負(fù)面影響；雙敲除后，則明顯降低煙草植株的總氮含量。表明NRE2元件對(duì)硝酸鹽的還原同化過(guò)程起著重要作用。