斑馬魚notch3基因真核表達載體的構(gòu)建及其表達分析

吳坤坤 徐行 季策 任建峰 李偉明 張慶華

（1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 國家水生動物病原庫，上海 201306；3. 密歇根州立大學(xué)漁業(yè)與野生生物系，東蘭辛 48824，美國）

Notch分子是一種跨膜的信號受體，在發(fā)育模式、細胞命運決定、細胞生存和增殖調(diào)控與免疫等方面都發(fā)揮著重要作用［1-2］。Notch信號通路調(diào)控著神經(jīng)細胞增殖、分化和凋亡之間的平衡［1，3］，對細胞分化也起著決定性作用，同時Notch受體還可以通過調(diào)節(jié)干細胞及其譜系和其他細胞過程，繼續(xù)在成人組織的維持和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。notch基因最先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，該基因突變可造成黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）翅膀邊緣缺刻（notch），故被命名為notch，果蠅中只有一個notch基因［4］。隨著基因在進化過程中的復(fù)制和多樣性變化，在人體中產(chǎn)生了4個Notch同源基因（Notch1-4），它們既有重疊的功能，又有各自的功能［5-6］。Notch分子是單次跨膜分子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體產(chǎn)生，經(jīng)過Furin蛋白酶切割成熟之后形成一個以非共價鍵結(jié)合的單次跨膜蛋白，包括胞內(nèi)段（notch intracellular domain，NICD）、 跨 膜 區(qū)（transmembrane domain，TMD和胞外段（extracellular domain，NECD）3部分［7］。在受到蛋白水解酶切割時被激活是Notch的一個基本特征。在被激活時Notch受體會被金屬蛋白酶和γ-分泌酶切割加工，隨后釋放的Notch受體胞內(nèi)段NICD進入細胞核，NICD在入核后與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CSL組成一個臨時的核轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。一旦NICD綁定到CSL上，NICD便會募集其他激活蛋白包括Mastermind（MAM）/Lag-3形成三元復(fù)合體，進而募集ARCL/MED介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物誘導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達［8］。

Notch3作為4個Notch分子的一員，在生物的發(fā)育、修復(fù)和免疫等過程中都發(fā)揮著重要作用，特別是在一些疾病中。研究表明，Notch3也有很高的配體非依賴性特征，這可能與Notch3的功能和病理特征有關(guān)［9］。在T細胞急性淋巴細胞白血?。═-ALL）中，通過鑒定染色體易位，異常的Notch信號首次與人類癌癥聯(lián)系在一起［10］。在很多病例中Notch3的過度表達都是引發(fā)疾病的重要原因之一［11-12］。特異性針對Notch3 結(jié)構(gòu)域的阻斷抗體已被證明具有抗白血病的效果［13］。而且Notch3分子同Notch1分子一樣，能夠調(diào)節(jié)類似的下游致癌基因，包括驅(qū)動細胞生長調(diào)節(jié)因子Myc［14］。另有研究發(fā)現(xiàn)，Notch3與NF-κB（nuclear factor-кB）家族關(guān)系密切，Notch3受體表達的下調(diào)會抑制NF-κB信號通路，而NF-κB信號通路又是免疫學(xué)中的重要通路［15］。以上研究表明Notch3在發(fā)育和免疫方面都有著重要作用，Notch3分子可能具有復(fù)雜的分子調(diào)控機制，使其表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能。因此，有必要進行詳細的研究。

