超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證涼茶中167種非法添加藥物

何嘉雯, 溫家欣, 劉亞雄, 胡佳哲, 曹雅靜, 賴宇紅

(廣東省藥品檢驗(yàn)所, 廣東 廣州 510663)

涼茶是兩廣地區(qū)流行的傳統(tǒng)飲料,一般認(rèn)為具有清熱解毒、祛濕消滯的功效。有不法商家受利益驅(qū)使,在涼茶中非法添加感冒藥、糖皮質(zhì)激素等以增強(qiáng)宣稱的功效,這種行為具有潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn),并嚴(yán)重影響市場秩序。若誤服含有解熱鎮(zhèn)痛藥的涼茶,可能掩蓋發(fā)熱、咽痛等癥狀,延誤疾病治療。另一方面,隨著監(jiān)管力度加大,涼茶非法添加藥物的種類不斷增加,不限于已知的以對(duì)乙酰氨基酚為代表的解熱鎮(zhèn)痛藥,涉及抗組胺藥、抗生素、平喘藥、鎮(zhèn)咳藥等,具有多樣性、復(fù)雜性和未知性。

目前,涼茶非法添加藥物的檢測方法有薄層色譜法[1]、酶聯(lián)免疫法[2]、高效液相色譜法[1,3,4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-9]等。薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法靈敏度較低,檢測成分較少。液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法是非法添加檢測的經(jīng)典方法,被BJS 201713等現(xiàn)行補(bǔ)充檢驗(yàn)方法采用。此類方法一般利用多反應(yīng)離子監(jiān)測模式進(jìn)行靶向檢測,在新成分或未知成分識(shí)別上有一定的局限性。孫樹周等[5]發(fā)現(xiàn)的茶堿、噴托維林和胡佳哲等[6]發(fā)現(xiàn)的甲硝唑、紅霉素是補(bǔ)充檢驗(yàn)方法外成分,超出標(biāo)準(zhǔn)范圍,在標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)中不能被有效識(shí)別。此外,若同時(shí)檢測上述多種藥物,需采用多個(gè)方法,檢驗(yàn)效率低。因此,三重四極桿質(zhì)譜的靶向檢測模式已不能滿足新形勢下涼茶非法添加藥物的檢驗(yàn)需求,亟須建立一個(gè)覆蓋藥物盡量多的跨類別多成分高通量篩查方法。

靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(Orbitrap HRMS)是近年研究熱點(diǎn),具有高分辨率、高質(zhì)量精度優(yōu)勢,采集的質(zhì)譜信息豐富,可實(shí)現(xiàn)上百種藥物同時(shí)檢測和非靶向未知物篩查,在農(nóng)獸藥殘留、環(huán)境污染物、化妝品致敏物質(zhì)高通量篩查中已有較成熟的研究[10-18],但對(duì)涼茶非法添加藥物篩查的研究較少。劉桂聯(lián)等[9]利用Orbitrap HRMS快速篩查和確證涼茶中56種降脂、降壓類藥物,給出了示范性研究。然而非法添加藥物遠(yuǎn)多于56種,現(xiàn)有研究仍未覆蓋涼茶高風(fēng)險(xiǎn)添加藥物,未發(fā)揮高分辨質(zhì)譜的明顯優(yōu)勢。

參考其他領(lǐng)域的研究經(jīng)驗(yàn),結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫可以極大限度發(fā)揮高分辨質(zhì)譜在高通量分析中的優(yōu)勢。本文通過調(diào)研,針對(duì)性地選定解熱鎮(zhèn)痛、抗組胺、抗菌、消炎、減肥等167種非法添加高風(fēng)險(xiǎn)藥物,建立高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。優(yōu)化樣品前處理、色譜-質(zhì)譜條件,建立超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證涼茶中167種藥物的方法,實(shí)現(xiàn)了非法添加藥物的高通量、高精度篩查,突破當(dāng)前檢測局限,為打擊涼茶非法添加提供新的技術(shù)支撐。

