81個(gè)矮牽牛自交系遺傳多樣性的分析

張西西，李 芳,許 超，徐 菁，華 瑩，張春和

(北京市園林綠化科學(xué)研究院/綠化植物育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102)

矮牽牛[Petuniahybrida(J. D. Hooker) Vilmorin]別名碧冬茄、矮喇叭，番薯花，毽子花等，茄科碧冬茄屬多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲阿根廷，現(xiàn)在世界各地廣泛栽培。在溫度適宜的情況下，矮牽牛一年四季均可開(kāi)花，是節(jié)日花壇用花的常用材料[1-2]。對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行深入研究，是培育矮牽牛新品種的前提與基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的植物形態(tài)標(biāo)記等研究手段較少，此外，由于表型容易受到環(huán)境影響，性狀表達(dá)容易不穩(wěn)定[3]。目前在全世界范圍內(nèi)普遍采用分子標(biāo)記技術(shù)研究植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系，相關(guān)的研究報(bào)道不少。迄今利用分子標(biāo)記技術(shù)研究植物矮牽牛遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究報(bào)道很多，但以矮牽牛為對(duì)象的相關(guān)研究報(bào)道還比較少。葉為[4]利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)標(biāo)記(inter simple sequence repeat，ISSR)對(duì)18個(gè)矮牽牛自交系進(jìn)行了親緣關(guān)系的研究；吳志祥等[5]利用ISSR對(duì)142個(gè)矮牽牛品種進(jìn)行遺傳多樣性分析；徐進(jìn)等[6]利用SRAP對(duì)58個(gè)矮牽牛品種進(jìn)行了遺傳關(guān)系分析。利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(amplified fragment length polymorphism，AFLP)分析矮牽牛自交系的遺傳關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

AFLP分子標(biāo)記技術(shù)是常用的一種分子標(biāo)記方法，具有多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)[7-8]，是一種理想、有效的遺傳標(biāo)記方法，廣泛用于植物親緣關(guān)系等相關(guān)研究[9-12]，同時(shí)，也在經(jīng)濟(jì)作物中被廣泛應(yīng)用[13-15]同時(shí)應(yīng)用在蔬菜遺傳關(guān)系的研究中[16-17]。在園林觀賞植物研究中，AFLP廣泛用于海棠等木本觀賞植物[18-22]。由于AFLP技術(shù)相對(duì)SRAP等分子標(biāo)記來(lái)講，試驗(yàn)步驟較為復(fù)雜，近年來(lái)，采用SRAP等分子標(biāo)記研究觀賞花卉的遺傳多態(tài)性較為常見(jiàn)[23-25]，而用AFLP研究花卉的報(bào)道數(shù)量較少[26-28]，利用AFLP研究矮牽牛自交系遺傳多態(tài)性還未見(jiàn)報(bào)道。

該研究以北京市園林綠化科學(xué)研究院收集的81個(gè)矮牽牛自交系為材料，采用AFLP對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性的分析，旨在明確自交系之間的親緣關(guān)系，為新品種選育和品種保護(hù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2013年在北京市園林科學(xué)研究院內(nèi)進(jìn)行81個(gè)矮牽牛自交系(表1)的種植。

表1 81個(gè)矮牽牛自交系性狀表Tab.1 Name and origin of Petunia hybrid germplasm used in the experiment

1.2 試驗(yàn)方法

AFLP試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司，試驗(yàn)方法參考VOS等[3]的方法。每個(gè)樣品總DNA 200 ng，經(jīng)限制內(nèi)切酶(2 μL ECORI和2 μL MSel)消化后，在消化片段末段加入人工接頭。

共使用8對(duì)選擇性引物。其堿基組合為：H-AAG/M-CTC、H-ACA/M-CTC、H-AAG/M-CTT、H-ACT/M-CTT、H-AGC/M-CTC、H-AGC/M-CTT、H-ACC/M-CTC、H-AGG/M-CTT。

采用十六烷基三甲基溴化銨法提取矮牽牛幼葉基因組DNA，利用序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記對(duì)基因組DNA進(jìn)行多樣性和相似性分析。在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離擴(kuò)增片段。凝膠用硝酸銀染色，根據(jù)電泳結(jié)果得到“0”或“1”基質(zhì)。多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分比、有效等位基因數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)由POPGENE版本32估算。利用NTSYS pc-V.2.1估計(jì)的遺傳相似性對(duì)81個(gè)矮牽牛自交系按非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA) 進(jìn)行聚類分析，并通過(guò)Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增結(jié)果

