醬香型白酒丟糟中類黑精的檢測及提取工藝研究

李芳香，楊婷婷，張 穩(wěn)，趙 亮，郁建平，莫新良，王新葉*

（1.茅臺學(xué)院釀酒工程系，貴州 仁懷 564500；2.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院民族中獸藥分離純化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，貴州 銅仁 554300）

貴州仁懷為醬香型白酒的主要產(chǎn)地，其特殊的生態(tài)環(huán)境和獨(dú)特的釀造工藝，造就了貴州白酒的獨(dú)特醬香優(yōu)勢[1]。鮮丟糟含有60%左右的水分，13.3%的粗蛋白，7%左右的粗淀粉和粗纖維，2%～3%的粗脂肪和灰分，含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，濕度大，易腐敗且不易保存[2]。其一般作為原料發(fā)酵產(chǎn)甲烷、乙醇等有機(jī)溶劑，產(chǎn)飼料蛋白、化工原料（如丁二酸、甘油、乳酸和植酸等），丟糟還可作為生產(chǎn)材料，如黃酒丟糟餅干[3]、纖維素、木塑復(fù)合材料、活性炭、水泥添加劑；發(fā)酵生產(chǎn)食醋、食用菌、乳酸鏈球菌素和有機(jī)肥等[4]。在煙草種植的土壤中使用丟糟，可以很大程度減少煙草病蟲害的發(fā)生，改善煙草的生長狀況，還能有效提高煙草的品質(zhì)[5]。

研究表明，類黑精具有抗氧化[6]、降血糖、抗突變、抑菌、抗增殖、抗過敏、降血壓、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用，對食物的色澤和風(fēng)味有重大貢獻(xiàn)[7]。其對延長食物保質(zhì)期也具有重要意義，有助于提高加工食品的色澤和風(fēng)味，對健康有益[8]。在全國推行綠色可持續(xù)發(fā)展的理念下，通過從醬香型白酒丟糟中提取類黑精物質(zhì)，減少丟糟的浪費(fèi)，提高丟糟的利用率，在一定程度上可以推動白酒企業(yè)的全面發(fā)展，減少經(jīng)濟(jì)損失和對環(huán)境的污染，為企業(yè)發(fā)展創(chuàng)造新的效益點(diǎn)。

目前國內(nèi)外研究主要對可可、蜂蜜[9]、面包[10]、老陳醋[11]、黑芝麻[12]、麥芽、黑參、黑啤酒[13]、咖啡[14]及豆豉等物質(zhì)中的類黑精進(jìn)行研究，類黑精作為多數(shù)食品加熱和貯存過程中普遍存在的產(chǎn)物，其保健功能和生理活性引起各國學(xué)者的高度關(guān)注[15]，對類黑精抗菌活性[16]、抗氧化活性[17]、抗癌活性和風(fēng)味物質(zhì)方面的研究成為熱點(diǎn)[18-19]，類黑精的主要提取方法有乙醇溶液浸提法[20]、沉淀法[21]、大孔樹脂吸附法[22]、水浸提法；還有超聲輔助提取法[23]、超臨界流體萃取[24]、高靜水壓萃取[25]、脈沖電場等非熱加工技術(shù)。

本試驗(yàn)以醬香型白酒丟糟為研究對象，比較乙醇溶液浸提和超聲輔助浸提兩種方法對醬香型白酒丟糟中類黑精提取效率的影響，并采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化丟糟中類黑精提取工藝。丟糟深加工利用的新方法，一方面減少了酒糟對環(huán)境的污染，另一方面提高了丟糟的綜合利用價值，有助于酒企解決其發(fā)展中的瓶頸性問題，研究丟糟類黑精的提取和純化工藝，對類黑精的生理活性和保健功能具有重要意義，可產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)和社會效應(yīng)，為優(yōu)化產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，加快經(jīng)濟(jì)發(fā)展，加快綠色發(fā)展具有積極的推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型白酒丟糟：貴州仁懷某酒廠提供。

