基于鏡像酶正交酶切的蛋白質(zhì)復(fù)合物規(guī)?；珳?zhǔn)分析新方法

韓若楠, 趙麗麗, 安雨馨, 梁 振, 趙 群*, 張麗華, 張玉奎1,

(1. 大連理工大學(xué), 張大煜學(xué)院, 遼寧 大連 116024; 2. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的執(zhí)行者,通過自身結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)改變,以及與其他蛋白質(zhì)相互作用組裝為蛋白質(zhì)復(fù)合物,調(diào)控各種生物學(xué)過程。因此,如何實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的精準(zhǔn)解析已成為當(dāng)前生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。化學(xué)交聯(lián)結(jié)合質(zhì)譜(CXMS)技術(shù)作為蛋白質(zhì)復(fù)合物解析的新興技術(shù),利用化學(xué)交聯(lián)劑將空間距離足夠接近的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的氨基酸殘基以共價(jià)鍵連接起來,再利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)交聯(lián)肽段進(jìn)行鑒定,實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成、界面和相互作用位點(diǎn)的解析。該技術(shù)具有分析通量高、靈敏度高、可提供蛋白質(zhì)間相互作用的界面信息、普遍適用于不同種類和復(fù)雜程度的生物樣品等優(yōu)勢(shì),已成為X射線晶體衍射[1,2]、低溫冷凍電鏡[3,4]、免疫共沉淀[5,6]等蛋白質(zhì)復(fù)合物研究技術(shù)的重要補(bǔ)充。

化學(xué)交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定覆蓋度和準(zhǔn)確度決定著該技術(shù)對(duì)于蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析能力。目前,為了實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的高覆蓋度交聯(lián),研究人員發(fā)展了可用于共價(jià)交聯(lián)賴氨酸(K)的氨基、谷氨酸(E)/天冬氨酸(N)的羧基[7]、精氨酸(R)的胍基[8]以及半胱氨酸(C)的巰基[9]等多種活性基團(tuán)的新型交聯(lián)劑。進(jìn)而,為了提高低豐度交聯(lián)肽段的鑒定靈敏度,體積排阻色譜法[10]、強(qiáng)陽離子交換色譜法[11],及親和基團(tuán)富集策略被提出用于交聯(lián)肽段的高選擇性富集,如可富集型化學(xué)可斷裂交聯(lián)劑——Leiker[12],與不具備富集功能的交聯(lián)劑相比,通過親和富集可以將交聯(lián)位點(diǎn)鑒定數(shù)目提高4倍以上。此外,為了提高質(zhì)譜對(duì)交聯(lián)肽段的鑒定能力,解決由于交聯(lián)肽段長(zhǎng)度過長(zhǎng)以及多級(jí)交聯(lián)導(dǎo)致的鑒定困難的問題,Leitner等[10]通過對(duì)8種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及20S蛋白酶體的交聯(lián)實(shí)驗(yàn),初步證明多酶酶切方法能夠有效提高交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定數(shù)目;Zhao等[13]提出了基于“smart cutter”多種酶聯(lián)用的原位順序酶解策略,將大腸桿菌中蛋白質(zhì)復(fù)合物交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定數(shù)目相對(duì)單一胰蛋白酶(trypsin)酶切提高了54%。在交聯(lián)數(shù)據(jù)分析方面,為提高交聯(lián)位點(diǎn)的解析精度和效率,一系列的CXMS數(shù)據(jù)解析軟件被開發(fā),包括xQuest[14]、MassMatrix[15]和pLink[16,17]等。其中pLink在充分利用全部碎片離子的基礎(chǔ)上提出了粗細(xì)兩步打分策略用來縮減候選肽段規(guī)模,使鑒定速度得到了提高[18]。

上述技術(shù)雖然在很大程度上推動(dòng)了基于CXMS的蛋白質(zhì)復(fù)合物的解析覆蓋度,但是交聯(lián)肽段在質(zhì)譜中存在多處碎裂,碎片離子形式多樣,且存在交聯(lián)基團(tuán)與肽段共價(jià)連接的特異離子,因此交聯(lián)肽段二級(jí)譜圖的碎片離子比常規(guī)肽段的譜圖在種類和數(shù)目上更為復(fù)雜[16],會(huì)造成交聯(lián)肽段鑒定譜圖中碎片離子的匹配數(shù)目較少和肽段序列匹配連續(xù)性較差,導(dǎo)致譜圖可信度較低,影響蛋白質(zhì)復(fù)合物交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定精準(zhǔn)度。