1 儀器與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀VANQUIVE Optiplex、四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜Q Exactive Orbitrap和TraceFinder 4.1軟件(美國Thermo Scientific公司);分析天平MS205DU(瑞士Mettler公司);超純水發(fā)生器Mili-Q Advantage A10(美國Millipore公司);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈、甲醇(色譜純)購自美國Honeywell公司,甲酸、甲酸銨、乙酸銨、冰醋酸(色譜純)購自上海麥克林生化科技有限公司。167種藥物標(biāo)準(zhǔn)品包括解熱鎮(zhèn)痛藥22種(詳見表1中序號(hào)1～22)、抗菌藥物47種(23～69)、激素41種(70～110)、抗組胺藥物15種(111～125)、鎮(zhèn)咳平喘藥14種(126～139)、消化系統(tǒng)用藥13種(140～152)、減肥藥7種(153～159)和其他類8種(160～167),分別購自中國食品藥品檢定研究院、德國Dr. Ehrenstorfer公司和上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

245批涼茶樣品購自廣東省內(nèi)涼茶店,均為液體涼茶。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,不溶的標(biāo)準(zhǔn)品用冰醋酸或乙腈溶解后再用甲醇定容,配制成單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃冰箱保存。

取適量各單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用50%(v/v)甲醇水溶液配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的數(shù)據(jù)庫采集用標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

分別取適量對(duì)乙酰氨基酚、土霉素、環(huán)丙沙星、磺胺間甲氧嘧啶、氯霉素、蘭索拉唑、紅霉素、地塞米松單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50%(v/v)甲醇水溶液配制成質(zhì)量濃度為10 ng/mL和50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品溶液制備

取樣前搖勻樣品,稱取1 g,置于20 mL容量瓶中,加入適量50%(v/v)甲醇水溶液,超聲提取15 min。取出放冷,用50%(v/v)甲醇水溶液定容至20 mL, 0.22 μm濾膜過濾,待測。

1.4 分析條件

色譜柱:Waters XBridge BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm),柱溫40 ℃,流動(dòng)相A 0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動(dòng)相B 0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液,流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～17.0 min, 5%B～95%B; 17.0～20.0 min, 95%B; 20.0～20.5 min, 95%B～5%B; 20.5～25.0 min, 5%B。進(jìn)樣量5 μL。

噴霧電壓3.50 kV(正離子)和-3.20 kV(負(fù)離子),毛細(xì)管溫度320 ℃;管狀透鏡電壓50.0 V,輔助氣加熱溫度350 ℃,鞘氣流速4.55 L/min,輔助氣流速3 L/min。掃描類型為全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)質(zhì)譜掃描(Full MS/dd-MS2),正、負(fù)離子同時(shí)轉(zhuǎn)換,關(guān)閉目標(biāo)離子列表(inclusion)。Full MS參數(shù):分辨率70 000,自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)(AGC target)1.0×106,最大離子注入時(shí)間(IT)100 ms,掃描范圍m/z100～1 000。dd-MS2參數(shù):分辨率17 500, AGC target為2.0×105, IT為80 ms,循環(huán)次數(shù)(Loop count)5,歸一化碰撞能量(NEC)20%、40%和60%,開啟動(dòng)態(tài)排除10 s。

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

注入數(shù)據(jù)庫采集用標(biāo)準(zhǔn)溶液,按儀器分析條件采集每個(gè)藥物的質(zhì)譜圖,使用儀器工作站提取保留時(shí)間、母離子和碎片離子精確質(zhì)量數(shù)等數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入TraceFinder軟件,編輯藥物化學(xué)信息,建立167種藥物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,主要信息見表1。

1.6 篩查確證方法

注入樣品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控溶液,按儀器分析條件采集數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入TraceFinder軟件,與數(shù)據(jù)庫中藥物的保留時(shí)間、母離子和碎片離子精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行自動(dòng)篩查匹配。當(dāng)滿足母離子精確質(zhì)量數(shù)偏差小于5×10-6(5 ppm),保留時(shí)間偏差小于20 s,至少一個(gè)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)偏差小于5×10-6,可判斷為檢出。檢出成分的二級(jí)質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫收錄的標(biāo)準(zhǔn)品譜圖比對(duì)一致,可確證為同一物質(zhì)。若檢出地塞米松或倍他米松,需更換BJS 201713色譜條件進(jìn)行區(qū)分。混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控溶液為隨行的質(zhì)量監(jiān)控,當(dāng)檢出限濃度的8種成分全部檢出時(shí),儀器靈敏度和質(zhì)量軸穩(wěn)定,篩查結(jié)果可信度高。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)庫成分的選擇

