右旋糖酐發(fā)酵液酶解制備右旋糖酐40中氮的控制

問清江， 慕 娟， 孫曉宇， 鄭巧霞， 丁 浩

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

右旋糖酐發(fā)酵液是腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)以蔗糖為主要原料，在其自身的右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase, EC 2.4.5.1)的作用下，將蔗糖轉(zhuǎn)化為高分子右旋糖酐和果糖的發(fā)酵產(chǎn)物[1-2]。右旋糖酐在醫(yī)藥領(lǐng)域的主要用途為代血漿，可以提高血漿膠體滲透壓，吸收血管外的水分以補(bǔ)充血容量，從而維護(hù)血壓擴(kuò)充血容量的強(qiáng)度。右旋糖酐40是臨床醫(yī)學(xué)最常用的右旋糖酐品種之一，具有改善人體血液微循環(huán)的作用[3-5]。雜氮是右旋糖酐醫(yī)用產(chǎn)品的重要指標(biāo)，培養(yǎng)基中的氮源蛋白胨經(jīng)腸膜狀明串珠菌的代謝，其產(chǎn)物既有蛋白、肽、氨基酸等有機(jī)氮，還有無機(jī)氮，這些產(chǎn)物是引起不良反應(yīng)的主要原因之一。因此對(duì)右旋糖酐40生產(chǎn)過程中氮含量的控制就是對(duì)其抗原性物質(zhì)異性蛋白含氮雜質(zhì)的控制，以達(dá)到臨床用藥更加安全有效、降低熱源反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)發(fā)生率的目的[6]。傳統(tǒng)右旋糖酐40的生產(chǎn)工藝為右旋糖酐發(fā)酵液經(jīng)乙醇沉淀提取粗酐，粗酐經(jīng)鹽酸水解，分離純化為分子量分布：重均分子量為32 000～42 000、10% 的大分子≤120 000、10%的小分子≥5 000的低分子右旋糖酐，雜氮含量 ≤0.007%[7]。乙醇沉淀提取粗酐，不僅耗費(fèi)大量乙醇，且高分子的右旋糖酐不容易溶解，只能采用在鹽酸的作用下溶解，致使水解反應(yīng)同步性差，水解產(chǎn)物分子量分布不均而影響產(chǎn)品的質(zhì)量，最終導(dǎo)致我國右旋糖酐的分子量分布標(biāo)準(zhǔn)與歐洲標(biāo)準(zhǔn)、美國標(biāo)準(zhǔn)、日本標(biāo)準(zhǔn)存在差距[8-9]。右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)能夠催化水解右旋糖酐(Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷鍵，降解其為小分子的右旋糖酐、異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。酶解反應(yīng)具有專一性和高效性，可以提高水解效率，改善水解產(chǎn)物的分子量分布，并且反應(yīng)條件溫和，既可避免鹽酸對(duì)水解設(shè)備的特殊要求，又可以降低能耗[10]。右旋糖酐40生產(chǎn)新工藝的探索從發(fā)酵液的后處理開始，首先采用吸附過濾方法去除菌體等雜質(zhì)，然后經(jīng)陶瓷膜過濾將右旋糖酐與以果糖為主的小分子糖類分離，得到右旋糖酐溶液，用于進(jìn)一步水解制備右旋糖酐40，從而替代乙醇沉淀提取粗酐工藝；右旋糖酐酶降解高分子右旋糖酐替代鹽酸水解制備右旋糖酐40。該右旋糖酐酶水解右旋糖酐發(fā)酵處理液方法以蛋白含量為目標(biāo)確定右旋糖酐發(fā)酵液吸附除雜工藝條件，氮含量過程監(jiān)測(cè)進(jìn)一步控制雜氮，最終使右旋糖酐40產(chǎn)品雜氮含量達(dá)標(biāo)，降低產(chǎn)品不良反應(yīng)潛在風(fēng)險(xiǎn)，為用藥安全提供保證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes-1226)由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 白砂糖(一級(jí)，孟連昌裕糖業(yè)有限責(zé)任公司)；右旋糖酐酶(寧夏夏圣實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；考馬斯亮藍(lán)G-250(W08D04XL，西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司)其他試劑為分析純。分光光度計(jì)(752，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；生化培養(yǎng)箱(SPX-150BIII，天津泰斯特)；隔水式培養(yǎng)箱(GH-500，北京科偉永興儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(85-2，杭州儀表電機(jī)有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(101，北京科偉永興儀器有限公司)； 高效液相色譜儀(2010A-HT，蘇州貝銳儀器科技有限公司)；陶瓷復(fù)合膜(SJM-FHM-2，合肥世杰膜工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐發(fā)酵液除雜吸附劑最適作用濃度 取500 mL發(fā)酵液的稀釋液，加入不同量的活性炭吸附劑，80 ℃攪拌保溫30 min，過濾，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)上清液中的蛋白含量，以發(fā)酵液稀釋液為對(duì)照計(jì)算蛋白去除率，以確定吸附劑的最適濃度。