胰蛋白酶鏡像酶(LysargiNase)的酶切位點(diǎn)與胰蛋白酶互為鏡像,可特異地切割賴氨酸和精氨酸的N端。由于LysargiNase的N端酶切特點(diǎn),電荷主要分布在交聯(lián)肽段的N端,在碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)和高能誘導(dǎo)裂解(HCD)模式下產(chǎn)生以b離子為主的碎片離子,與胰蛋白酶酶切肽段以y離子為主的碎片離子互為鏡像補(bǔ)充,為胰蛋白酶酶解肽段在質(zhì)譜鑒定中b離子缺失嚴(yán)重的問題提供了很好的解決辦法[19]。由于具有較高的酶切特異性和酶活性,鏡像酶已經(jīng)成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)C末端蛋白質(zhì)組鑒定[20]、磷酸化蛋白質(zhì)組研究[21]、甲基化蛋白質(zhì)組鑒定等[22]方面,然而在CXMS中的應(yīng)用仍未見報(bào)道。

為進(jìn)一步提高對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)及相互作用位點(diǎn)的解析能力,本文發(fā)展了LysargiNase與胰蛋白酶聯(lián)合酶切的方法,基于鏡像酶正交切割的互補(bǔ)特性,通過產(chǎn)生賴氨酸及精氨酸鏡像分布的交聯(lián)肽段,以增加特征碎片離子數(shù)量和肽段匹配連續(xù)性,從而提升交聯(lián)肽段的譜圖鑒定質(zhì)量,達(dá)到提高交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定覆蓋度和準(zhǔn)確度的目的。通過分別對(duì)牛血清白蛋白及大腸桿菌全蛋白樣品的交聯(lián)位點(diǎn)鑒定結(jié)果的考察,評(píng)價(jià)該策略對(duì)單一蛋白樣品和復(fù)雜細(xì)胞裂解液樣品蛋白質(zhì)復(fù)合物表征的應(yīng)用潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

蛋白酶抑制劑(cocktail)、二硫蘇糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、牛血清白蛋白(BSA)均購于美國Sigma-Aldrich公司;二(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸酯(BS3)購于美國Thermo Fisher公司;胰蛋白酶、胰蛋白酶鏡像酶購于中國華利世公司;BCA試劑盒購自中國碧云天公司;色譜純乙腈(ACN)購自德國Merck公司;所有實(shí)驗(yàn)用水均經(jīng)過美國Millipore公司購買的Milli-Q系統(tǒng)純化;其他試劑均為分析純。用于質(zhì)譜分析的分離柱(15 cm, 150 μm i.d., 365 μm o.d.)中裝有購于德國Dr. Maisch公司的ReproSil-Pur C18-AQ顆粒(顆粒大小為1.9 μm;孔徑為12 nm)。熔融石英毛細(xì)管(150 μm i.d., 365 μm o.d.)購于中國Sino Sumtech公司;Venusil XBP C18硅膠填料(5 μm, 12 nm)購于中國博納艾杰爾公司;Empore disk C18固相萃取膜片購于美國3M公司;超聲破碎儀購自美國Cole-Parmer公司;真空濃縮儀、超微量分光光度計(jì)(Nanodrop one)、Easy-nano LC 1000系統(tǒng)、Q-Exactive質(zhì)譜儀、Easy-nano LC 1200系統(tǒng)及Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀均購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1蛋白質(zhì)樣品制備

稱取牛血清白蛋白粉末,以20 mmol/L 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES, pH 7.5)作為緩沖體系,配制0.1 mmol/L牛血清白蛋白溶液。

大腸桿菌細(xì)胞(種屬K12)在37 ℃下采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,然后于4 ℃以4 000 g離心2 min,收集細(xì)胞沉淀。細(xì)胞沉淀采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍后,懸浮于細(xì)胞裂解液(含20 mmol/L HEPES和1%(v/v)蛋白酶抑制劑)中,冰浴超聲破碎180 s(30%能量,10 s開,10 s關(guān))。勻漿液于4 ℃以20 000 g離心40 min,收集上清,采用BCA試劑盒測(cè)定所得蛋白質(zhì)含量。稀釋大腸桿菌蛋白裂解液至蛋白質(zhì)含量為0.5 mg/mL。