類黑精對照品（純度＞99%）：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；甘氨酸（分析純）：上海市阿拉丁工業(yè)公司；乙醇（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫酸鐵（分析純）：天津市化工三廠有限公司；過氧化氫（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；水楊酸（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)：寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III循環(huán)水式真空泵、FW-500A高速萬能粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；FA2204N電子天平：上海菁海儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海力辰邦西儀器科技有限公司；UV5100紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；TDL-80-2B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DS-040S型數(shù)控超聲波清洗器：浙江東森電器有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器：常州潤華電器有限公司；DGG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHC-L6006低溫恒溫槽：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

（1）丟糟干粉的制備

將新鮮酒糟放入恒溫干燥箱中90 ℃干燥至質(zhì)量恒定，經(jīng)過粉碎后過80目篩，取酒糟干粉裝入密封袋中備用。

（2）丟糟類黑精待測液的制備

稱取丟糟干粉1.000 0 g于250 mL三角瓶中，加入20 mL無水乙醇，80 ℃恒溫水浴循環(huán)浸提1.5 h，然后3 500 r/min離心15 min，將上清液收集，重復(fù)兩次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸后定容于50 mL的容量瓶中，得丟糟類黑精待測液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

類黑精標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：參照郝日禮等[23-24]的研究方法制備類黑精對照品，精密稱取1.000 0 g類黑精對照品，定容至100 mL容量瓶，作為類黑精標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg/mL）。類黑精具有良好的溶解性[25]，可將甘氨酸和葡萄糖混合制作類黑精，通過加水溶解再凍干，烘烤形成的類黑精經(jīng)過溶解進(jìn)行過濾再凍干制得標(biāo)準(zhǔn)品。

類黑精含量的測定：采用紫外分光光度法。分別取體積為5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL梯度的類黑精標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg/mL），分別加入蒸餾水定容至50 mL，測定波長420 nm處的吸光度值，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。以類黑精標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制類黑精標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.165 2x+0.004 4（相關(guān)系數(shù)R2為0.998 9）。計算樣品中類黑精含量。并對該檢測方法進(jìn)行方法學(xué)研究。

類黑精提取率計算公式如下：

式中：P為類黑精的提取率，%；C為類黑精質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣液的體積，mL；M為1.000 0 g丟糟完全提取類黑精含量，mg。

1.3.3 類黑精的羥基自由基（·OH）清除能力測定

采用水楊酸法。分別設(shè)置對照組（按順序加入1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和2 mL的H2O）、反應(yīng)組（各加入1 mL的待測液和水，加入1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液）和未反應(yīng)組，分別加入1 mL 8.8 mmol/L的H2O2于比色管中，在37 ℃水浴鍋中水浴10 min，測定其波長510 nm條件下的吸光度值。·OH清除率計算公式如下：

式中：A為對照組吸光度值；A1為反應(yīng)組吸光度值；A2為未反應(yīng)組吸光度值。

1.3.4 類黑精提取工藝優(yōu)化

分別采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化類黑精乙醇溶劑提取和超聲輔助-溶劑提取工藝。

乙醇溶劑提取法：稱取丟糟干粉末1.000 0 g，于250 mL容量瓶中封口，以不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、不同提取時間（1.5 h、2.5 h、3.5 h、4.5 h、5.5 h、6.5 h）、不同提取溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）的條件下進(jìn)行提取。分別考察料液比、提取時間及提取溫度對類黑精提取率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將提取時間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）作為影響因素，以類黑精提取率為評價指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 乙醇溶劑法提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization of ethanol solvent extraction methods

超聲輔助-溶劑浸提法：以不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、30%、40%、50%、60%、70%）、超聲時間（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min）、超聲溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）、料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g∶mL））等因素作為變量進(jìn)行試驗(yàn)，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲溫度及料液比對類黑精提取率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將乙醇體積分?jǐn)?shù)（a）、料液比（b）、超聲溫度（c）、超聲時間（d）作為影響因素，以類黑精提取率為評價指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 超聲輔助-溶劑浸提法提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization of ultrasonic assisted-solvent extraction methods

2 結(jié)果與分析

2.1 類黑精含量測定方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為2.0mg/mL的類黑精標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度試驗(yàn)，在波長420 nm條件下連續(xù)測定吸光度值6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the precision tests

