氮代謝相關(guān)酶的研究進展

徐洪超 商靖 劉銘薈 張飛 李玥瑩

摘要 氮代謝是植物體內(nèi)的基本生理代謝過程之一，包括氮素同化、積累和蛋白質(zhì)合成等過程，與植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的聯(lián)系非常密切。氮代謝的生理過程在酶的催化下完成，與氮代謝的生理過程密切相關(guān)的酶有：硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、轉(zhuǎn)氨酶（谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶）、谷氨酸合酶、谷氨酸脫氫酶等關(guān)鍵酶。這5種酶在植物氮代謝過程中具有重要的作用，簡要介紹這幾種酶的基本結(jié)構(gòu)與特性、對作物生長發(fā)育的調(diào)控等，為進一步探究氮代謝研究機制提供有益的參考。

關(guān)鍵詞 硝酸還原酶;谷氨酰胺合成酶;谷氨酸合酶;轉(zhuǎn)氨酶;谷氨酸脫氫酶

中圖分類號 Q945.1? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）04-0017-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.005

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Research Progress of Enzymes Related to Nitrogen Metabolism

XU Hong-chao，SHANG Jing，LIU Ming-hui et al （College of Life Sciences， Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034）

Abstract Nitrogen metabolism is one of the basic physiological metabolic processes in plants， including processes such as nitrogen assimilation， accumulation and protein synthesis. It is closely related to plant growth， yield and quality. The physiological process of nitrogen metabolism is completed under the catalysis of enzymes. The enzymes closely related to the physiological process of nitrogen metabolism are： nitrate reductase， glutamine synthetase， transaminase （glutamate oxaloacetate transaminase， glutamate pyruvate transaminase ）， glutamate synthase， glutamate dehydrogenase and other key enzymes. These five enzymes play an important role in the process of plant nitrogen metabolism. The basic structure and characteristics of these enzymes and the regulation of crop growth and development are briefly introduced to provide a useful reference for further exploring the research mechanism of nitrogen metabolism.

Key words Nitrate reductase;Glutamine synthetase;Glutamate synthase;Transaminase;Glutamate dehydrogenase

基金項目

遼寧省教育廳重點攻關(guān)項目（LZD201901）;遼寧省自然科學(xué)基金面上項目（2019-MS-197）。

作者簡介 徐洪超（1998—），女，遼寧朝陽人，碩士研究生，研究方向：植物基因工程。*通信作者：張飛，副研究員，博士，從事高粱育種與栽培生理研究;李玥瑩，博士，從事植物基因工程研究。

收稿日期 2021-05-28

氮素是植物代謝過程所需要的重要營養(yǎng)元素之一，植物吸收的氮主要分為有機氮化物和無機態(tài)氮兩類。植物不能直接把空氣中的氮氣轉(zhuǎn)化為自身利用，它們一般吸收利用土壤或者環(huán)境中的NO3-或者NH4+，在相關(guān)酶的作用下合成谷氨酰胺和谷氨酸，然后經(jīng)過轉(zhuǎn)氮作用形成不同的氨基酸，再合成蛋白質(zhì)。氮代謝與植物的生長發(fā)育以及產(chǎn)量等方面有著密切的聯(lián)系。在植物體內(nèi)，與氮代謝密切相關(guān)的酶主要有5種，這5種酶對作物的生長發(fā)育、氮素同化與積累、應(yīng)對逆境等情況都起著調(diào)控作用，因此，筆者針對植物氮代謝過程中的幾種酶的研究進展進行概述，以期為進一步探究氮代謝研究機制提供有益的參考。

1 硝酸還原酶

1.1 硝酸還原酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）是一種氧化還原酶，存在于細胞質(zhì)內(nèi)或細胞膜外。該酶的活性最適pH為7.9左右，最適溫度為20～25 ℃。該酶發(fā)生作用的平衡常數(shù)為1025～1040，反應(yīng)進行的方向傾向于生成亞硝態(tài)氮，所以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的反應(yīng)幾乎是單向的[1]。