1.2.2化學(xué)交聯(lián)樣品制備

以20 mmol/L HEPES(pH 7.5)為溶劑配制濃度為20 mmol/L 的BS3交聯(lián)劑母液;將交聯(lián)劑母液加入牛血清白蛋白的緩沖溶液及大腸桿菌蛋白裂解液中,使交聯(lián)劑的終濃度為1 mmol/L,在室溫條件下反應(yīng)15 min;通過添加終濃度為50 mmol/L的淬滅溶液NH4HCO3進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)淬滅,并在室溫下孵育15 min;在冰浴條件下,將交聯(lián)樣品逐漸滴入8倍體積的預(yù)冷丙酮中,于-20 ℃靜置過夜;在4 ℃條件下,以16 000 g轉(zhuǎn)速離心,去除丙酮,然后將交聯(lián)蛋白用預(yù)冷丙酮清洗2次,去除上清液后,于室溫?fù)]發(fā)掉殘余的丙酮;以8 mol/L尿素溶液復(fù)溶蛋白質(zhì)沉淀;將牛血清白蛋白交聯(lián)樣品以5 mmol/LTCEP作為還原劑，于25 ℃下反應(yīng)1 h進(jìn)行變性和還原；將大腸桿菌樣品以5 mmol/LDTT作為還原劑，于25 ℃下反應(yīng)1 h進(jìn)行變性和還原，避免大腸桿菌蛋白在酸性條件下發(fā)生變性；添加終濃度為10 mmol/L的碘乙酰胺(IAA),在黑暗中,于室溫下反應(yīng)30 min;以50 mmol/LNH4HCO3稀釋樣品至尿素濃度為0.8 mol/L后,將樣品均分為兩份,一份以蛋白樣品與蛋白酶的質(zhì)量比呈50∶1的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解過夜,另一份加入終濃度為20 mmol/L的CaCl2,以蛋白樣品與蛋白酶的質(zhì)量比呈20∶1的比例加入LysargiNase,并在37 ℃溫度下酶解過夜。

1.2.3液相色譜-質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)搜索

上述所有樣品經(jīng)過除鹽,使用0.1%甲酸(FA)溶液復(fù)溶,用超微量分光光度計(jì)測(cè)定肽段濃度,進(jìn)行反相高效色譜分離和質(zhì)譜分析。

牛血清白蛋白樣品采用Easy-nano LC 1000系統(tǒng)偶聯(lián)Q-Exactive質(zhì)譜儀平臺(tái)進(jìn)行質(zhì)譜分析。流動(dòng)相A: 2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA);流動(dòng)相B: 98%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脫程序:0～10 min, 2%B～7%B; 10～60 min, 7%B～23%B; 60～80 min, 23%B～40%B; 80～82 min, 40%B～80%B; 82～95 min, 80%B。Q-Exactive質(zhì)譜儀采用數(shù)據(jù)依賴性模式,Full MS掃描在Orbitrap上實(shí)現(xiàn),掃描范圍為m/z300～1 800,分辨率為70 000(m/z=200),自動(dòng)增益控制(AGC)為3×106,最大注入時(shí)間(IT)為60 ms,母離子分離窗口為m/z2。MS/MS掃描的分辨率為17 500(m/z=200),碎裂模式為HCD,歸一化碰撞能量(NCE)為35%, MS2從m/z110開始采集,MS2的AGC為5×104, IT為60 ms,僅選擇電荷值為3～7且強(qiáng)度高于1 000的母離子進(jìn)行碎裂,并將動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為20 s。每個(gè)樣品分析3遍。