式中：N為蛋白去除率，W1處理前蛋白總量，W2為處理后的蛋白含量。

1.2.2 右旋糖酐發(fā)酵液吸附除雜時(shí)間 取1 000 mL發(fā)酵液的稀釋液，加入15 g活性炭吸附劑，80 ℃條件下攪拌保溫，分別在15、30、45、60 min時(shí)取樣200 mL過濾，取上清液檢測(cè)蛋白含量，以發(fā)酵液稀釋液為對(duì)照計(jì)算蛋白去除率，以確定吸附除雜的作用時(shí)間。

1.2.3 右旋糖酐發(fā)酵液吸附除雜最適溫度 取500 mL發(fā)酵液的5倍稀釋液，加入7.5 g的活性炭吸附劑，在不同的溫度條件下攪拌保溫45 min，過濾，取上清液檢測(cè)其中的蛋白含量，以發(fā)酵液的稀釋液為對(duì)照計(jì)算蛋白去除率，確定吸附除雜的最適作用溫度。

1.2.4 右旋糖酐發(fā)酵液吸附除雜最適作用條件 首先以吸附劑用量、時(shí)間、溫度為因素進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，然后通過正交驗(yàn)證試驗(yàn)，最終確定發(fā)酵液吸附除雜的最適條件。

1.2.5 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量[11]取7支試管編號(hào)1～7，依次加入100 μg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，以0.15 mol/L NaCl補(bǔ)足1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑溶液5.0 mL，搖勻，1 h 內(nèi)以1號(hào)為空白對(duì)照，在 595 nm 處比色，以A595為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于測(cè)定樣品蛋白含量。

1.2.6 雜氮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定[7]精確量取1.4 mL 含氮量為10 μg/mL 的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液置于消解管中，加入濃硫酸0.5 mL，150～300 ℃ 消解；消解結(jié)束放置到室溫加入10 mL 蒸餾水，5% 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至堿性，轉(zhuǎn)入50 mL的比色管，蒸餾水定容至50 mL，加入2.0 mL堿性碘化汞鉀試液，搖勻，分光光度計(jì)進(jìn)行不同波長的掃描，確定390 nm為測(cè)定波長。配制氮含量為4、9、14、19、24、29、34 μg的硫酸銨溶液，按照上述確定390 nm為測(cè)定波長的方法，以A390為縱坐標(biāo)，氮含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于測(cè)定雜氮含量。

1.2.7 分子量與分子量分布[7]取右旋糖酐40樣品適量，加流動(dòng)相(0.71%硫酸鈉溶液，內(nèi)含0.02%疊氮化鈉)溶解并稀釋制成每 1 mL 約含 10 mg 右旋糖酐40溶液，振搖，室溫放置過夜作為供試品溶液。另取 4～5個(gè) 已知分子量的右旋糖酐對(duì)照品，依法檢查(2015版《藥典》二部附錄VH)，樣品 10% 大分子部分重均分子量不得大于 120 000，10% 小分子部分重均分子量不得小于 5 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 右旋糖酐發(fā)酵液除雜吸附劑的最適作用濃度

將右旋糖酐發(fā)酵液進(jìn)行5倍體積分?jǐn)?shù)稀釋，分別以不同濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)加入吸附劑(活性炭)，在80 ℃條件下攪拌保溫30 min,過濾收集濾液，檢測(cè)其蛋白含量，以出發(fā)發(fā)酵稀釋液為對(duì)照計(jì)算蛋白去除率，結(jié)果如圖1所示。吸附劑濃度為1.0%～1.5%時(shí)，蛋白去除率明顯增加，隨后不再增加。因此，吸附劑的最適濃度為1.5%。

圖1 吸附劑濃度對(duì)蛋白去除的影響Fig.1 Effect of adsorbent concentration on protein removal

2.2 右旋糖酐發(fā)酵液吸附除雜的作用時(shí)間

右旋糖酐發(fā)酵液稀釋液加入1.5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))活性炭，80 ℃條件下攪拌保溫，不同時(shí)間取樣過濾, 檢測(cè)濾液中蛋白含量計(jì)算蛋白去除率，結(jié)果(圖2)表明，15～45 min蛋白去除率處于上升階段，45 min和60 min的蛋白去除率相當(dāng)，因此最適吸附除雜時(shí)間為45 min。

