羊α干擾素在家蠶中的表達及抗小反芻獸疫病毒活性測定

李丹 杜夢潭 修明霞 劉興健 張志芳 李軼女

（1. 中國農業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081；2. 乳山市果茶蠶工作站，煙臺 264500）

干擾素（interferons，IFNs）是病毒或其他誘生劑刺激機體后產生的高活性糖蛋白，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤及免疫調節(jié)活性。1957年，英國病毒生物學家Isaacs在流感病毒實驗中發(fā)現(xiàn)，經病毒感染的細胞會產生某種因子，可以干擾病毒在其它細胞中的復制，因此將其命名為干擾素［1］。近年來，干擾素在病毒學、腫瘤學、細胞學等多個領域成為研究熱點，已經被應用于治療畜禽的病毒性疾病及腫瘤性疾病，并取得良好的效果［2］。此外，由于其治療周期短、能有效預防繼發(fā)感染、減少抗生素使用等優(yōu)點，越來越受到人們的重視。

根據其結合的特異性受體差異，干擾素可被分為I型、Ⅱ型和Ⅲ型。I型干擾素有IFN-α、IFN-β等，IFN-α根據氨基酸序列不同，又將分為IFN-α-2a、IFN-α-1b、IFN-α-2b等，I型干擾素具有很強的抗病毒和抗腫瘤活性，對病毒感染引起的免疫反應發(fā)揮重要的調節(jié)作用。目前，I型干擾素的研究被廣泛關注，已經成為病毒學、腫瘤學等多個學科的研究熱點。Ⅱ型干擾素為IFN-γ，其主要功能是誘導主要組織相容性復合體（MHC）類抗原的表達和進行免疫調節(jié)，但其抗病毒作用弱于I型干擾素［3］。I型干擾素與Ⅱ型干擾素在理化特性及生物學活性上具有明顯的差異，如I型干擾素能夠耐受pH 2.0的酸性條件，而Ⅱ型干擾素則會失活［4］。Ⅲ型干擾素為IFN-λ，于2013年首次被發(fā)現(xiàn)［5-6］，具有廣譜的抗病毒及免疫調節(jié)活性［7］。

IFN-α屬于I型干擾素，具有高度的同源性和明顯的種族特異性，人的干擾素由約165個氨基酸殘基組成，分子量約為19 kD［8-9］，主要由B淋巴細胞及部分巨噬細胞產生［10］。IFN-α可以通過增強NK細胞活性、促進B細胞增生來提高體液免疫活性，實現(xiàn)一定的抗病毒作用。此外，IFN-α可上調Th細胞上白細胞介素受體、主要組織相容性復合體 I、Ⅱ類分子的表達，增強CD8+細胞毒性T細胞應答，通過多種病毒相互作用途徑調節(jié)免疫活性［11］。由于IFN-α具有良好抗病毒及免疫調節(jié)作用，近年來被廣泛應用于臨床［12-14］，如抗病毒、抗腫瘤、免疫調節(jié)等［15］。

小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV），屬于副黏病毒科、麻疹病毒屬，是一種單股負鏈RNA病毒，主要感染山羊、綿羊等小反芻動物［16］，給全球畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴重的損失［17］。本研究將羊α干擾素基因序列進行優(yōu)化合成，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)在家蠶中進行表達，根據細胞病變抑制法在BHK-VSV*GFP系統(tǒng)中檢測其抗病毒活性，并對其抑制小反芻獸疫病毒增殖活性進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細胞Trans 5α購自北京全式金生物技術有限公司；高保真DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；BamH I、EcoR I限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker購自Thermo Scientific公司；實驗用家蠶（JY1）來自中國農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所；脂質體購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；病毒基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；桿狀病毒轉移載體pVL1393、失活拯救型穿梭質粒reBmBac、家蠶卵巢細胞系（BmN）、重組表達綠色熒光蛋白的水皰型口炎病毒（VSV- GFP）、幼地鼠腎細胞（BHK）皆由本實驗室保存；小反芻獸疫病毒疫苗（Clone9株）購自天康生物技術有限公司；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的優(yōu)化合成 從GenBank數(shù)據庫中查找目前已公布的羊α干擾素所有亞型的氨基酸序列，利用MEGA軟件［18］進行序列比對，篩選最優(yōu)氨基酸序列，并通過SignalP、TMHMM軟件對其進行信號肽預測及跨膜區(qū)分析，選擇分泌效率高的信號肽序列。根據家蠶密碼子偏好性對相應基因序列進行優(yōu)化合成，在其上游添加Kozak序列提高翻譯效率，下游添加終止密碼子終止翻譯。利用DNAMAN進行酶切位點分析后，將該序列5′端添加BamH I酶切位點，3′端添加EcoR I酶切位點便于克隆操作，優(yōu)化后的序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成后的基因序列連接在pUC57載體上，命名為pUC57-OviIFN-α。