大腸桿菌樣品采用EASY-nano LC 1200系統(tǒng)偶聯(lián)Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜儀平臺(tái)進(jìn)行質(zhì)譜分析。流動(dòng)相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;流動(dòng)相B: 80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脫程序:0～28 min, 5%B～16%B; 28～58 min, 16%B～34%B; 58～77 min, 34%B～48%B; 77～78 min, 48%B～95%B; 78～85 min, 95%B。Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜儀采用數(shù)據(jù)依賴性模式,Full MS掃描在Orbitrap上實(shí)現(xiàn),掃描范圍為m/z350～1 500,分辨率為60 000(m/z=200), AGC為4×105, IT為50 ms,母離子分離窗口為m/z1.6。MS2掃描的分辨率為15 000(m/z=200),碎裂模式為HCD, NCE為30%, MS2從m/z110開始采集,MS2的AGC為5×104, IT為60 ms。僅選擇電荷值為3～7且強(qiáng)度高于2×104的母離子進(jìn)行碎裂,并將動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為20 s。每個(gè)樣品分析3遍。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件(*.raw)采用pLink 2軟件(2.3.9)對(duì)交聯(lián)信息進(jìn)行檢索和鑒定。使用從UniProt于2019年4月27日下載的牛血清白蛋白序列和大腸桿菌序列,搜索參數(shù)如下:酶切方式為胰蛋白酶(酶切位置:K/R的C端)、LysargiNase(酶切位置:K/R的N端);漏切位點(diǎn)個(gè)數(shù)為3;一級(jí)掃描容忍(precursor tolerance)2.00×10-5;二級(jí)掃描容忍(fragment tolerance)2.00×10-5;每條肽段的質(zhì)量范圍為500～1 000 Da;肽段長(zhǎng)度的范圍為5～100個(gè)氨基酸;固定修飾為半胱氨酸還原烷基化(carbamidomethyl [C]);可變修飾為甲硫氨酸氧化(oxidation [M])、蛋白質(zhì)N端乙?；?acetyl [protein N-term]);肽段譜圖匹配錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤5%。

圖 1 胰蛋白酶與LysargiNase酶解樣品的交聯(lián)位點(diǎn)在牛血清 白蛋白晶體結(jié)構(gòu)(PDB: 3V03)的映射Fig. 1 Mapping of cross-linked sites obtained from trypsin and LysargiNase digestion on the bovine serum albumin crystal structure (PDB: 3V03)

圖 2 LysargiNase與胰蛋白酶酶解樣品的交聯(lián)位點(diǎn)對(duì)及單一交聯(lián)位點(diǎn)的互補(bǔ)性Fig. 2 Complementarity of LysargiNase and trypsin digested cross-linked site pairs and single cross-linked sites a. venn diagram of single cross-linked sites; b. venn diagram of the cross-linked site pairs; c. number of cross-linked site pairs of each single cross-linked site, digested with LysargiNase and trypsin.

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)鏡像酶正交酶切產(chǎn)物的交聯(lián)質(zhì)譜分析

2.1.1基于鏡像酶切的牛血清白蛋白交聯(lián)位點(diǎn)鑒定覆蓋度

以BS3作為交聯(lián)劑對(duì)牛血清白蛋白單一模型蛋白體系進(jìn)行化學(xué)交聯(lián),并將交聯(lián)樣品分別采用胰蛋白酶及胰蛋白酶鏡像酶進(jìn)行酶解,經(jīng)過質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)分析,共得到了291對(duì)非冗余的交聯(lián)位點(diǎn)信息(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com)。將所鑒定的交聯(lián)位點(diǎn)信息與牛血清白蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(PDB: 3V03)進(jìn)行映射,如圖1所示,兩種酶切方式鑒定到的交聯(lián)位點(diǎn)存在一定互補(bǔ)性,初步表明基于鏡像酶正交酶切的交聯(lián)質(zhì)譜分析策略能提高牛血清白蛋白交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定數(shù)目。

如圖2a所示,胰蛋白酶酶解鑒定到的交聯(lián)位點(diǎn)的38%(82/216)被LysargiNase共同鑒定;此外,有75對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)被LysargiNase補(bǔ)充鑒定,占胰蛋白酶鑒定總數(shù)35%(75/216)。表明LysargiNase與胰蛋白酶酶解產(chǎn)生的交聯(lián)肽段具有優(yōu)異的互補(bǔ)性。