采用3個(gè)選擇性堿基的引物組合，獲得較好的擴(kuò)增效果，電泳條帶數(shù)目豐富，分帶清晰(表2和圖1)。8對(duì)引物組合擴(kuò)增出216個(gè)遺傳位點(diǎn)，81個(gè)矮牽牛自交系共獲得24 351條擴(kuò)增帶，全部為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率100%。81個(gè)矮牽牛自交系擴(kuò)增帶分布較均勻，擴(kuò)增帶最少的是258條，最多的是478條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出3 044個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。

表2 8對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條數(shù)Tab.2 The number of polymorphic bands generated by 8 primer pairs

2.2 聚類分析

通過(guò)杰卡德相似系數(shù)，計(jì)算出遺傳相似性系數(shù)在0.2443～0.6233之間，平均值0.4338，每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)1.2236,平均多樣性指數(shù)0.2422；遺傳相似性系數(shù)最高的是4號(hào)和5號(hào)，達(dá)到0.6233，最低的是9號(hào)和92號(hào)，為0.2443。按非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類圖(圖2)。在聚類圖中，取遺傳相似性系數(shù)水平0.36時(shí)，將聚類圖中81個(gè)矮牽牛自交系分為3個(gè)類群。

2.3 利用AFLP對(duì)81個(gè)矮牽牛自交系的聚類結(jié)果

81個(gè)供試的矮牽牛材料中，全部為自交系?；ㄉ屑t、粉、白、玫紅、淺粉、藍(lán)、紫紅、紫等類型。相似系數(shù)0.36時(shí)，可將81個(gè)矮牽牛自交系分為3個(gè)類群：91和92號(hào)2個(gè)自交系，花色分別為粉和粉紅的小花型自交系，單獨(dú)聚為第Ⅰ類；58號(hào)、73號(hào)和78號(hào)，花色分別為白、淺粉和粉，為中花型自交系，聚為第II類。由于在傳統(tǒng)的雜交育種中，一般會(huì)根據(jù)花徑來(lái)進(jìn)行自交系選育，長(zhǎng)期以來(lái)，形成大花型自交系和小花型自交系?；◤较嘟淖越幌涤H緣關(guān)系較近，這與葉為[4]的研究結(jié)果是一致。

其余76個(gè)大花型自交系聚為第Ⅲ類。由于這一類群的自交系數(shù)量比較大，根據(jù)色系的不同，將其分為8個(gè)小類群。100號(hào)花色為藍(lán)，單獨(dú)聚為A類群，115號(hào)為藍(lán)，單獨(dú)聚為B類群；22號(hào)花色為白，單獨(dú)聚為C類群；60號(hào)、65號(hào)、66號(hào)、72號(hào)、80號(hào)、64號(hào)、77號(hào)、69號(hào)、81號(hào)、79號(hào)和71號(hào)共計(jì)11個(gè)自交系，均由北京市園林綠化科學(xué)研究院課題組從美國(guó)泛美種子公司的矮牽牛品種‘波浪’系列的玫紅品種實(shí)生變異單株選育而來(lái)，為大花粉和淺粉系，聚為D類群；108和120號(hào)花色是紫，聚為E類群。102號(hào)輕脈紋粉和105號(hào)淺粉聚為F類群。14號(hào)、17號(hào)、35號(hào)、18號(hào)、90號(hào)、83號(hào)、84號(hào)、49號(hào)和53號(hào)共計(jì)9個(gè)自交系，分別為粉紅、玫紅、粉、輕脈紋粉等，聚為G類群；其余的歸為H類群。

第Ⅲ類群中的H類型還可進(jìn)一步細(xì)分為3個(gè)更小的類群。第①小類為編號(hào)1號(hào)、9號(hào)、3號(hào)和6號(hào)，花色為紫和白；第②小類編號(hào)為2號(hào)、85號(hào)、47號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、12號(hào)、40號(hào)、30號(hào)、13號(hào)、20號(hào)、27號(hào)、15號(hào)、24號(hào)、36號(hào)、25號(hào)、38號(hào)、29號(hào)、34號(hào)、16號(hào)、48號(hào)、52號(hào)、50號(hào)、82號(hào)、56號(hào)、7號(hào)、111號(hào)、87號(hào)、116號(hào)、119號(hào)、96號(hào)、18號(hào)、97號(hào)、61號(hào)、62號(hào)、44號(hào)、57號(hào)、26號(hào)、95號(hào)、8號(hào)、10號(hào)、51號(hào)、86和94號(hào)，共計(jì)43個(gè)自交系；第③小類為編號(hào)112號(hào)和117號(hào)自交系，花冠紫色聚為一類。在第②小類中，主要集中白、淺粉、玫紅、紅、紫紅、鮭紅幾個(gè)色系。這與徐進(jìn)等[6]用SRAP進(jìn)行矮牽牛F1代遺傳關(guān)系的聚類結(jié)果基本一致，但略有不同。