1.2.2 pVL1393-OviIFN-α轉移載體的構建 將合成后的質粒pUC57-OviIFN-α及桿狀病毒轉移載體pVL1393利用 BamH I、EcoR I于 37℃酶切 30 min，pUC57- OviIFN-α酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳將大小不同的片段分離，用膠回收試劑盒回收OviIFN-α基因片段。pVL1393酶切產物經85℃滅活10 min后，與OviIFN-α片段以1∶6的比例混合，在T4DNA連接酶的作用下，于25℃連接10 min，轉化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細胞，在含有氨芐抗性（60 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基中篩選陽性菌落。挑取單菌落于4.5 mL含有相同濃度氨芐的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)約12 h，利用質粒提取試劑盒提取質粒，并用BamH I、EcoR I對重組質粒進行酶切鑒定，鑒定正確的質粒送至北京睿博興科生物技術有限公司測序，并將其命名為pVL1393-OviIFN-α。

1.2.3 重組桿狀病毒的構建及在家蠶中的表達 將轉移載體pVL1393-OviIFN-α與失活拯救型穿梭質粒reBmBac利用脂質體介導的轉染法共轉染家蠶BmN細胞，于27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約5.5 d，待大量細胞病變后收取細胞培養(yǎng)液，即重組病毒，置于4℃保存，經毒株純化實驗后，保存為毒種。將重組病毒液按照105PFU /頭注射5齡起蠶，同時設置親本病毒感染的家蠶作為對照，待達到家蠶預期的表達高峰時收取表達產物。利用試劑盒提取蠶血淋巴中的基因組DNA，設計引物對病毒基因組DNA中OviIFN-α部分片段進行PCR鑒定。上游引物 5′-CTGCGACTTGCCACACAACCAC-3′；下游引物5′-TTACGGTGAAGCCAAATCGCCG-3′，預期擴增出片段大小為520 bp。

1.2.4 重組羊干擾素α的抗病毒活性檢測 將表達樣品用PBS稀釋10倍后進行超聲破碎，12 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm的濾膜過濾，在BHK細胞中利用微量細胞病變抑制法檢測干擾素對VSV病毒復制的抑制作用，具體操作步驟參考文獻［19］中的方法。根據VSV*GFP在495 nm處有吸收峰的特點，在顯微鏡中對各組熒光情況進行觀察并統(tǒng)計，利用Reed-Muench法計算干擾素的抗病毒活性。

1.2.5 PPRV病毒滴度測定 將BHK細胞以104cell/孔鋪于96孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將PPRV疫苗株從10-1進行10倍倍比稀釋至10-10，每孔100 μL加到上述96孔板中，同時設置空白細胞對照組，每天通過光學顯微鏡觀察細胞狀態(tài)，利用Reed-Muench法計算PPRV病毒的TCID50。

1.2.6 干擾素抑制PPRV增殖活性檢測 將表達樣品以適當倍數(shù)稀釋后以上述1.2.4中的方法在BHK細胞中孵育24 h，棄掉上清液，加入100 TCID50的PPRV 疫苗株病毒，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約36 h，觀察細胞狀態(tài)，待病毒對照組全部發(fā)病時開始記錄，通過Reed-Muench法計算羊α干擾素半數(shù)抑制PPRV所需的單位數(shù)。