圖2 吸附時(shí)間對(duì)蛋白去除的影響Fig.2 Effect of adsorbent time on protein removal

2.3 右旋糖酐發(fā)酵液吸附除雜的作用溫度

取500 mL右旋糖酐發(fā)酵液稀釋液，加入7.5 g的活性炭，以不同的溫度攪拌保溫45 min，過濾，取樣檢測(cè)上清液中的蛋白含量，以發(fā)酵液稀釋液為對(duì)照計(jì)算蛋白去除率，結(jié)果見圖3，在吸附劑濃度和時(shí)間相同的條件下，85 ℃時(shí)蛋白去除效果最佳。

圖3 吸附溫度對(duì)蛋白去除的影響Fig.3 Effect of adsorbent temperature on protein removal

2.4 右旋糖酐發(fā)酵液吸附除雜的最適作用條件

在右旋糖酐發(fā)酵液吸附除雜條件(吸附劑濃度、時(shí)間和溫度)單一選擇的基礎(chǔ)上,按照表1進(jìn)行吸附劑濃度、時(shí)間和溫度的三因素三水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。從結(jié)果級(jí)差分析可知，C>B>A ，其中影響最大的是吸附時(shí)間，最佳結(jié)果為A1B1C3，由于該結(jié)果不在表中之列，所以進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。將表2中試驗(yàn)號(hào)1(A1B1C1)、7(A3B1C3)和(A1B1C3)進(jìn)行比較，結(jié)果(表3)表明：A1B1C3蛋白去除率最高，為發(fā)酵液吸附除雜的最適作用條件，蛋白去除率44.43%，剩余蛋白在之后的分離純化工藝過程中進(jìn)一步被去除。

2.5 右旋糖酐發(fā)酵液吸附去除雜氮

將右旋糖酐發(fā)酵液進(jìn)行一定的稀釋，按照2.4中最適吸附除雜作用條件進(jìn)行吸附處理，板框過濾，濾液取樣200 mL真空冷凍干燥，干品用于檢測(cè)(發(fā)酵液取樣100 mL真空冷凍干燥，干品用于檢測(cè)對(duì)照)，其余濾液進(jìn)一步陶瓷膜過濾。發(fā)酵液吸附去除雜氮結(jié)果(表4)表明，雜氮的去除率為56.00%～71.60%，吸附除雜后的干品雜氮含量從起始的0.175%～0.257%降至0.072%～0.082%，具有顯著的雜氮去除效果；雖然因發(fā)酵水平不同而導(dǎo)致的發(fā)酵液雜氮含量不同，但是經(jīng)過吸附處理后，使得雜氮含量可以降低到0.09% 以下。雜氮的去除率(56.00%～71.60%)明顯高于蛋白去除率(44.43%)，原因在于雜氮的去除中不僅局限于蛋白的去除，還包括其他含氮類物質(zhì)；考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白的去除率作為條件實(shí)驗(yàn)，方法簡便易行，但是會(huì)受到檢測(cè)樣品中的澄清度等因素影響，檢測(cè)數(shù)據(jù)偏差也導(dǎo)致氮去除率與蛋白去除率的差距。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果和級(jí)差分析

表3 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

表4 吸附去除雜氮結(jié)果

2.6 陶瓷膜過濾去除雜氮

右旋糖酐發(fā)酵液經(jīng)過吸附除雜后的濾液繼續(xù)進(jìn)行陶瓷膜過濾，將以果糖為主要代表的小分子糖類與右旋糖酐分離，雜氮等其他小分子雜質(zhì)同時(shí)也被去除，還可以將右旋糖酐稀釋液濃縮用于酶解制備右旋糖酐40。在陶瓷膜過濾過程中，需要根據(jù)具體料液補(bǔ)加一定量的純水，以提高濾過除雜效率。收集截留液為右旋糖酐溶液，取樣150 mL真空冷凍干燥，干品用于檢測(cè)。陶瓷膜過濾結(jié)果(表5)表明，陶瓷膜過濾雜氮的去除率可達(dá)45% 以上，干品雜氮含量低于0.040%；右旋糖酐發(fā)酵液經(jīng)過吸附除雜和陶瓷膜過濾處理后，右旋糖酐溶液的含氮量與傳統(tǒng)工藝中乙醇沉淀提取粗酐的雜氮含量(表6)相當(dāng)，達(dá)到了雜氮去除的控制目標(biāo)，完全可以替代乙醇沉淀提取粗酐工藝。