3 討 論

該研究通過(guò)篩選的8對(duì)AFLP引物組合對(duì)81個(gè)矮牽牛自交系進(jìn)行多樣性分析，共擴(kuò)增出24 351條譜帶，全部為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率為100%。AFLP靈敏度高，能對(duì)親緣關(guān)系較近的種質(zhì)資源材料的親緣關(guān)系進(jìn)行遺傳關(guān)系分析。AFLP聚類分析與形態(tài)學(xué)聚類總體結(jié)果一致。除11個(gè)變異株培育成的自交系外，81個(gè)矮牽牛自交系可分為3個(gè)大的類群。這一結(jié)果與花型為基礎(chǔ)的聚類分析一致[4]。

81個(gè)矮牽牛自交系中，大花型的自交系占絕大多數(shù)。由于這個(gè)類群的自交系數(shù)量多，根據(jù)不同花色，將其分成藍(lán)色、白色、粉色、紫色、淺粉色-輕脈紋以及粉紅-玫紅等不同亞類群。分子聚類結(jié)果為北京市園林綠化科學(xué)研究院的自育品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)提供重要依據(jù)。Ⅲ類群的D亞類群是北京市園林綠化科學(xué)研究院課題組根據(jù)自然突變單株選育的粉色系自交系，與其他自交系的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，可作為新品種選育的重點(diǎn)材料。

Ⅲ類群還有一部分自交系組成比較復(fù)雜，將其歸為H亞類群，并進(jìn)一步細(xì)分為3個(gè)更小的類群。第①小類為白色系+紫色系，由4個(gè)自交系組成；第②小類白色系+玫紅等暖色系，由43個(gè)自交系組成；第③小類是2個(gè)紫色自交系。粉紅色系和紫色、藍(lán)色系自交系聚為不同的類群，同時(shí)白色系與冷暖色調(diào)的自交系分別聚在一起。在徐進(jìn)等[6]的報(bào)道中，白色品種只和紫色等冷色調(diào)品種聚在一起。該試驗(yàn)結(jié)果是白色與粉色、紅色系聚在一起，同時(shí)另一些白色自交系與紫色系聚在一起。而在傳統(tǒng)的矮牽牛雜交試驗(yàn)中，粉色單株的分離后代會(huì)出現(xiàn)一些白色自交系，某些紫色單株在高溫下會(huì)出現(xiàn)白色的花朵。傳統(tǒng)雜交試驗(yàn)表明一些白色自交系與紫色自交系和粉色自交系的遺傳關(guān)系都很近。該研究得出的分子聚類結(jié)果與雜交試驗(yàn)結(jié)果相吻合。分析原因可能是由于徐進(jìn)等[6]試驗(yàn)材料采用的是F1代品種，白色品種可能分別由遺傳背景較遠(yuǎn)的2個(gè)白色自交系雜交而成，與其他顏色的雜交一代遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。而該研究所用材料全部來(lái)源于自交系，在自交過(guò)程中，白色自交系由其他顏色自交系分離而來(lái)，因而遺傳關(guān)系較近。

在UPGMA聚類圖上，81個(gè)矮牽牛自交系可根據(jù)花徑和花色進(jìn)行分類。這與吳志祥等[5]研究結(jié)果略有不同。分析可能是由于該研究采用的81個(gè)矮牽牛自交系最早由表型性狀優(yōu)良的單株自交多代而來(lái)，花型相同、顏色相近的自交系親緣關(guān)系較近。而吳志祥等[5]采用的是來(lái)源于世界各地的雜交一代品種，由不同遺傳背景的自交系雜交而來(lái)的可能性較大。由于遺傳背景復(fù)雜，無(wú)法單一根據(jù)花型和花色進(jìn)行完全聚類。對(duì)于矮牽牛育種來(lái)講，世界各地的育種公司之間的遺傳材料的交流比較頻繁，同一系類不同顏色材料之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。同一品種的親本可能來(lái)自遺傳背景相差較大的自交系，這有利于矮牽牛雜交育種培育新品種。

根據(jù)UPGMA分子聚類圖，D亞類群自交系全部由自然突變而來(lái)，與其他自交系遺傳背景不同，在將來(lái)的育種工作中可作為重點(diǎn)育種材料。親緣關(guān)系越遠(yuǎn)的自交系雜交，所得到的雜交一代的雜種優(yōu)勢(shì)有可能越強(qiáng)。在相應(yīng)花徑、花色范圍內(nèi)，盡量選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的自交系雜交，其后代的雜種優(yōu)勢(shì)出現(xiàn)的可能性越大。