2 結果

2.1 OviIFN-α基因的優(yōu)化合成與重組表達載體的構建

將查找的羊α干擾素氨基酸序列進行序列比對發(fā)現(xiàn)，序列號為CAA41790.1及CAA41791.1的氨基酸序列與其它亞型一致性較高。對其進行信號肽預測及跨膜區(qū)分析顯示，其1-23位為信號肽，無跨膜區(qū)。我們選擇登錄號為CAA41790.1的信號肽，其余序列選擇登錄號為CAA41791.1的氨基酸序列。羊α干擾素由195個氨基酸組成，根據家蠶密碼子偏好性對相應基因序列進行優(yōu)化，去除原始序列中高GC含量區(qū)，使得GC含量達到49.92%。CAI值為0.94，表明該基因序列的密碼子使用情況較為理想，優(yōu)化后的基因序列包含588個堿基。將合成的OviIFN-α經過BamH I、EcoR I雙酶切后連接在轉移載體pVL1393上，經轉化、挑斑篩選出陽性菌落，提質粒進行酶切鑒定，鑒定結果如圖1所示，在580 bp及大于9 600 bp附近分別出現(xiàn)清晰條帶，與預期結果一致。將其送至北京睿博興科生物技術有限公司測序，測序結果與目的序列相符，表明成功構建pVL1393-OviIFN-α轉移載體。

圖1 重組質粒的酶切鑒定Fig. 1 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid

2.2 家蠶中重組桿狀病毒的PCR鑒定

為了確定目的基因是否成功重組到桿狀病毒基因組中，并能在家蠶中復制，將羊α干擾素處理組及對照組家蠶的表達產物提取病毒基因組DNA，并設計引物進行PCR擴增，結果如圖2所示，以OviIFN-α樣品基因組DNA為模板時，PCR擴增出與預期大小一致的清晰條帶，而對照中則沒有條帶出現(xiàn)，表明目的基因成功重組到桿狀病毒基因組中。

圖2 重組病毒感染家蠶后蠶血淋巴中目的基因的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of the target gene in the hemolymph of the silkworm infected with the recombinant virus

2.3 羊α干擾素抗病毒活性檢測

采用微量細胞病變抑制法對羊α干擾素抑制VSV病毒活性進行檢測，當100 TCID50單位的VSV病毒感染細胞后，在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光（圖3-C），加入少量干擾素時可部分抑制病毒感染，顯微鏡中會出現(xiàn)少量熒光（圖3-B），而當干擾素濃度較高時能完全抑制病毒復制，則不會有熒光出現(xiàn)（圖3-A），空白細胞對照組同樣不會出現(xiàn)熒光（圖3-D）。我們從病毒對照組8個復孔全部發(fā)病時開始記錄，其結果如表1所示，當蠶血樣品稀釋1.0×104倍時能夠完全抑制VSV*GFP病毒感染，無熒光蛋白產生；稀釋4.0×104倍時不能完全抑制病毒感染，部分產生熒光蛋白，稀釋3.2×105倍時已不能抑制病毒感染，復孔中都有大量熒光蛋白產生，經統(tǒng)計后其熒光產生情況如表1所示，利用Reed-Muench法對其抗病毒效價進行計算。通過多次實驗得出重組羊α干擾素的表達量為6.5×105U/mL左右。

表1 重組羊α干擾素在BHK細胞中抑制VSV*GFP病毒活性檢測Table 1 Recombinant goat interferon alpha inhibits VSV*GFP virus activity in BHK cells

圖3 不同濃度干擾素處理組后BHK細胞感染VSV增殖情況Fig. 3 Proliferation of BHK cells infected with VSV after treatment with different concentrations of interferon

2.4 PPRV病毒滴度測定

PPRV感染BHK細胞36 h時，出現(xiàn)明顯的細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），細胞收縮，形態(tài)發(fā)生改變，并出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，形成合胞體。觀察各孔細胞病變情況并記錄，結果如表2所示，利用Reed-Muench法計算其TCID50，為每1 mL 106TCID50。

表2 PPRV的TCID50測定結果Table 2 TCID50 measurement results of PPRV

2.5 羊α干擾素抑制PPRV增值效果測定

將不同濃度的羊α干擾素用于抑制PPRV病毒在BHK細胞中的復制，抑制情況分為以下4種：PPRV感染BHK細胞病毒后，出現(xiàn)明顯的合胞體（圖4-A）；當加入干擾素能完全抑制PPRV增殖，細胞不發(fā)生病變（圖4-B）；當干擾素能部分抑制PPRV復制時，細胞出現(xiàn)少量合胞體；空白細胞對照組則不會發(fā)生病變（圖4-C）。以病毒組復孔半數(shù)發(fā)生病變?yōu)槠瘘c開始觀察，以病毒組復孔全部發(fā)生病變?yōu)榻y(tǒng)計終點，記錄合胞體出現(xiàn)情況，利用Reed-Muench法對羊α干擾素抑制PPRV病毒效價進行計算。結果顯示，干擾素對PPRV復制的半抑制濃度IC50為 136.93 U。