斑馬魚（Danio rerio）是一種新興的實驗動物，其易于飼養(yǎng)和繁殖，具有透明的胚胎，適合于胚胎發(fā)育、神經(jīng)生成和高通量毒理學(xué)等研究。斑馬魚胚胎的透明性允許在發(fā)育的所有階段應(yīng)用高分辨率成像技術(shù)。受精后5 d（5 days post fertilization，5 dpf）以內(nèi)的斑馬魚胚胎被歐盟指令（2010/63/EU）以及美國的實驗動物管理和使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）視為不受保護的生命階段。因此，斑馬魚胚胎是能夠很好代替其他成年動物的模式生物［16］。在一些微生物感染的實驗中，斑馬魚作為實驗動物的優(yōu)勢尤為明顯［17］。同時，作為一種脊椎動物，與線蟲和果蠅相比，斑馬魚在進化上與哺乳動物的關(guān)系更密切，在一些藥物研究中可以更容易地推斷出在人類中應(yīng)用的效果［18］。因此，斑馬魚模型具有更強的研究潛力。為了進一步研究Notch3分子在發(fā)育、炎癥和天然免疫方面的作用機制，本研究克隆了斑馬魚notch3基因的胞內(nèi)段（notch3 intracellular domain，N3ICD），并構(gòu)建了真核表達載體，將其轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。亞細胞定位發(fā)現(xiàn)重組的真核表達載體可以在細胞核中表達，同時蛋白質(zhì)印跡（Western blot，WB）結(jié)果顯示N3ICD蛋白能夠正常表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用魚 實驗用AB品系斑馬魚購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所斑馬魚平臺，參照WESTERFIELD要求［19］，飼養(yǎng)于本實驗室的斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中。實驗按照上海海洋大學(xué)動物實驗倫理審查委員會（SHOU-DW-2016-002）的要求進行。

1.1.2 實驗細胞 實驗所用HEK293T細胞（人胚腎細胞）由海軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國家重點實驗室惠贈，本實驗室按照ATCC數(shù)據(jù)庫方法將細胞進行保種和培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（TIANGEN，DP204-02），胰蛋白酶TrypLETMExpress（Gibco，1950685），快速質(zhì)粒小提試劑盒（BIOMIGA，PD1222-01 50）， 簡 單 培 養(yǎng) 基 Opti-MEM（Gibco，1894141），DMEM培養(yǎng)基（HyClone，AD24464275），轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD Transfection Reagent（Promega，0000352595），哺乳動物表達載體p3XFLAG-CMV-7（SIGMA），同源重組試劑2×ClonExpress Mix（諾唯贊，C115-02-AA），Bovine Serum Albumin（SIGMA，WXBC7961V），20×PBS（ 生 工，D609KA5801），TritonTMx-100（SIGMA，053K00262V），多聚甲醛（ 生 工，CB05BA0005），Alexa FluorTM488goat antimouse lgG9（H+L）（Invitrogen，1834337）， 小 鼠 抗FLAG-tag單克隆抗體（YSASEN，30503ES60），Goat anti-Mouse IgG（H+L）Secondary Antibody，HRP（Invitrogen，31430），β-actin，Rabbit pAb（YSASEN，30102ES40），Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（YSASEN，33101ES60）引物合成及菌液測序均在生工生物工程（上海）有限公司進行。Dual-Luciferase? Reporter Assay System 及 FuGENE Hd均購于Promega公司。實驗涉及NF-κB家族rela和nfκb1基因啟動子報告基因載體 pGL3-rela-promoter-Enhancer和 pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer均由本實驗室自行構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚notch3胞內(nèi)段真核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)NCBI網(wǎng)站上登錄的斑馬魚notch3基因（NM_131549.2）的CDS區(qū)設(shè)計的引物如表1所示。以1 dpf的野生型斑馬魚的cDNA為模板，利用高保真酶進行PCR擴增，擴增的體系為：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 12.5 μL，DNA Template 20 ng，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，ddH2O 9.5 μL，擴增的程序為98℃預(yù)變性20 s，98℃變性30 s、65℃退火30 s、72℃延伸1.5 min，共34個循環(huán)，72℃終延伸5 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物純化回收，使用限制性內(nèi)切酶PstⅠ和BamHⅠ對質(zhì)粒載體p3xFLAG-CMV-7進行雙酶切。載體p3xFLAGCMV-7的質(zhì)粒圖譜請見http：//www.biofeng.com/zaiti/buru/p3XFLAG-CMV-7.html，將切開的載體用DNA純化試劑盒純化。純化之后用同源重組連接酶2×ClonExpress Mix將PCR純化產(chǎn)物和酶切后的載體p3xFLAG-CMV-7相連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，涂布含有氨芐抗性的平板，12 h后挑單克隆并搖菌，3 h后將部分陽性克隆送測序，另一部分進行保存，將測序成功的菌液提取質(zhì)粒。