NR屬于二聚體結(jié)構(gòu)，組成NR的每個亞基含有3個輔助因子，即血紅素、FAD和鉬輔因子，3個區(qū)域通過鉸鏈區(qū)域連接[2]。不同生物中，NR的分子量是有很大不同的。植物體內(nèi)與NR的相關(guān)基因主要有Nia1和Nia2兩個基因。在衣藻屬中已證實NR可以將電子從NAD（P）H轉(zhuǎn)移到ARC[3]，除此之外，NAD（P）H-NR還可以將電子轉(zhuǎn)移到THB1上，THB1通過其雙加氧酶活性催化NO轉(zhuǎn)化為硝酸鹽[4]。

NR屬于多結(jié)構(gòu)域蛋白中的一種。由于NR蛋白產(chǎn)量低、體積大、結(jié)構(gòu)靈活和復(fù)雜等特性，通過X射線衍射分析來了解NR蛋白結(jié)構(gòu)一直沒有實現(xiàn)。經(jīng)過長時間的研究試驗，玉米NR的NADH/FAD和血紅素結(jié)構(gòu)域以及煙草的血紅素結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型被成功建立[5]。

NR還是一種光合自養(yǎng)生物體內(nèi)的誘導(dǎo)酶，它的活性與植物體內(nèi)代謝過程的關(guān)系十分密切[6]。NR的活性受到環(huán)境因素和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等因素的影響，比如光照、硝酸鹽、生物節(jié)律等因素都能影響NR的表達效果。其中光和硝酸鹽濃度對NR的影響尤為明顯。目前，NR已相繼從茶樹[7]、菠菜[8]、甜菜[9]、水稻[10]等多種植物中被克隆出來。

1.2 NR對作物生長發(fā)育的影響

NR是植物氮素同化過程中的第一個酶，也是整個硝態(tài)氮同化過程的關(guān)鍵酶、限速酶，在植物代謝調(diào)控中具有非常重要的地位[11]。該酶可以通過硝酸鹽來影響氮代謝，并且與碳代謝也會有一定的聯(lián)系。

王雷山等[12]研究表明，推遲棉花的播種期，棉花初花期后葉片NR活性與產(chǎn)量呈正相關(guān)。楊忠良等[13]對水稻的研究表明，蛋白質(zhì)含量高的品種幼苗NR活性高于蛋白質(zhì)含量低的品種，這表明NR活性可以影響作物的質(zhì)量。張浩瑋等[14]對草地早熟禾的研究中發(fā)現(xiàn)，氮積累量與NR活性呈顯著正相關(guān)。在施肥條件相同的情況下，蔬菜中的NR活性提高了肥料的利用率，同時蔬菜的產(chǎn)量也有所增加[15]。這些研究均表明，高活性的NR對植物的生長發(fā)育及產(chǎn)量等都有著積極的作用。

1.3 NR對植物抗逆性的調(diào)控

植物受到脅迫時，NO可以作為第二信使作出響應(yīng)，減少傷害。NR可以催化亞硝酸鹽還原成NO，從而在植物逆境中發(fā)生響應(yīng)。

俞珊等[16]對苦草進行研究發(fā)現(xiàn)，在較低濃度鉛脅迫下，較高的NR的活性植物表現(xiàn)出對重金屬脅迫的耐性。潘玲玲[17]將黃瓜的NR基因轉(zhuǎn)入到煙草植株內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因的煙草植株，與野生型相比較，轉(zhuǎn)基因植株可以減少逆境脅迫下產(chǎn)生的生理傷害、提高抗氧化酶活性，緩解NO3-脅迫。謝寅峰等[18]對針葉樹幼苗進行研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，NR活性較強的樹種抗旱能力也比較強。以上研究均表明NR涉及一些生物和非生物脅迫的響應(yīng)，可以提高作物的抗性。

2 谷氨酰胺合成酶

2.1 谷氨酰胺合成酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）是“GS-GOGAT循環(huán)”的第一酶[19]，廣泛存在于高等植物、動物、微生物中。該酶主要的作用是催化谷氨酰胺的合成，是氮代謝的關(guān)鍵酶。谷氨酰胺是植物體內(nèi)氮的運輸形式，可以起到解除氨毒害的作用。在ATP發(fā)揮活性的條件下，谷氨酸在GS的催化下可以合成谷氨酰胺[20]。GS還能夠與谷氨酸合成酶相偶聯(lián)，將氨基供給α-氨基酸，所以說GS與植物蛋白質(zhì)的合成也有著重要的聯(lián)系。

