響應面優(yōu)化流蘇石斛多糖提取工藝

宋智琴，韓雪，楊平飛，劉海，羅鳴，吳明開

貴州省農(nóng)業(yè)科學院作物品種資源研究所（貴陽 550006）

中藥石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，且被列為上品，具有益胃生津、滋陰清熱等功效。流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum）又名馬鞭石斛、大黃草、流蘇棒等，是蘭科石斛屬植物，為多年生附生性草本植物，1977—2020年歷版《中華人民共和國藥典》收載石斛來源植物之一，是我國常用傳統(tǒng)藥材與中成藥的原料，具有很高的藥用價值。2020版《中國藥典》收載于石斛項下，全年均可采收，具有益胃生津、滋陰清熱的功效。用于熱病津傷，干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸 勞熱，目暗不明，筋骨痿軟的治療[1]。植物多糖是人體內(nèi)的一種信息分子，廣泛存在于自然界和生物體中，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用，還能降血脂、延緩衰老、抗疲勞等作用[2-4]，而流蘇石斛中富含多糖類、氨基酸類、苷類等多種化合物[5-10]?，F(xiàn)代藥理研究表明流蘇石斛中多糖具有提高免疫、抗氧化、肝保護等作用[11-15]。

植物中多糖的提取技術有水提醇沉法、微波法、超聲波法、超臨界流體萃取法等。其中，超聲波輔助水提法相對操作簡單快速，提取效率高，工藝成本也相對低[16]。對流蘇石斛的研究主要集中于組培快繁、成分結構和藥理活性，而關于流蘇石斛多糖的研究較少，試驗以流蘇石斛為原料，采用超聲波輔助提取流蘇石斛中的多糖，用苯酚-濃硫酸法測定其中多糖含量，利用單因素試驗研究液料比、提取溫度、提取時間對多糖制備的影響，在此基礎上進一步通過響應面法分析各因素及其相互作用對多糖得率的影響，得到最優(yōu)多糖制備工藝條件，以期為制備流蘇石斛多糖的中試放大生產(chǎn)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

流蘇石斛（采自貴州省安龍縣欣蔓生物技術有限公司“仙草谷”基地）。

1.2 主要儀器及試劑

RE100-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司]；DK98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；HC-2518高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；BT125D分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；FW100粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHB-Ⅲ真空泵（天津市心雨儀器有限公司）；UV-1800PC型紫外可見分光光度計[翱藝儀器（上海）有限公司]；101-2AB型鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；KH-500TDB型超聲波清洗器；試驗用氯仿、無水乙醇、正丁醇等均為分析純；濃硫酸為優(yōu)級純；D-無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201506）；蒸餾水為實驗室自制。

1.3 標準曲線的繪制

根據(jù)文獻[17-18]的方法，精密稱取10 mg干燥至恒重的無水葡萄糖溶于100 mL蒸餾水中，得0.1 mg/mL無水葡萄糖標準溶液。分別量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL標準溶液至試管中，加蒸餾水至總體積為2 mL，分別加入1 mL臨配的5%苯酚溶液，搖勻，再加入5.0 mL濃硫酸，再次搖勻，置于沸水浴中10 min，冷卻至常溫，在490 nm處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，如圖1所示，得回歸方程y=30.71x-0.006 8，R2=0.998 5。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.4 多糖的提取及其含量測定

1.4.1 樣品溶液的制備

將流蘇石斛除去莖葉須根等雜質(zhì)，洗凈，于55 ℃烘干，用粉碎機粉碎后過0.425 mm（40目）篩，備用。

1.4.2 提取流程及吸光度測定

精密稱取0.2 g流蘇石斛，加入一定體積的蒸餾水在一定溫度下超聲提取一定時間，提取液定容至100 mL，即得樣品溶液。取2 mL樣品溶液至試管中，加入8 mL無水乙醇，搖勻，置冰箱內(nèi)過夜，取出后以8 000 r/min離心20 min，棄上清液，定容至10 mL，用Sevage法除蛋白，取2 mL上清液，然后按照方法1.3測定吸光度，計算多糖得率。

1.5 提取工藝條件的優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗

分別考察液料比、提取溫度和提取時間3個因素對流蘇石斛多糖得率的影響[19-20]。

1.5.2 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，以液料比、提取溫度和提取時間為因素，根據(jù)Box-Behnken設計原理，利用Box-Behnken組合設計試驗方案優(yōu)化提取工藝條件，并最終確定出最佳提取工藝條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對多糖得率的影響

在室溫條件下，超聲提取15 min，確定液料比40∶1，50∶1，60∶1，70∶1和80∶1 mL/g對多糖得率的影響，結果如圖2所示。

由圖2所示，液料比對多糖得率的影響效果較為明顯，在20∶1～40∶1 mL/g時，多糖得率隨著液料比增加而減少，液料比50∶1 mL/g時，多糖得率先升至最高，之后又迅速下降，所以液料比50∶1 mL/g較佳。

圖2 液料比對多糖得率的影響

2.1.2 提取時間對多糖得率的影響

固定液料比50∶1 mL/g，提取溫度為常溫，考察超聲提取時間10，20，30，40和50 min對多糖得率的影響，結果如圖3所示：在10～40 min時，隨著超聲提取時間延長，其多糖得率增加，到50 min時多糖得率下降，因此選擇提取時間40 min較佳。