由表3可知，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD為1.0%＜5%，表明該檢測方法精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL類黑精標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，在波長420 nm條件下，分別在0、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h測定吸光度值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察該方法穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

由表4可知，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果的RSD為1.55%＜5%，表明該檢測方法在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the stability tests

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取10.0 mL丟糟提取液，在波長420 nm條件下，測定吸光度值，測定6次并取平均值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察該方法重復(fù)性，結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of the reproducibility tests

由表5可知，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果的RSD為2.0%＜5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為2 mg/mL丟糟類黑精樣品100 mL，加標(biāo)質(zhì)量濃度0.2 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL，加標(biāo)體積1 mL，加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知，樣品加標(biāo)回收率在98%～101%之間，加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果RSD為1.53%＜5%，表明該方法準(zhǔn)確度高。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of the recovery rate tests

2.2 溶劑浸提提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 料液比的確定

提取溫度為35 ℃，提取時間4 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，在料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL）的條件下進(jìn)行浸提，3 500 r/min離心15 min，取上清液，測其吸光度值，計算類黑精提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 不同料液比對類黑精提取率的影響Fig.1 Effect of different solid-liquid ratio on extraction rate of melanoidin

由圖1可知，在料液比為1∶10～1∶20（g∶mL）時，類黑精提取率隨之增加；在料液比為1∶20（g∶mL）時，丟糟類黑精提取率為42.5%；在料液比為1∶20～1:35（g∶mL）時，類黑精提取率變化不大。因此，最適料液比為1:20（g∶mL）。

2.2.2 提取時間的確定

在提取溫度為35 ℃，提取時間分別為1.5 h、2.5 h、3.5 h、4.5 h、5.5 h、6.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，在料液比為1∶20（g∶mL）的條件下進(jìn)行浸提，3 500 r/min離心15 min，取上清液，測其吸光度值，計算類黑精提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取時間對類黑精提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction time on extraction rate of melanoidin

由圖2可知，在提取時間為1.5～3.5 h 時，類黑精提取率隨之增加；提取時間為3.5 h時，類黑精提取率最大為47.5%；提取時間＞3.5 h之后，類黑精提取率趨于平緩?？赡苁怯捎陬惡诰崛〕鰜砗箅S著時間延長，類黑精分子又滲入丟糟溶液中。因此，最適提取時間為3.5 h。

2.2.3 提取溫度的確定

在提取溫度分別為20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，提取時間為3.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，在料液比為1∶20（g∶mL）的條件下進(jìn)行浸提，3 500 r/min離心15 min，取上清液，測其吸光度值，計算類黑精提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同提取溫度對類黑精提取率的影響Fig.3 Effect of different extraction temperature on extraction rate of melanoidin

由圖3可知，提取溫度為20～50 ℃時，丟糟中類黑精提取率隨著溫度上升而增高；提取溫度為50 ℃時，類黑精提取率最大為48%；提取溫度高于50 ℃之后，類黑精提取率有所下降。因此，最適提取溫度為50 ℃。

2.2.4 正交試驗(yàn)

由表7可知，RC＞RA＞RB，說明料液比是影響類黑精提取的最大因素，其次是提取時間，提取溫度的影響是最小的。最佳的提取工藝組合A3B3C3，即提取時間為4.0 h，提取溫度為55 ℃，料液比為1∶25（g∶mL）。在此最佳提取工藝條件下，類黑精的提取率為51.25%。

表7 乙醇溶劑提取法提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization of ethanol solvent extraction methods

2.3 超聲輔助-溶劑提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

在料液比為1∶50（g∶mL），超聲溫度為60 ℃，浸提時間為30 min，超聲波功率200 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%條件下進(jìn)行浸提，3500r/min離心15min，取上清液，測其吸光度值，計算類黑精提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對類黑精提取率的影響Fig.4 Effect of different ethanol volume fraction on extraction rate of melanoidin