表5 陶瓷膜去除雜氮結(jié)果

表6 乙醇沉淀提取粗酐的雜氮含量

2.7 酶解制備右旋糖酐40雜氮的去除

右旋糖酐發(fā)酵液首先經(jīng)過以蛋白等大分子為主的吸附除雜工藝處理，然后使用陶瓷膜過濾，去除以果糖為主要代表的小分子雜糖及其他小分子雜質(zhì)，得到的右旋糖酐發(fā)酵液處理液進(jìn)一步在右旋糖酐酶的作用下水解為一定分子量分布的低分子右旋糖酐溶液，經(jīng)過乙醇分級(jí)沉淀制備右旋糖酐40。在乙醇分級(jí)沉淀的工藝過程中雜氮進(jìn)一步被去除(表7)，雜氮的去除率達(dá)89% 以上，右旋糖酐40的雜氮含量為0.001%～0.003%，達(dá)到《中國藥典》≤0.007%的標(biāo)準(zhǔn)。

右旋糖酐發(fā)酵液酶解制備右旋糖酐40，在保證其分子量分布達(dá)標(biāo)的前提下，對(duì)其雜氮的去除摸索新的工藝路線。右旋糖酐發(fā)酵液中雜氮的主要組成部分為腸膜狀明串珠菌菌體、右旋糖酐蔗糖酶等蛋白類及小分子代謝產(chǎn)物等，因此發(fā)酵液雜氮的去除首先從吸附除雜入手，然后再去除小分子雜氮物質(zhì)。吸附除雜、陶瓷膜過濾、乙醇分離提取是右旋糖酐發(fā)酵液酶解制備右旋糖酐40的關(guān)鍵雜氮去除工藝，結(jié)果見表8。吸附去雜氮的去除率57%以上，雜氮含量降至0.090%以下；陶瓷膜過濾去雜氮的去除率45%以上，雜氮含量降至0.040% 以下；乙醇分離沉淀去雜氮的去除率89% 以上，雜氮含量降至0.003% 以下，達(dá)到≤0.007% 的國家標(biāo)準(zhǔn)。整個(gè)右旋糖酐發(fā)酵液酶解制備右旋糖酐40工藝過程雜氮的去除率達(dá)到98% 以上。

表7 酶解制備右旋糖酐40去除雜氮結(jié)果

表8 右旋糖酐發(fā)酵液酶解制備右旋糖酐40雜氮控制結(jié)果

3 討 論

傳統(tǒng)右旋糖酐40生產(chǎn)工藝過程存在以下缺陷：①乙醇沉淀只能提取大于一定分子量的右旋糖酐，分子量低的部分遺留在殘液中，從而導(dǎo)致右旋糖酐40產(chǎn)率低下，還要耗費(fèi)乙醇；②粗酐因右旋糖酐分子量巨大而難以溶解，只能采用鹽酸降解助溶，使得右旋糖酐的降解難以同步而導(dǎo)致降解產(chǎn)物分子量分布不均，產(chǎn)品分子量分布的標(biāo)準(zhǔn)與歐洲及美國等存在差距；③鹽酸水解無專一性，溫度高能耗大，水解設(shè)備材質(zhì)有特殊要求，鹽酸中的氯既影響產(chǎn)品品質(zhì)，又不利于企業(yè)環(huán)保。首先通過檢測(cè)右旋糖酐發(fā)酵液蛋白含量，得到最佳吸附條件，然后通過陶瓷膜過濾將右旋糖酐和果糖分離進(jìn)一步去除雜氮。以上兩個(gè)工藝過程完全可以替代乙醇沉淀提取粗酐，獲得的右旋糖酐發(fā)酵液處理液直接用于右旋糖酐酶降解，省去了乙醇的使用和高分子右旋糖酐溶解過程；酶解溫度為50 ℃，且右旋糖酐酶具有高效性和專一性，既降低了能耗，又改善了水解液中右旋糖酐分子量的分布，提高了產(chǎn)品品質(zhì)，降低了企業(yè)環(huán)保負(fù)荷。右旋糖酐酶解液經(jīng)過乙醇分級(jí)沉淀制備右旋糖酐40，雜氮的去除率達(dá)到89%以上，雜氮含量降至0.003%以下，達(dá)到≤0.007%的國家標(biāo)準(zhǔn)。右旋糖酐發(fā)酵液酶解制備右旋糖酐40工藝過程雜氮的控制可以使雜氮去除率達(dá)到98%以上，產(chǎn)品雜氮含量達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，分子量分布有所改善，重均分子量35 000以上，10%小分子>7 000。