圖3 提取時間對多糖得率的影響

2.1.3 提取溫度對多糖得率的影響

選取液料比50∶1 mL/g、超聲提取時間15 min，考察提取溫度40，50，60，70和80 ℃對多糖得率的影響，其結果如圖4所示。

由圖4可知，溫度對多糖得率影響較大，40～60 ℃時多糖得率隨溫度升高而增加，溫度60 ℃時多糖得率最高，此后有所下降。因此選取提取溫度60 ℃較佳。

圖4 提取溫度對多糖得率的影響

2.2 響應面試驗設計結果

2.2.1 響應面試驗設計方案與結果

為進一步研究變量之間交互作用的影響關系，使用響應面分析法篩選最佳提取工藝。每個單因素的初步研究是響應面優(yōu)化的指導范圍，基于Box-Behnken設計原理，選擇對多糖得率有影響的3個因素液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）進行三因素三水平響應面分析試驗。響應面試驗因素水平和結果見表1和表2。

表1 響應面試驗因素水平和編碼

表2 試驗設計與結果

2.2.2 模型建立與方差分析結果

利用Design-Expert 10.0.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到二次多項回歸方程：多糖得率R（%）= 10.318+0.016 25A+0.188 75B+0.085C+0.115AB+0.257 5AC- 0.207 5BC-0.543 998A2-1.174B2-0.451 498C2。

對回歸方程進行方差分析，如表3所示。其中，F(xiàn)值可用于檢驗各變量對響應值影響的顯著性的高低。F越大，則相應變量的顯著程度越高。工藝條件對多糖得率影響大小順序為B＞C＞A，即提取時間＞提取溫度＞液料比。模型的決定系數(shù)R2為0.987 0，說明模型具有較高顯著性，而Radj2=0.970 3，能夠解釋試驗97.03%的響應值變異，且與預測相關系數(shù)Rpred2也接近，說明此試驗模型與真實數(shù)據(jù)擬合程度良好，具有實踐指導意義，可用該模型分析和預測最優(yōu)提取工藝。

表3 響應多糖得率擬合回歸方程的方差分析結果

2.2.3 提取工藝各因素響應曲面分析

不同工藝條件對多糖得率的影響見圖5～圖7。從圖5可以看出，液料比和提取時間的交互作用對多糖得率的影響呈拋物面分布，液料比一定時，隨著提取時間增加，多糖得率先上升后下降，且波動幅度較大。同理，提取時間不變時，隨著液料比提高，多糖得率也呈現(xiàn)先增加后減小，但是波動幅度小于提取時間的影響。在二者交互作用下，提取時間在交互作用中的貢獻更大，對多糖得率影響也更大。僅考慮二者因素作用下的最優(yōu)提取工藝組合范圍：液料比45∶1～ 55∶1 mL/g，提取時間35～45 min。如圖6所示，液料比和提取溫度的變化均引起多糖得率先增后減波動。相較于圖5，整體波動幅度相對較小，表明二者交互作用弱于液料比-提取時間交互作用。圖形對稱性較好，表明液料比和提取溫度在交互作用中的貢獻相當。取液料比50∶1 mL/g、提取溫度60 ℃水平附近的值時，該組合作用下的多糖得率最高，實際工藝控制該條件對結果提取比較有利。由圖7可以看出，交互曲面整體呈一近似拱形曲面，且曲面縱向跨度較大，表明二者交互作用顯著。提取時間不變時，提取溫度引起曲面小幅度變化，提取溫度不變時，提取時間引起曲面大幅度變化，也就是說，在交互作用中提取時間的貢獻率更大，實際工藝條件控制中應重點關注該敏感因子，設置合理工藝。提取時間在37～45 min水平范圍內(nèi)取值時，多糖得率較高，應控制該條件從而得到優(yōu)化工藝參數(shù)。

圖6 液料比-提取溫度交互作用對多糖得率的影響（左）和等高線圖（右）

為進一步準確確定全局最優(yōu)解，以最大化多糖得率為優(yōu)化目標，根據(jù)Design-Expert 10.0.1 軟件運行結果，多因素共同影響下的最優(yōu)綜合工藝為液料比50.445∶1 mL/g、提取時間40.744 min、提取溫度60.893 ℃，在此條件下模型預測的多糖得率為10.329%。根據(jù)響應面試驗回歸分析結果可得到等高線圖及三維相應面圖，如圖5～圖7所示。

圖5 液料比-提取時間交互作用對多糖得率的影響（左）和等高線圖（右）

圖7 提取時間-提取溫度交互作用對多糖得率的影響（左）和等高線圖（右）

2.2.4 驗證試驗

考慮到實際操作，將各因子修正為液料比50∶1 mL/g、提取時間41 min、提取溫度61 ℃，在此條件下進行3次平行試驗驗證，得到多糖得率10.19%、相對誤差1.3%，驗證結果與理論試驗結果非常近似，表明該回歸模型合理有效。

3 結論

試驗采用超聲波技術，通過單因素試驗和響應面分析法優(yōu)化流蘇石斛的多糖提取工藝，得到二次回歸方程R（%）=10.318+0.016 25A+0.188 75B+0.085C+ 0.115AB+0.257 5AC-0.207 5BC-0.543 998A2-1.174B2- 0.451 498C2。確定出的最優(yōu)綜合工藝為液料比50.445∶1 mL/g、提取時間40.744 min、提取溫度60.893 ℃。各因素的顯著水平為提取時間＞提取溫度＞液料比。試驗各因素的顯著水平與巫興東等[11]研究結果相同，在此條件下多糖得率理論值為10.329%，實際值為10.19%，二者誤差在1.5%以內(nèi)。因此采用響應面分析法建立模型優(yōu)化得到的制備工藝參數(shù)準確可靠，可用于流蘇石斛多糖提取的中試放大生產(chǎn)指導。石斛多糖是一種良好的活性物質(zhì)，具有良好發(fā)展應用前景。