表1 N3ICD引物擴增序列Table 1 N3ICD primer amplification sequence

1.2.2 Notch3氨基酸序列生信分析 利用SMART在線分析斑馬魚Notch3結(jié)構(gòu)域，通過DNAMAN將斑馬魚Notch3氨基酸序列與人（Homo spaiens）、小鼠（Mus musculus）和鯉魚（Cyprinus carpio）的Notch3氨基酸序列進行比對?；诟魑锓NNotch3的氨基酸序列使用MEGA7.0軟件利用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 pCMV-N3ICD亞細胞定位 將構(gòu)建好的pCMV-N3ICD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中。轉(zhuǎn)染前，將細胞接種到35 mm玻璃底培養(yǎng)皿中，融合率達到70%-80% 時進行轉(zhuǎn)染。在培養(yǎng)皿用HD轉(zhuǎn)染試劑將pCMV-N3ICD和pCMV載體質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)染500 ng。轉(zhuǎn)染24 h后，將細胞用4%多聚甲醛固定15 min，用1×PBS漂洗3次，并在-20℃下用100%甲醇透化10 min，然后用1×PBS漂洗3次。在封閉緩沖液（1×PBS / 5% 正常山羊血清/0.3% Triton X-100）中將樣品孵育1 h。封閉后，添加抗體緩沖液（1×PBS/1% BSA/0.3% TritonX-100/1∶1 000小鼠抗FLAG-tag單克隆抗體）4℃下孵育12-16 h。再用1×PBS漂洗3次，加入包含偶聯(lián)熒光素二抗并室溫下避光孵育1-2 h，1×PBS漂洗3次，添加DAPI，并將樣品在黑暗中孵育1-2 h。用1×PBS沖洗3次后，在共聚焦顯微鏡下觀察標本并拍照。

1.2.4 斑馬魚N3ICD的蛋白表達分析 將重組質(zhì)粒pCMV-N3ICD脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293T細胞24 h后提取蛋白。根據(jù)BCA 法對蛋白進行定量。取25 μg樣品進行SDS-PAGE聚丙烯胺凝膠電泳，將樣品轉(zhuǎn)至NC膜上，封閉10 h，PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，以鼠源FLAG-tag抗體為一抗（1∶3 000倍稀釋）并孵育3 h，然后PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，以山羊抗鼠為二抗（1∶3 000倍稀釋）孵育3 h，再用PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，ECL顯色，發(fā)光，分析Western blot結(jié)果。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因活性分析及功能驗證 HEK293T細胞培養(yǎng)于10% FBS-DMEM培養(yǎng)液中，置于5% CO2，37℃無菌培養(yǎng)箱中，每48 h傳代1次。HEK293T細胞轉(zhuǎn)染前24 h接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，接種的細胞密度約5.0×104/孔，匯合率達到80%。具體步驟為：用10 cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)HEK293T細胞，待細胞匯合度80%-90%時吸出舊培養(yǎng)基，貼壁加入2 mL DPBS緩沖液，輕輕晃動后吸除DPBS，重復(fù)清洗2次。加入500 μL細胞消化胰酶，于37℃培養(yǎng)箱消化1 min，輕敲培養(yǎng)皿底部使貼壁細胞完全脫落，加入10倍體積的DMEM完全培養(yǎng)基（含有10% FBS）終止消化，并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中800 r/min離心3 min。吸去上清，加入適量DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，用血球計數(shù)板進行計數(shù)。24孔板中每孔鋪1×105個細胞，37℃培養(yǎng)。

將斑馬魚真核表達載體pCMV- notch3、NF-κB家族基因啟動子重組質(zhì)粒pGL3-rela-promoter-Enhancer或 pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer和 TK 內(nèi)參熒光報告基因載體共轉(zhuǎn)至HEK293T細胞中，檢測過表達notch3基因?qū)ο掠蜰F-κB家族rela和nfκb1基因啟動子活性的影響。轉(zhuǎn)染體系中對照組為：pCMV-Tag2B 400 ng、pCMV- notch3 0 ng、pGL3-relapromoter-Enhancer/pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer 100 ng、pRL-TK 10 ng；實驗組為：pCMV-Tag2B 100 ng、pCMV- notch3 300 ng、pGL3-rela-promoter-Enhancer/pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer 100 ng、pRL-TK 10 ng。轉(zhuǎn)染24 h后按照Dual-Luciferase? Reporter Assay System說明書并用多功能酶標儀（FlexStation3）進行雙熒光素酶報告基因檢測。每組3次技術(shù)重復(fù)，實驗重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標準誤（mean±SEM）表示，用Prism 6軟件進行顯著性差異分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Notch3氨基酸序列生物信息學(xué)分析

