盆栽小菊組培快繁體系的建立及玻璃化研究

劉丹 陳天烺 王容 徐春光 吳海峰 趙鵬霞 陳煒 赫文韜

摘要 以盆栽小菊“子午線”的花瓣作為外植體，研究不同消毒時間對外植體污染率的影響，以及不同激素濃度對花瓣誘導愈傷組織和不定芽分化的影響;以及對緩解玻璃化苗方法的探討。結(jié)果表明，當使用次氯酸鈉處理花瓣時，7 min是最佳處理時間。MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+蔗糖30 g /L+瓊脂5 g/L是誘導花瓣愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，誘導率達98%。不定芽分化最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/ L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L，分化率達90.30%。培養(yǎng)基MS+6-BA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L是緩解菊花玻璃化現(xiàn)象的最佳配方，轉(zhuǎn)化為正常苗的轉(zhuǎn)化率最高，可達98.36%。

關鍵詞 花瓣;愈傷組織;玻璃化苗;誘導率;分化率

中圖分類號 S 682.1+1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2022）04-0044-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.014

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Establishment of Tissue Culture and Rapid Propagation System of Potted Chrysanthemum and Vitrification Study

LIU Dan，CHEN Tian-lang，WANG Rong et al

（Zhejiang Hifun Flower Co.， Ltd.，Shaoxing， Zhejiang312000）

Abstract The petals of potted Chrysanthemum “Meridian” were used as explants to study the effects of different disinfection times on explant contamination rate and hormone concentration on petal-induced callus and adventitious bud differentiation. The methods of alleviating vitrification were also discussed. The results showed that when the petals were treated with sodium hypochlorite， 7 min was the best treatment time.MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+sucrose 30 g/L+ agar 5 g/L was the best medium to induce petal callus， the induction rate was 98%.MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ sucrose 30 g/L+ Agar 5 g/L was the optimum medium for adventitious bud differentiation， the differentiation rate was 90.30%.To solve the problem of vitrification， MS+6-BA 0.2 mg/L+sucrose 30 g/L+Agar 5 g/L was the best formula to alleviate the vitrification of Chrysanthemum， and the highest transformation rate was achieved to 98.36% .

Key words Petals;Callus;Vitrification;Induction rate;Differentiation rate

菊花（Chrysanthemum morifolium）為菊科菊屬多年生草本花卉[1]，是世界四大切花與我國十大傳統(tǒng)名花之一，因其花色豐富，品種繁多，花型多變而深受人們喜愛[2]。盆栽小菊的花徑一般小于6 cm，節(jié)間較短，分枝能力強，花朵數(shù)多且花期長[3]，花色絢麗多彩，株型豐滿圓潤，優(yōu)良品種的株型通常呈球形或者密叢狀，觀賞價值極高[4]，廣泛應用于園林綠化美化、家庭園藝和節(jié)日花展、專題展覽[5]，在花卉市場占據(jù)較大份額。目前，盆栽小菊的繁殖方式是最常見的扦插繁殖，但頻繁使用插穗進行無性繁殖導致品種退化，影響菊花的花色、花型和株型等品質(zhì)，從而大大減少了花卉市場中菊花品種的種類。植物組織培養(yǎng)可以解決傳統(tǒng)繁殖中存在的一些問題，前人有關菊花組織培養(yǎng)再生體系建立的技術方面做了大量工作，但研究表明由于菊花基因型的不同，其再生體系不存在普遍性[6]，所以需要針對不同的菊花品種進行組織培養(yǎng)再生體系建立的研究[3]。筆者以盆栽小菊花瓣為外植體建立組培快繁體系，并對試驗中出現(xiàn)的褐化問題進行研究，旨在為以后的菊花母本復壯和新品種培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年10月19日在浙江省紹興市柯橋區(qū)平水鎮(zhèn)浙江海豐花卉有限公司種植基地采摘淺紫色小菊“子午線”花朵4個，其直徑約3 cm，開放度為4度，并在浙江海豐花卉有限公司實驗室開展試驗。