根據(jù)分子量、基因序列等的不同，GS同工酶分為3類，分別為GS Ⅰ、GS Ⅱ和GS Ⅲ，3類同工酶的分布范圍有所不同[21]。高等植物的器官中分布著多種GS的同工酶（屬GS Ⅱ類），分為GS1、GS2、GSx 3類。其中GS1、GS2發(fā)揮的作用比較多，而GSx含量較少，GS1與儲存氮源、氮素的轉(zhuǎn)移再利用有關(guān)，GS2主要參與硝酸還原產(chǎn)生的氨的同化以及光呼吸過程[22]。GS同工酶的亞基組成的數(shù)量和結(jié)構(gòu)有所差別，種類和功能也有所不同。

GS基因的表達受氮素水平、植物發(fā)育程度、光照、脅迫因子及氮源形式等多種因素的影響，其中氮素形態(tài)及水平的影響是比較重要的[23]。GS基因已經(jīng)從甜瓜[24]、甜菜[25]、小麥[26]等作物中被克隆。

2.2 GS對作物逆境的調(diào)控 氮素是作物生長發(fā)育所需要的主要營養(yǎng)元素之一，GS是氮素代謝過程中重要的關(guān)鍵酶。GS可以對逆境中的作物進行調(diào)控，提高抗性。

逆境條件可以刺激植物體內(nèi)GS的活性和相應(yīng)基因的表達。孫輝等[27]以水稻為研究對象，將GS1和GS2基因整合到轉(zhuǎn)基因水稻的基因組中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻的抗逆性有所增加。黃其滿等[28]在對轉(zhuǎn)基因小麥的研究中發(fā)現(xiàn)，GS基因在小麥植株中有效表達，可以使其表現(xiàn)出抗草胺膦特性，相比于對照植株葉片逐漸變黃，轉(zhuǎn)基因小麥植株能正常結(jié)實。

2.3 GS對作物氮素同化的調(diào)控作用 GS與作物氮的同化吸收和再利用關(guān)系密切，該酶可以提高植物對氮素的利用效率，從而影響植株的產(chǎn)量。

旗葉是小麥的主要營養(yǎng)器官，可以進行氮儲存和氮同化，與籽粒的產(chǎn)量與品質(zhì)密切相關(guān)，王小純等[29]對不同專用型小麥進行研究時發(fā)現(xiàn)，小麥旗葉GS活性與籽粒蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。Cai等[30]在水稻中的試驗發(fā)現(xiàn)，在溫室中培養(yǎng)超表達GS1的轉(zhuǎn)基因水稻，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)可溶蛋白和氮含量均提高。Cruz等[31]在以擬南芥為試驗材料進行研究時發(fā)現(xiàn)，GS1基因家族中2個基因可以對NH4+刺激作出響應(yīng)，提高植物根中氮的同化利用效率。

3 谷氨酸合酶

3.1 谷氨酸合酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

谷氨酸合酶（glutamate synthase，GOGAT）是氨同化途徑中關(guān)鍵酶，能夠與GS偶聯(lián)，共同完成氨同化的過程。此酶可催化谷氨酰胺的氨基還原轉(zhuǎn)移于α-酮戊二酸，生成谷氨酸。根據(jù)電子供體的不同，GOGAT主要分為3種類型：NADH-GOGAT型、Fd-GOGAT型和NADPH-GOGAT型[32]。在高等植物中，前兩種形式是比較普遍的。NADH-GOGAT主要與氮類物質(zhì)的轉(zhuǎn)移運輸相關(guān)聯(lián)。

GOGAT基因的表達受氮素、光照、作用部位等的影響[33]。陳陽等[34]對草地早熟禾的研究發(fā)現(xiàn)，氮濃度較低時，NADH-GOGAT基因的表達量更多。NADH-GOGAT還受水分、環(huán)境等因素的影響。Fd-GOGAT在葉綠體中的活性比較高。Fd-GOGAT基因已經(jīng)從水稻[35]、馬鈴薯[36]、大豆[37]等作物中克隆出來。