生信分析結(jié)果顯示斑馬魚Notch3編碼2 468個氨基酸，主要由6個部分構(gòu)成，23-1 379位點為35個EGF重復(fù)序列，1 385-1 503位點為3個NL區(qū)域，1 507-1 563位點為NOD結(jié)構(gòu)域，1 575-1 637位點為NODP結(jié)構(gòu)域，1 791-2 003位點為6個ANK結(jié)構(gòu)域，以及2383-2446位點為DUF功能未知的結(jié)構(gòu)域。斑馬魚與鯉魚Notch3氨基酸一致性最高為92.64%，與人和小鼠一致性分別為54.85%和54.15%。用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，哺乳動物Notch3聚為一大支，兩棲類和魚類Notch3聚為另一大支，而斑馬魚的Notch3又與硬骨魚類聚為一支，而哺乳動物各自聚為一個分支（圖1）。

圖1 NJ法構(gòu)建Notch3進化樹Fig. 1 Construction of Notch3 evolutionary tree by NJ method

2.2 斑馬魚notch3基因胞內(nèi)段的擴增以及真核表達載體的構(gòu)建

以1 dpf大小野生型斑馬魚的cDNA為模板，設(shè)計引物克隆notch3基因的胞內(nèi)段。電泳結(jié)果顯示，在約2 500 bp處出現(xiàn)單一條帶（圖2），與預(yù)測的目的片段大小一致。然后將PCR產(chǎn)物進行純化，純化之后將其與雙酶切后的載體p3xFLAG-CMV用同源重組的方式連接，并經(jīng)過轉(zhuǎn)化和菌液PCR篩選出陽性克隆。將構(gòu)建的真核表達載體命名為pCMVN3ICD，并經(jīng)測序驗證其與預(yù)測信息一致。

圖2 notch3基因胞內(nèi)段的克?。ˋ）及重組質(zhì)粒的構(gòu)建（B）Fig. 2 Cloning of notch3 gene Intracellular domain（A）and construction of recombinant plasmid（B）

2.3 重組質(zhì)粒亞細胞定位

為了驗證構(gòu)建好的重組質(zhì)粒的表達位置，進行細胞免疫熒光實驗。我們用DAPI試劑標記細胞核（藍色熒光），F(xiàn)LAG抗體標記pCMV-N3ICD（綠色熒光），并進行了明場觀察，pCMV質(zhì)粒用作對照。在共聚焦顯微鏡下，pCMV-N3ICD聚集在HEK293T細胞核中，這說明成功構(gòu)建了pCMV-N3ICD真核表達載體（圖 3）。

圖3 pCMV-N3ICD在HEK293T細胞中的定位Fig. 3 Localization of pCMV-N3ICD in HEK293T cells

2.4 利用Western blot分析N3ICD蛋白的表達

為了驗證重組質(zhì)粒在HEK293T細胞中的表達情況，我們采用了蛋白質(zhì)免疫印跡法分析。轉(zhuǎn)染pCMV-N3ICD質(zhì)粒的實驗組使用Flag抗體出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，而轉(zhuǎn)染p3×FLAG-CMV的載體質(zhì)粒的對照組中未見相關(guān)條帶，表明實驗組有N3ICD目的蛋白的表達（圖4）。

圖4 Western blot檢測N3ICD蛋白的表達（通過Flag標簽顯示）Fig. 4 Expression of N3ICD protein was detected by Western blot（shown by Flag tag）

