直鏈淀粉-三[(S)-1-苯乙基氨基甲酸酯]手性固定相拆分布地奈德對映體及其制劑含量的測定

黃永鵬, 唐 慧, 孟祥燕, 陳 博, 鐘 輝, 鄒志云

(國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點實驗室, 北京 102205)

布地奈德(budesonide)是一種具有高效局部抗炎作用的糖皮質(zhì)激素,因其顯著的首過效應(yīng),多以呼吸道給藥的方式用于治療哮喘和潰瘍性結(jié)腸炎[1-4]。藥物中布地奈德主要以22R和22S異構(gòu)體的形式存在(結(jié)構(gòu)式見圖1),其質(zhì)量比約為1∶1,且22R的藥物活性比22S強(qiáng)2～3倍[5]。因此,從藥物研發(fā)及質(zhì)量控制角度看,開發(fā)布地奈德對映體拆分和定量分析方法具有重要意義。

圖 1 布地奈德對映體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of budesonide enantiomers

目前,文獻(xiàn)報道的布地奈德定量分析方法主要有高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,其固定相主要是反相C18柱。如周清等[6]和Demurtas等[7]均以反相C18柱為固定相,甲醇-水為流動相,建立了布地奈德高效液相色譜定量分析方法,并對實際樣品進(jìn)行了測定,但均未對布地奈德對映體進(jìn)行拆分;Alkhateeb等[8]以反相C18柱為固定相,乙腈-20 mmol/L乙酸銨(含0.1%氫氧化銨)為流動相,建立了高效液相色譜法,實現(xiàn)了對布地奈德對映體及其相關(guān)雜質(zhì)的拆分,其色譜圖表明布地奈德對映體可實現(xiàn)基線分離;Lu等[9]和Li等[10]均以反相C18柱為固定相,分別以乙腈-5 mmol/L乙酸銨(含0.14%乙酸)和乙醇-水為流動相,建立了布地奈德對映體的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析方法,并對血漿中的布地奈德對映體進(jìn)行了測定,其總離子流色譜圖顯示布地奈德對映體可實現(xiàn)基線分離。

采用手性固定相拆分手性化合物已有較多報道[11-15],但對布地奈德對映體的拆分卻少有報道。本文基于直鏈淀粉-三[(S)-1-苯乙基氨基甲酸酯]手性固定相,建立了布地奈德對映體高效液相色譜定量分析方法,考察了流動相組成和柱溫對對映體保留時間、色譜峰高、色譜峰寬和分離度的影響,并對吸入用布地奈德混懸液實際樣品進(jìn)行測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(配有DAD檢測器)和0.45 μm微孔濾膜(美國Agilent公司); XP105天平(上海Mettler-Toledo公司)。

乙腈和甲醇(HPLC級,德國Merck KGaA公司);高氯酸、甲酸、乙酸、乙酸銨、22R-布地奈德和22R,S-布地奈德對照品(分析純,上海Macklin Biochemical公司);市售吸入用布地奈德混懸液1批次;實驗用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別準(zhǔn)確稱取適量22R-布地奈德和22R,S-布地奈德對照品,用甲醇溶解并定容,分別配制成1 000 μg/mL和2 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃避光保存,現(xiàn)用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:用甲醇將22R-布地奈德和22R,S-布地奈德標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液逐級稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,于4 ℃避光保存。

1.3 供試品溶液的配制

取吸入用布地奈德混懸液一瓶,充分搖勻后開瓶,將瓶內(nèi)混懸液移入10 mL容量瓶中,用甲醇潤洗瓶內(nèi)壁3次,并將洗液移入容量瓶中,最后用甲醇定容,配制成500 μg/mL供試品溶液,于4 ℃避光保存。檢測時,供試品溶液過0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析。

1.4 液相色譜條件

色譜柱:Chiralpak AS-RH色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5.0 μm,日本Daicel公司);柱溫:40 ℃;流動相:乙腈-水(45∶55, v/v);流速:1.0 mL/min;檢測波長:246 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1色譜柱的選擇