涼茶跨類別添加藥物的問題非常突出,根據(jù)宣稱的功效,可加入解熱鎮(zhèn)痛藥、抗菌藥物(抗生素)、糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥物等,消化系統(tǒng)藥物和減肥藥也可能非法添加到?jīng)霾柚?。綜合考慮,本文針對(duì)性選擇了167種藥物建立高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,基本覆蓋了常見陽性成分和非法添加高風(fēng)險(xiǎn)藥物。偽麻黃堿和咖啡因是感冒復(fù)方制劑中常用的藥物,也是植物中自然存在的生物堿,其檢出難以判斷是否非法添加,因此不納入數(shù)據(jù)庫中。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

考察了水、50%(v/v)甲醇水溶液、70%(v/v)甲醇水溶液和甲醇作為提取溶劑對(duì)167種藥物的提取效果。結(jié)果表明,大部分脂溶性藥物不適宜采用水提取,其他3種提取溶液提取效果相當(dāng),但甲醇的體積分?jǐn)?shù)影響個(gè)別藥物的響應(yīng)和穩(wěn)定性。保留時(shí)間較小的嗎啡、對(duì)乙酰氨基酚在純甲醇中溶劑效應(yīng)明顯,峰形、響應(yīng)較差。拉唑類成分不穩(wěn)定,以蘭索拉唑?yàn)槔?24 h內(nèi)在50%(v/v)甲醇水溶液、70%(v/v)甲醇水溶液和甲醇中分別降解15%、18%和23%,在50%(v/v)甲醇水溶液中穩(wěn)定性較好。因此,50%(v/v)甲醇水溶液作為提取溶劑可以兼顧盡量多成分的響應(yīng)和穩(wěn)定性。

比較了不同體積提取溶劑對(duì)涼茶中目標(biāo)成分的影響。1 g樣品中分別加入50%(v/v)甲醇水溶液5、10、20和50 mL進(jìn)行提取,對(duì)乙酰氨基酚保留時(shí)間較小,受基質(zhì)干擾明顯,其色譜表現(xiàn)能有效反映樣品的干擾情況,故以對(duì)乙酰氨基酚為代表進(jìn)行考察。結(jié)果顯示,提取體積為5 mL和10 mL時(shí),樣品溶液顏色較深,離子流圖基線噪聲較大,干擾對(duì)乙酰氨基酚色譜峰;20 mL時(shí),樣品溶液顏色淺,離子流圖基線相對(duì)平穩(wěn),對(duì)乙酰氨基酚色譜峰無明顯干擾;50 mL時(shí),樣品溶液幾乎無色,離子流圖基線平穩(wěn),色譜峰無干擾。為獲得更高的靈敏度,實(shí)驗(yàn)選擇提取溶劑體積為20 mL。

考察了超聲15 min、超聲30 min或振搖15 min的提取效果,3種提取方式無差異。

綜上,采用50%(v/v)甲醇水溶液20 mL超聲15 min作為提取方法。

2.3 色譜條件優(yōu)化

考察了藥物在Waters XBridge BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)、Thermo Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)和Phenomenex Kinetex C18(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)3款色譜柱上的色譜行為。四環(huán)素類藥物對(duì)色譜條件敏感,以土霉素為例進(jìn)行說明。土霉素在Thermo Hypersil GOLD上柱拖尾明顯(見圖1a),在Phenomenex Kinetex C18柱和Waters XBridge BEH C18柱上峰形良好(見圖1b和1c),后者峰寬更窄,峰形更尖銳。因此,選擇整體表現(xiàn)更佳的Waters XBridge BEH C18柱作為方法推薦的色譜柱。

圖 1 土霉素在不同色譜條件下的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of oxytetracycline under different chromatographic conditions a. column: Thermo Hypersil GOLD (100 mm×2.1 mm, 1.9 μm); mobile phase: 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid; b. column: Phenomenex Kinetex C18 (100 mm×2.1 mm, 2.6 μm); mobile phase: 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid; c. column: Waters XBridge BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 2.5 μm); mobile phase: 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid; d. column: Waters XBridge BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 2.5 μm); mobile phase: 0.01 mol/L ammonium acetate solution and acetonitrile; e. column: Waters XBridge BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 2.5 μm); mobile phase: 0.01 mol/L ammonium formate solution and acetonitrile.