對(duì)兩種酶切方式鑒定到的交聯(lián)位點(diǎn)的互補(bǔ)性進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)交聯(lián)位點(diǎn)對(duì)中的單一交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定情況,發(fā)現(xiàn)LysargiNase與胰蛋白酶對(duì)單一交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定能力并沒有明顯差別,83%(49/59)的位點(diǎn)被二者共同鑒定到(見圖2b)。然而,單一交聯(lián)位點(diǎn)在不同酶切方式所產(chǎn)生的交聯(lián)位點(diǎn)對(duì)的鑒定能力不同(見圖2c)。上述結(jié)果提示,兩種酶切方式產(chǎn)生的交聯(lián)位點(diǎn)對(duì)的互補(bǔ)性很可能源于質(zhì)譜鑒定過程中對(duì)于二維交聯(lián)肽段與線性常規(guī)肽段的不同信號(hào)響應(yīng)。由于交聯(lián)肽段較長(zhǎng),其碎片離子響應(yīng)相對(duì)較差,LysargiNase較胰蛋白酶酶切雖然產(chǎn)生肽段的長(zhǎng)度相當(dāng),但是由于二者酶切原理不同,K/R分別處在交聯(lián)肽段的N端和C端,使得產(chǎn)生的交聯(lián)肽段的質(zhì)譜碎裂能力與響應(yīng)不同,因此LysargiNase與胰蛋白酶聯(lián)合正交酶切的方法,較胰蛋白酶酶解方法,能顯著提高交聯(lián)肽段的鑒定覆蓋度。

圖 3 LysargiNase與胰蛋白酶酶解樣品共同得到的 交聯(lián)位點(diǎn)鑒定打分比較Fig. 3 Comparison of cross-linking site identification scores obtained by both LysargiNase and trypsin digestions

圖 4 b+/++與y+/++離子碎片分別在α/β-肽段的碎片覆蓋度Fig. 4 Fragment coverages of b+/++ and y+/++ ions of α/β-peptides

2.1.2基于鏡像酶切的牛血清白蛋白交聯(lián)位點(diǎn)鑒定準(zhǔn)確度

實(shí)驗(yàn)對(duì)胰蛋白酶與LysargiNase兩種酶切方式共同鑒定到的交聯(lián)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)肽段的譜圖質(zhì)量進(jìn)行了考察,以-lg(E-value)值作為打分標(biāo)準(zhǔn),分值越高對(duì)應(yīng)的譜圖鑒定的準(zhǔn)確度越高,反之準(zhǔn)確度越低,根據(jù)共同鑒定的位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的-lg[E-value(LysargiNase)/E-value(trypsin)]考察鏡像酶正交酶切對(duì)質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確度的影響。如圖3所示,在二者共同鑒定的交聯(lián)位點(diǎn)對(duì)中,32%(25/78)的交聯(lián)位點(diǎn)對(duì)在LysargiNase的酶切結(jié)果中獲得了比胰蛋白酶酶切結(jié)果更高的譜圖質(zhì)量得分,初步顯示了鏡像酶正交酶切在提高交聯(lián)位點(diǎn)質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確度上的能力。

交聯(lián)肽段是由交聯(lián)劑共價(jià)連接的兩條肽段(α/β)組成的,與普通肽段相比,其長(zhǎng)度更長(zhǎng),理化性質(zhì)更加復(fù)雜,若無法產(chǎn)生足夠的碎片離子(b/y),則無法實(shí)現(xiàn)對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)的準(zhǔn)確鑒定。通過腳本處理搜庫結(jié)果文件,輸出碎片離子鑒定信息,并統(tǒng)計(jì)了α-肽段與β-肽段上b+/++及y+/++碎片離子的鑒定數(shù)目,如圖4所示,由LysargiNase酶切產(chǎn)生的交聯(lián)肽段主要以b+/++離子碎片為主,α-肽段的b+/++離子碎片數(shù)目的平均值高于β-肽段的y+/++離子,而y+/++離子在α-肽段與β-肽段的碎片數(shù)目基本相當(dāng);胰蛋白酶酶解的交聯(lián)肽段以y+/++離子為主,α-和β-肽段中y+/++和b+/++離子碎片數(shù)目相當(dāng)。該結(jié)果從碎片離子的鑒定數(shù)目上初步顯示了兩種酶切方式產(chǎn)生的交聯(lián)肽段在質(zhì)譜檢測(cè)響應(yīng)行為上的互補(bǔ)性。