2.5 過表達斑馬魚notch3基因?qū)F-κB家族基因啟動子活性的影響

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCMV-notch3分別與NF-κB家族rela和 nfκb1啟動子報告基因共轉(zhuǎn)至HEK293T細胞，即在HEK293T細胞中過表達斑馬魚notch3基因，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測細胞中NF-κB家族rela和nfκb1啟動子報告基因的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示過表達斑馬魚notch3基因后，pGL3-rela-promoter-Enhancer和 pGL3-nfκb1-Enhancer啟 動子的轉(zhuǎn)錄活性均顯著升高，rela啟動子活性約為對照組的4.5倍，nfκb1轉(zhuǎn)錄活性約為對照組活性的7倍（圖5）。

圖5 過表達斑馬魚notch3基因Fig. 5 Overexpression of notch3 gene

3 討論

Notch信號是胚胎和成年動物組織中調(diào)節(jié)細胞命運的重要信號通路。很多研究都表明了其在發(fā)育中的重要作用，在哺乳動物中，Notch和TGF信號通路的相互調(diào)節(jié)可以延緩腎間質(zhì)纖維化的進程［20］。同時，Notch 信號通路參與調(diào)控肺動脈內(nèi)皮細胞的凋亡及肺動脈血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換的過程，可以導(dǎo)致肺動脈高壓肺血管重構(gòu)的發(fā)生［21］。此外，Notch信號被認為是影響腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的重要通路之一，Notch 信號能夠介導(dǎo)許多分子的分泌，從而影響TME 中的細胞功能［22］。還有研究表明Notch1和Notch3之間的相互作用促進了鱗狀細胞癌的增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生［23］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Notch3對發(fā)育和人類的健康都十分重要，Notch3也越來越受到關(guān)注，如Notch3信號傳導(dǎo)的異常會促進血管的過度出芽［24］，還能夠影響常染色體顯性遺傳腦動脈病以及癌癥等［25］。然而，相較于Notch3，Notch家族的其他成員具有更明顯的多效性作用，所以對于Notch3的研究還不深入。本研究構(gòu)建了斑馬魚N3ICD真核表達載體，對其序列特征進行了生物信息學(xué)分析，并從測序、亞細胞定位和Western blot等方面進行了驗證，旨在進一步研究Notch3不同于其他Notch蛋白的獨特調(diào)控方式，為探究Notch3在發(fā)育和免疫中的功能打下基礎(chǔ)。同時為Notch3的異常表達和調(diào)控而導(dǎo)致的疾病，開發(fā)出更具針對性的治療方案提供幫助。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，Notch信號參與了天然免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，特別是巨噬細胞活化和極化的調(diào)控。在過去的幾年中，多項研究表明，Notch信號在髓樣細胞（尤其是巨噬細胞）的分化和激活中具有關(guān)鍵作用［26］，并參與炎癥性相關(guān)疾病的發(fā)生。在不同的炎癥疾病模型中，Notch受體表達的增加能夠引起病理性炎癥［27］。Notch3通過其活性、表達改變或錯誤調(diào)節(jié)與人類疾病密切相關(guān)。在大腸癌患者中，Notch3表達與腫瘤分級，淋巴結(jié)的存在以及遠端轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并且在間質(zhì)大腸癌腫瘤中特異上調(diào)［28］。同時在哺乳動物中Notch3在炎癥控制時也起重要作用，有報道顯示Notch3能夠影響NF-κB活化和促炎巨噬細胞的發(fā)育，Notch3可以促進NF-κB的激活并能夠促進由TLR-4激活的巨噬細胞中促炎基因的表達［29］。在上述結(jié)果中，我們所構(gòu)建的N3ICD真核表達載體能夠明顯增強NF-κB家族中rela和nfκb1啟動子的活性。這不僅說明了我們構(gòu)建的真核表達載體能夠正常表達并行使功能，也進一步證明了Notch3與NF-κB家族密切相關(guān)，并能夠影響NF-κB通路的活化，由此可見Notch3在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。我們的實驗結(jié)果能夠為今后于斑馬魚中深入研究Notch3在發(fā)育生物學(xué)、先天免疫及炎癥等方面的功能提供幫助。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了斑馬魚N3ICD真核表達載體，并進行了表達分析，所構(gòu)建的N3ICD真核表達載體能夠?qū)F-κB家族中rela和nfκb1啟動子的活性產(chǎn)生影響，使其活性明顯升高。