比較了0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸乙腈、0.01 mol/L乙酸銨-乙腈和0.01 mol/L甲酸銨-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)藥物的分離情況,繼續(xù)以土霉素為例進(jìn)行說明。結(jié)果表明,當(dāng)流動(dòng)相含甲酸時(shí),土霉素峰形好、響應(yīng)強(qiáng)(見圖1b);但流動(dòng)相含乙酸銨、甲酸銨時(shí),土霉素色譜峰拖尾,響應(yīng)減弱,靈敏度變差(見圖1d和1e)。因此,選擇0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸乙腈作為流動(dòng)相體系。

2.4 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

本方法篩查的藥物多達(dá)167個(gè),優(yōu)化時(shí)需保證每個(gè)藥物被有效采集。Orbitrap質(zhì)譜參數(shù)中分辨率和最大駐留時(shí)間的設(shè)置相對(duì)固定,其他可調(diào)參數(shù)有TopN、動(dòng)態(tài)排除功能。TopN代表一級(jí)質(zhì)譜響應(yīng)前N強(qiáng)的離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜采集,由循環(huán)次數(shù)和每次二級(jí)質(zhì)譜采集的離子數(shù)(MSX count)決定,計(jì)算公式為N=Loop count×MSK count。當(dāng)MSK count默認(rèn)為1, Loop count設(shè)置為5時(shí),能獲得數(shù)量較多、質(zhì)量較好的二級(jí)圖譜。動(dòng)態(tài)排除是指強(qiáng)度占優(yōu)勢的離子做過二級(jí)質(zhì)譜后將其排除,避免重復(fù)采集,以多獲得不同質(zhì)荷比離子的二級(jí)圖譜。以本方法為例,對(duì)乙酰氨基酚、甲硝唑、氨基比林在涼茶中常見添加量為600～2 000 mg/kg,茶堿、可待因常見添加量為20～60 mg/kg,劑量至少相差10倍。上述成分保留時(shí)間在3.3～4.4 min,開啟動(dòng)態(tài)排除前,對(duì)乙酰氨基酚等高添加量成分在響應(yīng)上占有優(yōu)勢,抑制了茶堿、可待因的采集。開啟后情況得到顯著改善,解決了劑量差異的干擾問題。

此外,張蓉等[10]認(rèn)為開啟目標(biāo)離子列表(inclusion)可以強(qiáng)制采集目標(biāo)質(zhì)量數(shù),增強(qiáng)檢測靈敏度。但考察發(fā)現(xiàn),當(dāng)列表化合物數(shù)量從50迅速增加到150時(shí),二級(jí)質(zhì)譜的采集點(diǎn)數(shù)銳減,部分圖譜沒有達(dá)到峰頂采集的要求,圖譜質(zhì)量不佳,影響數(shù)據(jù)庫篩查的準(zhǔn)確性。因此,方法關(guān)閉inclusion列表。

2.5 同分異構(gòu)體的處理

167種藥物中有8組同分異構(gòu)體,分別是酮洛芬和芬布芬、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺對(duì)甲氧嘧啶、賽庚啶和萘替芬、潑尼松龍和可的松、倍他米松和地塞米松、甲基潑尼松龍醋酸酯和地索奈德、倍他米松醋酸酯和地塞米松醋酸酯和曲安奈德、多西環(huán)素和四環(huán)素。除地塞米松和倍他米松外,其余7組的保留時(shí)間或碎片離子有區(qū)別,篩查時(shí)同分異構(gòu)體間不會(huì)相互混淆。如酮洛芬(10.54 min,特征碎片離子m/z105.033 69、209.095 67)和芬布芬(10.93 min,特征碎片離子m/z237.091 29、181.064 83)的保留時(shí)間相近,但是特征離子不同。地塞米松和倍他米松為差向異構(gòu)體,在本方法條件下保留時(shí)間均為9.11 min,擁有相同的碎片離子m/z147.080、355.190、171.080、121.065,不能有效區(qū)分。經(jīng)考察,更換BJS 201713的色譜條件能有效分離兩種激素,可作為后續(xù)的確認(rèn)手段。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1特異性

取陰性樣品溶液、加標(biāo)溶液進(jìn)樣分析,記錄離子流圖和多級(jí)質(zhì)譜圖,進(jìn)行數(shù)據(jù)庫篩查。結(jié)果顯示,陰性樣品中無目標(biāo)成分檢出,加標(biāo)樣品中均篩查出目標(biāo)成分,樣品基質(zhì)對(duì)篩查結(jié)果無干擾。