為了進(jìn)一步考察兩種酶切方式鑒定到交聯(lián)肽段的譜圖質(zhì)量,即交聯(lián)肽段與譜圖匹配的準(zhǔn)確度,我們以胰蛋白酶酶解鑒定的交聯(lián)肽段的-lg(E-value)分值作為標(biāo)準(zhǔn)劃分了低、中、高3個(gè)打分區(qū)間,分別為[0, 4)、[4, 8)、[8, ∞)。如圖5所示,對(duì)于低打分區(qū)間(見圖5a), 與胰蛋白酶相比，LysargiNase酶解所得到的交聯(lián)肽段的譜圖質(zhì)量得到了顯著提高,不僅b/y離子的匹配數(shù)目增加,其連續(xù)性也得到了提高;對(duì)于中、高打分區(qū)間內(nèi)(見圖5b和5c), LysargiNase的譜圖質(zhì)量提升效果同樣被證明。因此,LysargiNase較胰蛋白酶酶解,通過提高b+/++離子檢測(cè)效率,能夠有效增加不同長(zhǎng)度交聯(lián)肽段在質(zhì)譜檢測(cè)中碎片離子的鑒定數(shù)目和連續(xù)性,提高肽段序列的譜圖匹配質(zhì)量,進(jìn)而提升交聯(lián)肽段的質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確度。

圖 5 LysargiNase與胰蛋白酶酶解的交聯(lián)肽段質(zhì)譜圖Fig. 5 Mass spectra of cross-linked peptides digested by LysargiNase and trypsin

圖 5 (續(xù))Fig. 5 (Continued)

2.2 復(fù)雜交聯(lián)樣品鏡像酶正交酶切產(chǎn)物的交聯(lián)質(zhì)譜分析

2.2.1基于鏡像酶切的大腸桿菌蛋白復(fù)合物交聯(lián)位點(diǎn)鑒定覆蓋度

實(shí)驗(yàn)進(jìn)而以大腸桿菌裂解液為樣品,BS3為交聯(lián)試劑考察鏡像酶正交酶切策略對(duì)于復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)復(fù)合物交聯(lián)信息的解析能力。如附圖1所示,采用鏡像酶正交酶切共鑒定到726對(duì)交聯(lián)位點(diǎn),較單一胰蛋白酶酶切交聯(lián)位點(diǎn)數(shù)目提高了16%(102/624);此外,有172對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)被LysargiNase與胰蛋白酶共同鑒定。具體的交聯(lián)位點(diǎn)信息見附表2?？傮w來看,LysargiNase酶解樣品交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定總數(shù)明顯低于胰蛋白酶酶切樣品,可能的原因包括以下3個(gè)方面:(1)由于交聯(lián)反應(yīng)主要發(fā)生于蛋白質(zhì)表面,所產(chǎn)生的交聯(lián)肽段的豐度較低,在質(zhì)譜檢測(cè)過程中存在隨機(jī)性,尤其對(duì)于復(fù)雜樣品表現(xiàn)得更為明顯[23]; (2)胰蛋白酶作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的蛋白酶,可以高效、特異地切割賴氨酸和精氨酸的C端。盡管LysargiNase被證明具有較高的酶活性和酶切特異性,其酶活較胰蛋白酶相對(duì)較低[20],產(chǎn)生LysargiNase酶切的交聯(lián)肽段由于長(zhǎng)度過長(zhǎng)而難以被質(zhì)譜檢測(cè),尤其是在復(fù)雜樣品的應(yīng)用中[20,24,25]; (3)由胰蛋白酶酶切的交聯(lián)肽段除N端外,由于酶切發(fā)生在K/R的C端,所以電荷在N端與C端都有分布,而LysargiNase的酶切位點(diǎn)在K/R的N端,電荷主要分布在N端,肽段整體的帶電性略低于胰蛋白酶酶切的肽段,導(dǎo)致LysargiNase酶切的肽段在質(zhì)譜中離子化效率及碎裂效率相對(duì)低于胰蛋白酶酶切產(chǎn)生的肽段,最終降低了LysargiNase酶切的交聯(lián)肽段在質(zhì)譜中的檢出率。因此,上述因素制約了LysargiNase酶切的交聯(lián)肽段的質(zhì)譜鑒定能力,從而導(dǎo)致其鑒定的交聯(lián)位點(diǎn)數(shù)目少于胰蛋白酶。