1.2 方法

1.2.1 不同消毒時間對外植體污染率的影響。

以菊花花瓣作為外植體，首先用洗潔精水處理15 min，處理后用自來水流水沖洗1 min;多菌靈1 000倍液處理30 min，同上取出用自來水流水沖洗1 min;然后置于超凈工作臺，用75%的乙醇溶液處理30 s，無菌水沖洗3次;最后用次氯酸鈉溶液（有效氯為5%）分別處理3、5、7、9、11 min，無菌水分別沖洗5次，取出后用手術刀將花瓣四周切出傷口，分別接種于含有誘導愈傷組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種6個花瓣，培養(yǎng)7 d后觀察生長情況，統(tǒng)計外植體的污染率。污染率=污染數(shù)/接種數(shù)×100%，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度（22±2）℃，光照強度2 000 lx，光照時間14 h/d。

1.2.2 不同激素對花瓣誘導愈傷組織的影響。

以MS為基本培養(yǎng)基，采用單因素完全隨機區(qū)組試驗設計，設置6-BA濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，NAA濃度為1.0 mg/L，MS作為對照，共6個處理。將消毒后的花瓣四邊切出傷口，正面朝上分別平鋪接種于6個處理的培養(yǎng)瓶中誘導愈傷組織，每個處理接種10瓶，每瓶接種6個花瓣，共60瓶。每個處理均添加蔗糖濃度30 g/L和瓊脂5 g/L，pH為6.0。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度（22±2）℃，光照強度2 000 lx，光照時間14 h/d。7 d后定期觀察愈傷組織誘導情況，30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。愈傷組織誘導率=愈傷組織數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.3 不同激素組合對愈傷組織分化不定芽的影響。

將誘導出的愈傷組織切成1mm×1mm的小團，分別接種在含有不同激素組合的組培瓶中進行不定芽分化培養(yǎng)，每瓶接6團，每個處理接10瓶。試驗設置的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，6-BA濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，NAA濃度分別為0.1、0.2 mg/L，MS為對照培養(yǎng)基，pH為6.0。培養(yǎng)條件：溫度（22±2） ℃，光照強度2 000 lx，光照時間14 h/d，培養(yǎng)10 d后開始觀察不定芽分化情況，60 d后統(tǒng)計不定芽分化率。不定芽分化率=不定芽數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.4 緩解玻璃化苗的有效措施。

分化出的不定芽出現(xiàn)嚴重的玻璃化現(xiàn)象，將玻璃化苗移至濃度較低的培養(yǎng)基中進行緩苗培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，設置6-BA濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L，MS作為對照培養(yǎng)基，蔗糖30 g/L，瓊脂5 g/L，pH 6.0，每瓶接種6株。緩苗培養(yǎng)7 d后定期觀察苗的生長情況，30 d后統(tǒng)計正常苗轉(zhuǎn)化率。正常苗的轉(zhuǎn)化率=正常苗數(shù)/接種數(shù)×100%。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度（22±2） ℃，光照強度2 000 lx，光照時間8 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體污染率的影響

從表1可以看出，以花瓣作為外植體誘導愈傷組織，不同消毒時間處理外植體對污染率的影響效果差異顯著。處理③，即當采用乙醇處理30 s，次氯酸鈉溶液處理7 min時，花瓣的污染率最低，僅為5.00%，愈傷組織狀態(tài)最好，無褐化現(xiàn)象。因此，當使用次氯酸鈉處理花瓣時，7 min是最佳處理時間。

2.2 不同激素濃度對花瓣誘導愈傷組織的影響

從表2可以看出，以花瓣作為材料，不同處理誘導愈傷組織的效果差異顯著。處理⑤，即6-BA濃度為2.0 mg/L，NAA濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織的誘導率最高，出愈時間最短（圖1A），極顯著高于其他處理，誘導率達93.33%。因此，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L是誘導花瓣愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。