圖4 羊α干擾素抑制BHK細胞感染PPRV增殖效果圖Fig. 4 Effects of OviIFNα on inhibiting the proliferation of BHK cells infected with PPRV

3 討論

家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前廣泛應用于表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)，本研究利用本實驗室構建的家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)［20］表達羊α干擾素。該系統(tǒng)將家蠶桿狀病毒BmNPV進行基因修飾，并缺失其復制所必須的ORF1629基因，構建相應的失活拯救型穿梭載體pVL1393，使得共轉染時只有外源基因插入的桿狀病毒才能進行復制，該策略使重組效率理論上提高到100%，為羊α干擾素的高效表達奠定了基礎。另外，相對于原核表達系統(tǒng)來說，家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)作為真核表達系統(tǒng)，具有乙酰化、糖基化等翻譯后修飾功能，產物結構與天然蛋白相似，有利于生產具有更高比活的羊α干擾素。本研究利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的羊α干擾素，在BHK-VSV*GFP系統(tǒng)中檢測到其表達量可達6.5×105U/mL。由于本實驗室在之前的豬、雞、犬等干擾素的活性檢測實驗中發(fā)現(xiàn)，家蠶幼蟲或蠶蛹的蛋白，正常桿狀病毒及其表達產物在細胞病變抑制法中都無抗病毒活性［20-21］，因此在檢測干擾素抗病毒活性時，沒有設置正常蠶血組作為對照。此外，由于羊α干擾素具有很強的種屬特異性，該抑制實驗應當在相應羊來源細胞系進行，但由于成熟的羊來源的細胞系較為稀少，故先選擇鼠源細胞（BHK）進行抑制實驗，因此，該干擾素在羊來源細胞中對病毒復制的抑制效果仍需進一步確認。

信號肽在外源蛋白的分泌時發(fā)揮重要作用，它能引導新生肽段穿越真核生物的內質網膜，避免產物大量聚集在細胞中，影響細胞活性。因此，在家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達羊α干擾素時需要保留信號肽序列。但不同的信號肽序列有不同的分泌和切割能力，通過查找GenBank中羊α干擾素不同亞型的信號肽序列，根據信號肽剪切位點得分及S值變化趨勢，篩選出分泌效率高的信號肽序列登錄號為（CAA41790.1）用于本次表達實驗。

I型干擾素是機體固有免疫應答中一類重要的細胞因子，具有廣譜的抗病毒及抗腫瘤等作用［22］。干擾素α屬于I型干擾素中重要的一種，它既能抑制病毒復制，又能調節(jié)宿主免疫功能，其對各種類型細胞的功能都有廣泛的影響。研究表明，病毒感染早期給予外源性IFN-α，可以激活干擾素誘導的抗病毒狀態(tài)，并使NK細胞表達穿孔素和顆粒酶A，從而增加宿主抗病毒的能力［23］。因此，本實驗選擇α干擾素進行抗病毒活性研究，表達具有高效、廣譜抗病毒活性的羊α干擾素。

多年來，小反芻獸疫疫情不斷在國內及周邊國家出現(xiàn)，對全球的羊養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的威脅，減毒活疫苗是目前市場上常用的方法，但其具有安全性低，不能區(qū)分自然感染動物與免疫動物等缺點，為小反芻獸疫疫情的防控帶來了很大的困難，而干擾素具有毒副作用小、抗原性弱，可反復使用等優(yōu)點，對病毒性感染引起的疫情防控具有積極地作用。近年來，干擾素已經被廣泛用于多種動物的抗病毒作用研究，并取得了一定的進展，目前市場上商品化的豬、犬、雞等重組干擾素產品已應用于實踐。本實驗將羊α干擾素用于抑制小反芻獸疫病毒增殖研究，結果顯示僅需136.93 U就可以對PPRV 病毒的復制產生明顯的抑制作用，該結果有望為小反芻獸疫疫情防控提供新的方法。

4 結論

本研究利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了羊α干擾素，經BHK-VSV*GFP系統(tǒng)檢測到該干擾素具有較強的抗病毒活性，為大量生產廉價且高效的羊α干擾素提供了一種新的方法。另外，該干擾素在對PPRV病毒的抑制實驗中顯示出較強的抗病毒作用，為干擾素用于PPRV疫情的防控提供了理論基礎。