2.2.2基于鏡像酶切的大腸桿菌蛋白復(fù)合物交聯(lián)位點(diǎn)鑒定準(zhǔn)確度

對(duì)二者共同鑒定到的交聯(lián)位點(diǎn)的最大-lg(E-value)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)算各交聯(lián)位點(diǎn)的-lg[E-value(LysargiNase)/E-value(trypsin)],用于評(píng)價(jià)LysargiNase酶切對(duì)于胰蛋白酶酶切交聯(lián)位點(diǎn)鑒定準(zhǔn)確度的貢獻(xiàn),結(jié)果顯示35%(48/137)的交聯(lián)位點(diǎn)獲得了更高的鑒定得分值(見附圖2)。通過考察α-肽段與β-肽段上b+/++及y+/++碎片離子的檢測(cè)覆蓋度,再次證實(shí)了該策略是基于交聯(lián)肽段碎片離子匹配及質(zhì)譜碎裂行為上的鏡像互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)了對(duì)譜圖質(zhì)量的提高(見附圖3)。對(duì)于兩種酶切產(chǎn)生的交聯(lián)肽段的譜圖進(jìn)行比較,進(jìn)一步證明了LysargiNase無論在低、中、高打分區(qū)間([0, 4)、[4, 8)、[8, ∞)),均可以通過提高交聯(lián)肽段的碎片離子鑒定數(shù)目和連續(xù)性達(dá)到譜圖質(zhì)量提升的效果(見附圖4),從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜蛋白體系中交聯(lián)肽段的高可信度質(zhì)譜鑒定。

2.3 大腸桿菌蛋白質(zhì)復(fù)合物交聯(lián)鑒定結(jié)果分析

綜合LysargiNase與胰蛋白酶兩種酶切方式所鑒定的大腸桿菌中交聯(lián)位點(diǎn)信息,我們共鑒定到29對(duì)蛋白質(zhì)分子間的相互作用,對(duì)應(yīng)119對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)(見圖6a),以及242個(gè)蛋白質(zhì)分子內(nèi)的607對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)信息。在已鑒定的29對(duì)蛋白質(zhì)相互作用中,12對(duì)已被大腸桿菌整合蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(http://www.bacteriome.org)所報(bào)道[26],此外,有10對(duì)相互作用與已報(bào)道的化學(xué)交聯(lián)蛋白互作數(shù)據(jù)相吻合[13],證實(shí)了本方法所獲得的分子間交聯(lián)信息的可靠性。另外,還有7組蛋白質(zhì)間相互作用未見報(bào)道,有望為大腸桿菌中的蛋白質(zhì)互作譜圖的全面繪制提供重要的數(shù)據(jù)參考。

圖 6 大腸桿菌樣品中LysargiNase與胰蛋白酶酶切鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物信息互補(bǔ)性Fig. 6 Complementation of protein complex information identified by LysargiNase and trypsin digestion in Escherichia coli samplesa. complementary of protein-protein interactions; b. example of complementary of intra-cross-linked protein structure information.

蛋白質(zhì)復(fù)合物在執(zhí)行其功能的過程中依賴蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)調(diào)控蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)態(tài)組裝,交聯(lián)位點(diǎn)的高準(zhǔn)確度和高覆蓋度鑒定對(duì)于揭示蛋白質(zhì)復(fù)合物功能具有重要的作用。我們對(duì)獲得的大腸桿菌體系中242個(gè)蛋白質(zhì)的607個(gè)分子內(nèi)交聯(lián)位點(diǎn)信息進(jìn)行分析。其中,由胰蛋白酶單獨(dú)鑒定到的分子內(nèi)交聯(lián)位點(diǎn)數(shù)目為364個(gè),由胰蛋白酶與LysargiNase共同鑒定到的分子內(nèi)交聯(lián)位點(diǎn)數(shù)目為149個(gè),由LysargiNase單獨(dú)鑒定到的為94個(gè)。對(duì)于共同鑒定到的蛋白質(zhì),其交聯(lián)位點(diǎn)鑒定數(shù)目較單一胰蛋白酶酶切,平均提高了34%(見附表3),表明鏡像酶正交酶切策略能顯著提高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定覆蓋度。進(jìn)一步,我們以丙酮酸激酶II(KPYK2)、谷氨酰胺結(jié)合周質(zhì)蛋白(GLNH)、核糖導(dǎo)入結(jié)合蛋白(RBSB)為例,說明該方法在蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)位點(diǎn)分析中的優(yōu)勢(shì)(見圖6b,具體交聯(lián)位點(diǎn)信息見附表4)。