2.3 不同激素組合對愈傷組織誘導不定芽的影響

從表3可以看出，以小菊愈傷組織為材料，采用不同激素組合對不定芽分化的效果差異顯著。處理④，即培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/ L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L的分化率極顯著高于其他處理，達86.67%，僅培養(yǎng)25 d后出苗，玻璃化程度較輕（圖1B）。處理①，即對照與其他處理相比，不定芽分化數(shù)為0，其他處理均有分化苗，說明激素6-BA和NAA對不定芽的分化起著關鍵性的作用;處理②和③相比，NAA濃度相同時，隨著6-BA濃度的增加，不定芽分化率呈升高趨勢;而處理④和⑤相比，NAA濃度同為0.1 mg/L時，隨著6-BA濃度的增加，分化率反而呈下降趨勢，說明過高的激素濃度抑制不定芽分化。因此，MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L是最適宜小菊不定芽分化的培養(yǎng)基。

2.4 緩解玻璃化苗的有效措施

以花瓣愈傷組織誘導出的不定芽出現(xiàn)不同程度的玻璃化現(xiàn)象，采用不同濃度的6-BA對玻璃化苗進行處理，結(jié)果見表4。從表4可以看出，5個處理對于玻璃化苗的影響差異顯著。處理③，即6-BA濃度為0.2 mg/L時，玻璃化苗轉(zhuǎn)化為正常苗的數(shù)量最多，即轉(zhuǎn)化率最高可達98.36%，極顯著高于其他處理，植株健壯，葉片厚而綠，伴隨有增殖，未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象（圖1C）;而其他處理正常苗轉(zhuǎn)化的周期長，未出現(xiàn)增殖，且植株脆弱，部分葉片稍薄且出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。因此，培養(yǎng)基MS+6-BA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L是最適合緩解菊花組培苗玻璃化現(xiàn)象的配方。

2.5 生根培養(yǎng)及組培瓶苗移栽

將無菌苗切成帶1～2片葉的1～2 cm的莖段，接種至MS+6-BA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L+活性炭0.5 g/L培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，14 d后根長3 cm左右，根數(shù)5～6條，生根率達100%（圖2A）。

待苗高長至5 cm左右時，將組培瓶苗移至大棚。在大棚適應0.5 d后擰松瓶蓋，第2天打開瓶蓋，適應3 d后取出生根苗洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至72孔穴盤中（圖2B），使用 1 000倍液多菌靈消毒，基質(zhì)為椰糠和泥炭1∶1混合，溫度為20～23 ℃，定期澆水施肥，20 d后移出穴盤種植在土中，成活率100%（圖2C）。

3 結(jié)論與討論

與菊花帶芽莖段、葉片、花托等外植體比較而言，花瓣和莖尖的病毒含量較少[3]?；ò曜鳛榻M織培養(yǎng)的外植體具有取材容易的特點[7]，且其變異率高于具有分生組織的外植體且變異主要體現(xiàn)在花色、花徑、花型等特性上[8-9]。該試驗以盆栽小菊“子午線”的花瓣作為外植體，研究不同培養(yǎng)基對花瓣誘導愈傷組織的影響，結(jié)果表明，6-BA濃度為2.0 mg/L，NAA為1.0 mg/L時，愈傷組織的誘導率最高達98%，分別高于劉興玉等[10]和曾凡力[11]而低于鄧麗娟等[12]誘導花瓣愈傷組織的誘導率，出愈時間較短，培養(yǎng)10 d后在花瓣邊緣出現(xiàn)綠色的愈傷，顆粒狀疏松，無褐化現(xiàn)象。

以小菊愈傷組織為材料，探究不同激素組合對分化不定芽的效果，結(jié)果表明，6-BA濃度為3.0 mg/L，NAA濃度為0.1 mg/L，愈傷組織分化不定芽的分化率最高，達90.30%，這與以花瓣為外植體進行組織培養(yǎng)中分化率過低和出芽率過低的結(jié)果不同[11-13]，可能與菊花的品種不同有關。