2.6.2檢出限

在陰性樣品中加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液,制得質(zhì)量濃度為10 ng/mL和50 ng/mL的加標(biāo)溶液,從低至高進(jìn)樣確定各成分的檢出限,其中10 ng/mL對(duì)應(yīng)0.2 mg/kg的檢出限水平,50 ng/mL對(duì)應(yīng)1.0 mg/kg的檢出限水平。汪洋等[13]根據(jù)歐盟EC/657/2 002中質(zhì)譜分析方法鑒定點(diǎn)數(shù)的要求,認(rèn)為高分辨質(zhì)譜定性至少需要母離子和一個(gè)子離子。

基于這一原則,本方法判斷目標(biāo)成分檢出的參數(shù)指標(biāo)為樣品溶液中有與數(shù)據(jù)庫中藥物保留時(shí)間一致的色譜峰,并且母離子精確質(zhì)量數(shù)誤差小于5×10-6,至少有一個(gè)精確質(zhì)量數(shù)誤差小于5×10-6的碎片離子。當(dāng)保留時(shí)間、母離子和碎片離子3項(xiàng)指標(biāo)在數(shù)據(jù)庫篩查均滿足要求時(shí),對(duì)應(yīng)的最低濃度為檢出限,結(jié)果見表1。本方法在0.2 mg/kg下可篩查出83種成分,1.0 mg/kg下可篩出167種成分,可滿足涼茶中多種非法添加藥物同時(shí)篩查的要求。

2.6.3線性關(guān)系

分別配制質(zhì)量濃度為10、20、30、50、80、100、200、300、500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,考察各成分的線性關(guān)系。各成分按實(shí)際情況選取5個(gè)濃度點(diǎn),以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, ng/mL),以對(duì)應(yīng)母離子提取離子流圖中的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見附表1(詳見http://www.chrom-China.com)。結(jié)果表明，各成分線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)大于0.99。

2.6.4回收率和精密度

以1倍、2倍和10倍檢出限濃度進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn),采用單點(diǎn)法以母離子提取離子流圖中的色譜峰峰面積計(jì)算回收率,每個(gè)濃度水平測定6次,計(jì)算RSD。由于定量分析時(shí)僅參考母離子提取離子流圖,缺少碎片離子的特征性,培氟沙星、諾氟沙星、地氯雷他定、阿司咪唑和克林霉素受基質(zhì)干擾存在本底值,因此不宜采用本方法對(duì)以上成分進(jìn)行定量。結(jié)果顯示,其余成分回收率為66.4%～118.1%, RSD為0.1%～16.1%(n=6),見附表1。將加標(biāo)溶液進(jìn)行數(shù)據(jù)庫篩查,全部成分均匹配檢出,準(zhǔn)確率達(dá)到100%。

圖 2 金剛烷胺陽性樣品的色譜圖和質(zhì)譜圖Fig. 2 Chromatogram and mass spectra of amantadine in positive samples a. extract ion chromatogram of precursor ion; b. full MS profile; c. MS2 profile of sample; d. MS2 profile of standard.

以質(zhì)控溶液的8種代表成分考察基質(zhì)效應(yīng)?？疾旆椒榉謩e配制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)曲線,以質(zhì)量濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,按基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)=溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率,計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)。結(jié)果表明,8種成分的基質(zhì)效應(yīng)系數(shù)為0.91～1.14,說明無明顯基質(zhì)效應(yīng)。

2.7 樣品測定

2.7.1篩查和確證結(jié)果

應(yīng)用本方法對(duì)245批涼茶進(jìn)行篩查,檢出12批陽性樣品,檢出成分有對(duì)乙酰氨基酚、雙氯芬酸鈉、氯苯那敏、溴苯那敏、地塞米松醋酸酯、地塞米松、潑尼松醋酸酯、潑尼松、甲硝唑、紅霉素、環(huán)丙沙星、金剛烷胺和右美沙芬。其中金剛烷胺、右美沙芬、溴苯那敏、環(huán)丙沙星是新發(fā)現(xiàn)的補(bǔ)充檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)外成分。