3.2 GOGAT對氮素積累起調(diào)控作用

GOGAT是GS/GOGAT循環(huán)同化途徑的關(guān)鍵酶之一，GOGAT活性還與氮素積累密切相關(guān)。張瑋琦[38]在對水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，在分蘗期，氮素積累量與GOGAT活性呈顯著正相關(guān)。朱靜等[39]對靈芝進行試驗研究，推測靈芝GOGAT的缺失是通過影響胞內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)來影響靈芝三萜的生物合成，從而影響氮源調(diào)控靈芝次級代謝的分子機制。

3.3 GOGAT對作物產(chǎn)量與品質(zhì)的作用

GOGAT對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)起著積極作用。陳展宇等[40]在對大豆根系的研究試驗中發(fā)現(xiàn)，大豆苗期、鼓粒期、成熟期，GOGAT活性與產(chǎn)量呈正相關(guān)，盛花期和結(jié)莢期呈顯著正相關(guān)。趙全志等[41]在對水稻葉色的研究中發(fā)現(xiàn)，GOGAT酶與葉色變化的關(guān)系相對密切，影響作物碳氮代謝的強度和產(chǎn)量的形成。劉業(yè)麗等[42]對不同基因型的大豆進行研究表明，在R4期的葉片與莖稈中，GOGAT的活性與籽粒蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)。滕祥勇[43]在以甜菜作為研究材料時發(fā)現(xiàn)，甜菜葉片中隨著Fd-GOGAT活性的提高，產(chǎn)量呈極顯著的增加，并且GOGAT的活性與作物中的含糖率關(guān)系也十分緊密。

4 谷氨酸脫氫酶

4.1 谷氨酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）是一種多聚酶，廣泛存在于生物界中[44]。根據(jù)輔酶的特異性，可以將GDH分為NADP依賴型、NAD依賴型和非依賴型NAD（P）3類。GDH的相對分子量為255～270 kD，一般由6個亞基組成，分為α和β兩種類型，并且含有多種形式的同工酶[45]。在GDH的催化下可以生成谷氨酸，GDH易受外部因素如溫度、光照、pH、NO3-、NH4+等影響[46]。到目前為止，GDH基因已經(jīng)在小麥[47]、玉米[48]、花生[49]等作物中被克隆出來。

4.2 GDH在作物抗逆條件下的響應(yīng) GDH是研究植物氮代謝的重要指標之一，可以在植物的衰老過程及逆境等狀況下發(fā)揮作用。

張彩生[50]在研究水稻抗旱品種過程中，將稻瘟病菌GDH基因在水稻中進行表達時發(fā)現(xiàn)，該基因可以改變氣孔的開放和增加脯氨酸等小分子的量，使水稻具有較高的抗旱能力。Kumar等[51]在對水稻進行鹽脅迫試驗時發(fā)現(xiàn)，耐鹽水稻GDH的氨同化活性比較高。Valliyodan等[52]發(fā)現(xiàn)，GDH可以催化谷氨酸合成，使脯氨酸的含量增加，增強了植物的耐逆性。由此可見，GDH可以在逆境條件下發(fā)生響應(yīng)。

4.3 GDH對作物氮素利用率的調(diào)控作用 GDH還與作物的氮素利用率關(guān)系非常緊密。周香城[53]將真菌埃倫柱孢GDH基因表達到水稻中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻苗期的氮素利用率有所提高。Egami等[54]將構(gòu)巢曲霉的NADP（H）-GDH基因在馬鈴薯中進行過量表達，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯的塊莖干物質(zhì)增加，并且在低氮條件下，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖的氮素利用率也有所提高。以上研究均表明，GDH對作物氮素利用率有積極的調(diào)控作用。

5 轉(zhuǎn)氨酶

5.1 轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

轉(zhuǎn)氨基作用是植物進行氮代謝的重要過程之一，可以促進氨基酸的合成和分解。植物體內(nèi)最普遍的轉(zhuǎn)氨酶主要包括2種：谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）。