Chiralpak AS-RH色譜柱和Chiralpak AD-RH色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5.0 μm,日本Daicel公司)的手性固定相分別為直鏈淀粉-三[(S)-1-苯乙基氨基甲酸酯]和直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯),本文考察了這兩種色譜柱對布地奈德對映體的拆分效果,色譜圖見圖2。實驗中保持22R-布地奈德和22R,S-布地奈德標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度、流速、進(jìn)樣量和檢測波長等參數(shù)一致,流動相為乙腈-水(45∶55, v/v),柱溫為25 ℃。結(jié)果表明,采用兩種手性固定相色譜柱時，22R-布地奈德均先于22S-布地奈德出峰,與文獻(xiàn)[9,16,17]報道采用反相C18固定相的出峰順序一致;該流動相下布地奈德對映體在Chiralpak AS-RH色譜柱上的分離度、色譜峰形、色譜峰高等均優(yōu)于Chiralpak AD-RH色譜柱;采用Chiralpak AS-RH色譜柱時布地奈德對映體在10 min內(nèi)可實現(xiàn)完全分離。因此最終選擇Chiralpak AS-RH色譜柱為實驗用色譜柱。

圖 2 不同色譜柱上布地奈德對映體的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the budesonide enantiomers on the different chromatographic columns

2.1.2流動相對布地奈德拆分的影響

一般調(diào)整流動相體系的pH值,可以建立穩(wěn)定的溶質(zhì)-固定相作用環(huán)境,從而優(yōu)化目標(biāo)物保留時間和色譜峰形[18]。通過分析文獻(xiàn)[7,9,19-21]報道的反相C18固定相用于分析布地奈德的流動相組成,本文重點考察了甲醇-水(45∶55, v/v)、乙腈-5 mmol/L乙酸銨(含0.14%乙酸)(45∶55, v/v)、乙腈-0.10%甲酸水溶液(45∶55, v/v)、乙腈-水(45∶55, v/v)和乙腈-0.25%高氯酸(45∶55, v/v)對布地奈德對映體的拆分效果,色譜圖見圖3。實驗中保持22R,S-布地奈德標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度、流速、進(jìn)樣量和檢測波長等參數(shù)一致,固定相為Chiralpak AS-RH色譜柱,柱溫為25 ℃。結(jié)果表明,在乙腈-水流動相體系中添加甲酸、乙酸和乙酸銨時,布地奈德對映體的色譜峰保留時間、色譜峰高、色譜峰寬和分離度均無明顯影響,添加高氯酸時,布地奈德對映體的保留時間均變小,但色譜峰高、色譜峰寬和分離度也無明顯改善,這說明常用的流動相添加劑對布地奈德對映體的拆分無明顯的改善效果;而采用甲醇-水體系時,20 min內(nèi)無法洗脫布地奈德對映體,其原因還有待進(jìn)一步研究。因此最終選擇乙腈-水(45∶55, v/v)為實驗用流動相。

圖 3 不同流動相下布地奈德對映體的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the budesonide enantiomers using different mobile phases

2.1.3柱溫對布地奈德拆分的影響

本文以Chiralpak AS-RH色譜柱為固定相,乙腈-水(45∶55, v/v)為流動相,保持22R,S-布地奈德標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度、流速、進(jìn)樣量和檢測波長等參數(shù)一致的條件下,考察了柱溫(25～40 ℃)對布地奈德對映體拆分的影響,色譜圖見圖4。結(jié)果顯示,隨著柱溫的升高,布地奈德對映體的保留時間和色譜峰寬呈下降趨勢,色譜峰高和分離度呈上升趨勢,升高柱溫可以明顯改善布地奈德對映體的拆分效果;當(dāng)柱溫為40 ℃時,22R-布地奈德和22S-布地奈德的保留時間分別6.40 min和7.77 min,分離度為4.64。因此最終選擇40 ℃為實驗用柱溫。