丙酮酸激酶II蛋白在糖酵解的最后一步催化丙酮酸的形成,在生理?xiàng)l件下是不可逆的,對(duì)于糖酵解第二部分中代謝通量的控制至關(guān)重要。通過LysargiNase與胰蛋白酶聯(lián)用的鏡像酶正交酶切策略我們獲得了與KPYK2相關(guān)的8組交聯(lián)位點(diǎn)信息,將交聯(lián)位點(diǎn)信息映射到先前發(fā)布的KPYK2(PDB: 6K0K)結(jié)構(gòu)上,兩個(gè)交聯(lián)位點(diǎn)之間的直線距離均在BS3的最大交聯(lián)距離限制之內(nèi)(2.4 nm),滿足結(jié)構(gòu)兼容性要求,證實(shí)了交聯(lián)數(shù)據(jù)的可靠性。其中,由胰蛋白酶酶解樣品單獨(dú)提供的交聯(lián)位點(diǎn)信息有1組,有3組交聯(lián)位點(diǎn)信息只被LysargiNase酶解的樣品鑒定到,有4組交聯(lián)位點(diǎn)信息被胰蛋白酶與LysargiNase共同鑒定,證明了該策略具有提高交聯(lián)位點(diǎn)信息準(zhǔn)確度及覆蓋度的能力。

谷氨酰胺結(jié)合周質(zhì)蛋白在谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中發(fā)揮作用,對(duì)于谷氨酰胺通透酶活性是必不可少的,通過鏡像酶正交酶切策略,我們獲得了7組交聯(lián)位點(diǎn)數(shù)據(jù),其中由胰蛋白酶酶解的交聯(lián)樣品單獨(dú)提供的交聯(lián)位點(diǎn)有1組,而由LysargiNase酶解的樣品單獨(dú)提供的有3組,兩種酶解樣品共同提供的位點(diǎn)信息有3組。將交聯(lián)信息映射到先前發(fā)布的GLNH的晶體結(jié)構(gòu)上(PDB: 1GGG),有5組交聯(lián)位點(diǎn)信息能夠與該晶體結(jié)構(gòu)匹配,且各交聯(lián)位點(diǎn)之間的直線距離均小于交聯(lián)劑最大交聯(lián)距離約束,證實(shí)了交聯(lián)結(jié)果具有高可靠性,未匹配的交聯(lián)信息有可能完善GLNH的結(jié)構(gòu)分析。

核糖導(dǎo)入結(jié)合蛋白的交聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果也同樣證明了該方法對(duì)鑒定覆蓋度的提高。該蛋白質(zhì)為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物RbsABC的一部分,涉及核糖的結(jié)合與引入,同時(shí)也作為趨化性的主要化學(xué)感受器。通過鏡像酶正交酶切策略,我們總計(jì)獲得11組交聯(lián)位點(diǎn)數(shù)據(jù),其中由胰蛋白酶酶解單獨(dú)提供的交聯(lián)位點(diǎn)有5組,由胰蛋白酶與LysargiNase共同提供的有3組,由LysargiNase單獨(dú)提供的有3組;并且得到的交聯(lián)位點(diǎn)在晶體結(jié)構(gòu)(PDB: 2GX6)中的直線距離均符合交聯(lián)劑的距離約束,再次證實(shí)了該方法得到的交聯(lián)位點(diǎn)的可信性。

3 結(jié)論

本文提出了一種基于LysargiNase與胰蛋白酶鏡像酶正交酶切的化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)。對(duì)牛血清白蛋白和大腸桿菌裂解液蛋白的分析結(jié)果表明,該方法從酶切的角度出發(fā),以鏡像互補(bǔ)的方式顯著增加了肽段特征碎片離子的鑒定數(shù)目和匹配連續(xù)性,提升了交聯(lián)肽段與譜圖匹配的準(zhǔn)確度,提高了交聯(lián)位點(diǎn)鑒定準(zhǔn)確度及覆蓋度,有望為實(shí)現(xiàn)規(guī)?；牡鞍踪|(zhì)復(fù)合物精準(zhǔn)解析提供新思路。

致謝 感謝中國科學(xué)院計(jì)算技術(shù)研究所pFind團(tuán)隊(duì)毛鵬志同學(xué)在碎片離子統(tǒng)計(jì)工作中的幫助與指導(dǎo)。