GOT又稱天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，是天門冬氨酸合成的關(guān)鍵酶，在該酶的催化下，L-谷氨酸和草酰乙酸可以反應(yīng)生成L-門冬氨酸和α-酮戊二酸。GOT是存在于所有真核細胞的胞內(nèi)酶，該酶最適生長溫度為37 ℃，徐凡等[55]對煙草的試驗表明，Mn2+、Fe2+、Zn2+對GOT激活作用的程度不同，Ca2+對GOT有抑制作用。

GPT的輔酶為磷酸吡哆醛，是丙氨酸合成的關(guān)鍵酶。根據(jù)物種的不同，GPT可分為2～6個亞型，細胞質(zhì)、線粒體和過氧化酶體中均可以發(fā)現(xiàn)其亞型的存在[56]。GPT可以催化L-谷氨酸和丙酮酸生成L-丙氨酸和α-酮戊二酸。郭旭舜等[57]對大豆下胚軸進行試驗發(fā)現(xiàn)，GPT最適溫度為35 ℃，最適pH 7.0，Co2+、Mg2+和Ca2+對其有激活效應(yīng)，EDTA2-、尿素、Mn2+和Fe2+對其有抑制效應(yīng)。

5.2 轉(zhuǎn)氨酶在氮素固定方面的作用

轉(zhuǎn)氨基作用可以促進丙酮酸、α-酮戊二酸與氨基酸的互變，對糖和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物的相互轉(zhuǎn)變具有重要意義。轉(zhuǎn)氨酶是一種轉(zhuǎn)移酶，該酶可以催化轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，還能反映葉片氮同化、氨轉(zhuǎn)運和貯藏狀態(tài)，從而協(xié)調(diào)氮代謝與碳代謝。

江立庚等[58]對水稻研究發(fā)現(xiàn)，GPT活性的變化對氮素吸收利用的影響比較大。提高劍葉GPT活性可以顯著增加氮素積累總量，并且硅肥可通過提高葉片中GPT酶活性，促進水稻對氮素的吸收作用。王顯等[59]在對水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，施用氮肥或者硅肥能提高葉片中轉(zhuǎn)氨酶的活性，促進水稻氮代謝水平，提高蛋白質(zhì)含量。稻米的種類不同，GPT、GOT活性的變化規(guī)律也不完全一致。另外，F(xiàn)arnham等[60]在以苜蓿根瘤菌作為試驗材料時也發(fā)現(xiàn)，GOT在作物氮素固定和吸收方面起著重要的作用。

5.3 轉(zhuǎn)氨酶在抵御非生物脅迫方面發(fā)揮的作用

轉(zhuǎn)氨酶不僅在植物的碳氮代謝過程中有著不可或缺的作用，還可以在抵抗非生物脅迫方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

Miyashita等[61]在擬南芥研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧情況下會誘導(dǎo)植物中GPT基因的表達量增加。說明GPT可以在缺氧的情況下發(fā)揮調(diào)控作用。崔新等[62]在對茶樹的試驗中發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下茶樹中的GPT可以累積較多的丙氨酸。GOT還有多種同工酶，分布的位置不同使得其功能與活性也不相同。瞿炤珺[63]在以寒地粳稻為試驗材料時發(fā)現(xiàn)，在冷水脅迫下，該植株根系的酶活性上升，且增幅逐漸增加。

6 結(jié)語

植物的氮代謝過程對植物的抗逆作用以及生長發(fā)育等方面有著非常重要的意義。植物體內(nèi)的氮代謝過程是一個需要多種酶相互配合、協(xié)調(diào)的復(fù)雜過程。對氮代謝過程進行詳細的探究可以了解植物體內(nèi)的生理機制，從而培養(yǎng)出符合期望的理想品種。目前對氮代謝相關(guān)酶的研究是比較廣泛的，并且在很多作物的研究中取得了很大進展。在許多作物中已經(jīng)克隆出了相關(guān)的酶的基因，揭示其影響氮代謝的本質(zhì)，有助于指導(dǎo)作物改良的過程。

但是仍有一些問題有待解決，例如轉(zhuǎn)氨酶在作物中的研究報道相對較少，在氮代謝和抗逆過程的作用機理也有待深入研究。對于GDH而言，GDH多用于低等植物的研究，高等生物優(yōu)質(zhì)GDH的發(fā)掘和鑒定還有待研究，這也為下一步的研究提供了方向。

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