以金剛烷胺為例簡單說明本方法的篩查確證過程,陽性樣品中對(duì)應(yīng)的母離子提取離子流圖、一級(jí)質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2。數(shù)據(jù)庫中,金剛烷胺的保留時(shí)間5.46 min,理論母離子m/z152.143 38,特征碎片離子m/z135.116 94。在母離子提取離子流圖中可疑峰保留時(shí)間為5.49 min(見圖2a),與數(shù)據(jù)庫中收錄的保留時(shí)間一致,滿足保留時(shí)間要求。一級(jí)質(zhì)譜圖母離子精確質(zhì)量數(shù)實(shí)測值為m/z152.143 23,與理論值相比質(zhì)量偏差為-0.99×10-6(見圖2b),小于5×10-6,符合母離子質(zhì)量數(shù)要求。二級(jí)質(zhì)譜圖有一致的特征碎片離子(m/z135.116 9),且離子整體分布趨勢一致(見圖2c和2d),可確證為同一物質(zhì)。

圖 3 污染狀態(tài)下(a)對(duì)乙酰氨基酚的色譜圖 和(b)金剛烷胺的質(zhì)譜圖Fig. 3 (a) Chromatogram of acetaminophen and (b) mass spectrum of amantadine under contamination

2.7.2假陽性和假陰性分析

樣品初篩有14批可疑樣品,經(jīng)進(jìn)樣序列分析、重新進(jìn)樣,有2批對(duì)乙酰氨基酚假陽性,是連續(xù)進(jìn)樣高濃度陽性樣品,儀器污染導(dǎo)致。高濃度交叉污染是非法添加藥物質(zhì)譜分析中的常見問題,要求檢驗(yàn)人員警惕高含量陽性樣品后的弱陽性結(jié)果。

大批量分析時(shí),污染積累會(huì)轉(zhuǎn)化為持續(xù)的本底污染。如圖3a所示，對(duì)乙酰氨基酚(母離子m/z152.070 61)持續(xù)污染后,其母離子提取離子流圖基線整體上移至相對(duì)豐度的20%,靈敏度變低,并干擾了質(zhì)量數(shù)相近的金剛烷胺(母離子m/z152.143 38)。當(dāng)對(duì)乙酰氨基酚和金剛烷胺響應(yīng)相當(dāng)時(shí),應(yīng)產(chǎn)生m/z152.070 61通道和m/z152.143 38通道的提取質(zhì)譜圖;但當(dāng)本底存在對(duì)乙酰氨基酚污染且金剛烷胺響應(yīng)弱時(shí),四極桿區(qū)分能力有限,僅獲得m/z152.070 61通道的提取質(zhì)譜圖,導(dǎo)致金剛烷胺的二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)對(duì)乙酰氨酚特征離子(m/z110.060 07)(對(duì)比圖見圖2c和3b),破壞碎片離子整體分布,造成誤判。

為方便檢驗(yàn)人員及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題,本方法引入標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控溶液隨行進(jìn)樣的手段,對(duì)分析過程進(jìn)行質(zhì)量控制。質(zhì)控溶液設(shè)置為檢出限濃度,包含了對(duì)乙酰氨基酚等8種正、負(fù)離子化合物,兼顧了常見的高濃度污染成分和不穩(wěn)定成分,有一定的代表性。本方法建立的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫已錄入藥物信息,在無標(biāo)準(zhǔn)品情況下亦可以進(jìn)行定性篩查。此時(shí)利用質(zhì)控溶液可以監(jiān)測靈敏度、質(zhì)量軸穩(wěn)定性和儀器狀態(tài),及時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在的污染或降解,減少假陽性和假陰性,提高篩查結(jié)果的可信度。

3 結(jié)論

基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,本文建立了超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證涼茶中167種非法添加藥物的方法,可在1 h內(nèi)完成樣品前處理、檢測和數(shù)據(jù)庫篩查分析,檢測效率高。方法應(yīng)用于實(shí)際樣品,有效檢出多種陽性成分,篩查準(zhǔn)確,靶向命中率高。本方法利用Orbitrap HRMS,以Full MS/dd-MS2模式采集的數(shù)據(jù)具有挖掘性,數(shù)據(jù)庫中非法添加藥物增加后,只需要將已有樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行新一輪篩查,即可完成新增成分的分析,不需要重新處理樣品或進(jìn)行實(shí)驗(yàn),靈活應(yīng)對(duì)非法添加藥物復(fù)雜多變的特點(diǎn)。本方法快速、準(zhǔn)確,彌補(bǔ)了現(xiàn)時(shí)檢測方法的不足,為打擊涼茶非法添加藥物行為提供了新的技術(shù)支撐。