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)在20%～50%范圍內(nèi)增加，類黑精提取率隨之增大；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，類黑精提取率最大，為25.15%；乙醇體積分?jǐn)?shù)＞50%之后，類黑精提取率減小。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.3.2 超聲時間的確定

在料液比為1∶50（g∶mL），超聲溫度為60 ℃，超聲時間分別為15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，超聲波功率200 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%條件下進(jìn)行浸提，3 500 r/min離心15 min，取上清液，測其吸光度值，計算類黑精提取率，結(jié)果見圖5。

圖5 不同超聲時間對類黑精提取率的影響Fig.5 Effect of different ultrasound time on extraction rate of melanoidin

由圖5可知，超聲時間在15～30 min范圍內(nèi)逐漸遞增，類黑精提取率隨時間的增加而上升；超聲時間＞30 min之后，提取率逐漸趨于穩(wěn)定。因此，最佳超聲時間為30 min。

2.3.3 不同料液比對提取率的影響

由圖6可知，開始時提取率隨料液比在1∶25～1∶35（g∶mL）時，類黑精提取率逐漸上升；在料液比為1∶35（g∶mL）時，類黑精提取率為45.21%；料液比為1∶35～1∶50（g∶mL）時，類黑精提取率逐漸趨于穩(wěn)定。為了考慮成本，最佳料液比為1∶35（g∶mL）。

圖6 不同料液比對類黑精提取率的影響Fig.6 Effect of different solid-liquid ratio on extraction rate

2.3.4 超聲溫度的確定

在料液比為1∶35（g∶mL），超聲溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，超聲時間為30 min，超聲波功率200 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%條件下進(jìn)行浸提，3 500 r/min離心15 min，取上清液，測其吸光度值，計算類黑精提取率，結(jié)果見圖7。

圖7 不同超聲溫度對類黑精提取率的影響Fig.7 Effect of different ultrasonic temperature on extraction rate of melanoidin

由圖7可知，超聲溫度為40～70 ℃時，類黑精提取率隨之不斷上升；在超聲溫度為70 ℃時，類黑精提取率達(dá)到最大，為55.23%；超聲溫度高于70 ℃之后，丟糟類黑精提取率有所降低。因此，最佳超聲溫度為70 ℃。

2.3.5 超聲功率的確定

在料液比為1∶35（g∶mL），超聲溫度為70 ℃，超聲時間為30 min，超聲波功率分別為240 W、280 W、320 W、360 W、400 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%條件下進(jìn)行浸提，3 500 r/min離心15 min，取上清液，測其吸光度值，計算類黑精提取率，結(jié)果見圖8。

圖8 不同超聲功率對類黑精提取率的影響Fig.8 Effect of different ultrasonic power on extraction rate of melanoidin

由圖8可知，丟糟類黑精提取率隨超聲功率升高而增加，在超聲功率為320 W后，類黑精提取率增加緩慢，考慮成本，選擇最佳超聲功率為320 W。

2.3.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將乙醇體積分?jǐn)?shù)（a）、料液比（b）、超聲溫度（c）、超聲時間（d）作為影響因素，以類黑精提取率為評價指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表8。

表8 超聲輔助-溶劑浸提法提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization of ultrasonic assisted-solvent extraction methods

由表8可知，Rb＞Ra＞Rc=Rd，說明料液比是影響類黑精提取的最大因素，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)，超聲溫度，超聲時間的影響是最小的。最佳的提取工藝組合a2b3c3d1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶37（g∶mL），超聲溫度75 ℃，超聲時間25 min。在此最佳提取工藝條件下，類黑精的提取率為72.37%。

3 結(jié)論

本研究通過超聲輔助浸提和乙醇溶液浸提兩種方法，提取醬香型白酒丟糟中的類黑精成分，通過紫外分光光度法測定所提取的類黑精的含量。結(jié)果表明，超聲輔助溶液浸提法優(yōu)于乙醇溶液浸提法，超聲輔助溶液浸提類黑精的最佳提取工藝為超聲時間25 min，超聲溫度75 ℃，料液比1∶37（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，超聲功率320 W。此優(yōu)化條件下，醬香型白酒丟糟類黑精提取率為72.37%。