圖 4 不同柱溫下布地奈德對映體的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of the budesonide enantiomers at different column temperatures

化合物對映體間的分離度隨柱溫升高增大或減小均有相關(guān)文獻(xiàn)[22-29]報道。液相色譜手性拆分中,對映體之間分離因子α可用如下公式[24,30]表示:

表 1 布地奈德對映體的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R2), LODs and LOQs of the budesonide enantiomers

其中,R為氣體常數(shù)(8.314 J/(mol·K));T為柱溫(K); ΔΔH0和ΔΔS0分別為對映體在固定相和流動相間分配的焓變之差(J/mol)和熵變之差(J/(mol·K))?？梢钥闯?對映體的分離主要由焓變和熵變共同控制,若柱溫升高分離度變好,一般為熵變控制,反之則為焓變控制[24]。因此,對映體的分離,不僅與對映體分子結(jié)構(gòu)有關(guān),也與固定相和流動相種類有關(guān)。

2.2 方法的線性范圍、檢出限和定量限

采用1.4節(jié)的液相色譜條件對22R-布地奈德標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定,以分析物的峰面積(Y)和對應(yīng)的質(zhì)量濃度(X, μg/mL)進(jìn)行線性回歸,得到22R-布地奈德標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)(R2),以色譜峰S/N≥3和10時目標(biāo)物的水平為方法的檢出限和定量限。然后,以22R-布地奈德為對照品,測定22R,S-布地奈德對照品中22R-布地奈德的含量為51%,即22R,S-布地奈德對照品中22S-布地奈德的含量為49%;最后,再采用1.4節(jié)的液相色譜條件對22R,S-布地奈德標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定,得到22S-布地奈德的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,22R-布地奈德和22S-布地奈德在對應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均為0.999 9,檢出限分別為0.05 μg/mL和0.07 μg/mL,定量限分別為0.16 μg/mL和0.20 μg/mL。

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

為了驗證該方法的準(zhǔn)確度和精密度,綜合考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和供試品溶液中布地奈德對映體的含量,實驗向供試品溶液中添加4個水平的22R,S-布地奈德對照品溶液,每個加標(biāo)樣品測量6次,計算加標(biāo)回收率和精密度,具體結(jié)果見表2。結(jié)果表明,平均回收率為102.63%～104.17%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.08%～0.57%。該方法準(zhǔn)確可靠,能夠滿足實際分析的要求。

表 2 布地奈德對映體的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the budesonide enantiomers (n=6)

2.4 穩(wěn)定性

采用1.4節(jié)液相色譜條件,分別對于4 ℃避光保存0、4、8、12和24 h的布地奈德溶液進(jìn)樣測定,22R-布地奈德和22S-布地奈德峰面積的RSD分別為0.27%和0.31%,表明布地奈德溶液在本實驗條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 實際樣品的測定

采用本方法對1批次共4個吸入用布地奈德混懸液樣品進(jìn)行測試,每個樣品均采用1.3節(jié)的方法進(jìn)行配制,樣品色譜圖見圖5。結(jié)果表明,布地奈德混懸液的輔料對其對映體的測定不產(chǎn)生明顯干擾,供試品中22R-布地奈德、22S-布地奈德及其總含量分別為283.15～284.63 μg/mL、259.86～261.51 μg/mL和543.01～546.14 μg/mL, RSD為0.26%(n=3)。

圖 5 實際樣品的色譜圖Fig. 5 Chromatogram of the real sample

3 結(jié)論

本文以直鏈淀粉-三[(S)-1-苯乙基氨基甲酸酯]為手性固定相,實現(xiàn)了布地奈德對映體的快速拆分,建立了一種測定布地奈德對映體含量的高效液相色譜方法,并應(yīng)用于吸入用布地奈德混懸液實際樣品的檢測。該方法具有流動相簡單、拆分效果好、分析時間短、線性范圍寬等優(yōu)點,為布地奈德對映體的快速拆分和其制劑的質(zhì)量監(jiān)測提供了簡單、實用的方法。