植物組織培養(yǎng)過程中通常會出現(xiàn)一些玻璃化現(xiàn)象，植物組培苗的這種生理性病變可能是在高濃度激素以及高濕度的培養(yǎng)條件下形成的[14]，與正常組培苗相比，表現(xiàn)為葉片呈透明、卷曲、條形狀[15]，不定芽分化能力差，增殖、生根率低等[16]。該研究針對不同玻璃化程度的組培苗采用較低濃度的6-BA進行緩解玻璃化，結(jié)果表明，玻璃化程度輕的組培苗在6-BA濃度為0.2 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后發(fā)生逆轉(zhuǎn)，得到正常組培苗的數(shù)量最多，即轉(zhuǎn)化率最高達98.36%，但較嚴重的玻璃化苗沒有發(fā)生逆轉(zhuǎn)，在培養(yǎng)過程中褐化死亡，這與較嚴重的玻璃化幼苗即使轉(zhuǎn)移到良好的培養(yǎng)條件中也無法逆轉(zhuǎn)的結(jié)論一致[17]，該試驗的研究結(jié)果將為解決菊花玻璃化苗提供一定的數(shù)據(jù)參考。

參考文獻

[1] 吳鑫.小菊品種‘炫彩’和‘紫裳粉霓’的測試及評價[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2016.

[2] 沈佳逾.造型菊選育及其配套栽培技術研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2014.

[3] 劉萌萌.盆栽小菊高頻再生體系建立與試管開花研究[D].銀川：寧夏大學，2017.

[4] 王青.盆栽多頭小菊株型改良的育種研究[D].北京：北京林業(yè)大學，2013.

[5] 沈瑤，王晗璇，侯海嫻，等.引進盆栽小菊品種觀賞價值及園林應用的綜合評價[J].廣西植物，2021，41（8）：1363-1371.

[6] 徐士清，楊世湖，倪丹，等.非洲菊試管苗葉片的組培快繁[J].園藝學報，2002，29（5）：493-494，504.

[7] 劉國華，陳海燕，宋剛，等.非洲菊花瓣的離體培養(yǎng)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2004，32（2）：316-317.

[8] 王康才，張雪瓊，茅毓英.杭菊花花瓣組織培養(yǎng)[J].中草藥，2000，31（8）：628-630.

[9] 鄧年方，吳桂容.菊花花瓣的組培快繁技術研究[J].賀州學院學報，2007，23（3）：144-145.

[10]劉興玉，蒲紅.菊花花瓣的組織培養(yǎng)[J].西南農(nóng)業(yè)大學學報，1990，12（2）：204-206.

[11] 曾凡力.菊花花瓣的組織培養(yǎng)[J].北方園藝，2007（9）：207-208.

[12] 鄧麗娟，萬子昱，駱淑媛.激素對菊花組織培養(yǎng)的影響[J].綠色科技，2018（24）：177-178.

[13] 毛洪玉，李曉輝，劉志剛，等.地被菊幼嫩花瓣組織培養(yǎng)研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2005，36（1）：68-71.

[14] DEBERGH P，HARBAOUI Y，LEMEUR R.Mass propagation of globe artichoke（Cynara scolymus）：Evaluation of different hypotheses to overcome vitrification with special reference to water potential[J].Physiologia plant，1981，53（2）：181-187.

[15] 袁佳，胡恒康，方炎明，等.不同培養(yǎng)條件對鐵線蓮不定芽增殖及玻璃化的影響[J].西北植物學報，2011，31（2）：401-406.

[16] LIN S Z，ZHANG Z Y，LIN Y Z，et al.Comparative study on antioxidative system in normal and vitrified shoots of Populus suaveolens in tissue culture[J].Forestry studies in China，2004，6（3）：1-8.

[17] 黃宇翔，吳祖建，柯昉，等.組織培養(yǎng)技術篩選香石竹低玻璃化無性系初報[J].中國農(nóng)學通報，2006，22（8）：88-90.

3400500338284