冷凍電鏡技術(shù)在分子植物學(xué)研究中的應(yīng)用

殷國(guó)良 孫文浩 龐效云 孫飛

（1. 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

1 冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展歷史

光學(xué)顯微鏡的發(fā)明使得人們于17世紀(jì)第一次看見(jiàn)細(xì)胞，推動(dòng)了細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立。但由于光學(xué)顯微鏡的分辨能力有限，限制了對(duì)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察。1931年，Max Knoll和Ernst Ruska發(fā)明了世界上第一臺(tái)透射電子顯微鏡，為人們觀察細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)提供了可能。但在發(fā)明之初，利用電子顯微鏡觀察生物樣品存在明顯的局限性：一是使用電子顯微鏡觀察生物樣品需要嚴(yán)格的真空環(huán)境，而真空環(huán)境會(huì)導(dǎo)致生物樣品脫水而改變其自然狀態(tài)；二是利用電子對(duì)生物樣品成像時(shí)所帶來(lái)的輻照損傷在一定程度上會(huì)破壞樣品的自然狀態(tài)。為了克服這些問(wèn)題，人們自19世紀(jì)60年代以來(lái)發(fā)展出了一套生物電鏡樣品制備技術(shù)，通過(guò)化學(xué)固定、脫水、樹(shù)脂包埋、超薄切片、重金屬染色等步驟制備出適合于電子顯微鏡觀察的生物樣品，或者通過(guò)重金屬負(fù)染色的方法制備出適合于電子顯微鏡觀察的病毒顆粒、生物大分子復(fù)合體等樣品，基于這些樣品制備技術(shù)，人們利用電子顯微鏡開(kāi)始觀察細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了諸如線粒體、葉綠體、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有效推動(dòng)了細(xì)胞生物學(xué)的研究。然而傳統(tǒng)的樣品制備和電鏡成像方法依然無(wú)法使得人們研究接近天然狀態(tài)的生物樣品結(jié)構(gòu)，這就是冷凍電鏡技術(shù)需要解決的問(wèn)題。

英國(guó)劍橋大學(xué)Richard Henderson在冷凍電鏡技術(shù)的早期發(fā)展過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。1975年，他與同事獲得了細(xì)菌視紫紅質(zhì)的7?分辨率的三維結(jié)構(gòu)［1-2］，這是歷史上第一個(gè)膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并首次證明利用電子顯微鏡可以獲得生物大分子亞納米分辨率的結(jié)構(gòu)。為達(dá)到防止真空干涸及降低電子輻照損傷的目的，Henderson與其同事在樣品表面包被了葡萄糖，并建立了低劑量電子照明技術(shù)——冷凍電鏡技術(shù)的重要組成部分。1990年Henderson等［3］利用冷凍電子晶體學(xué)技術(shù)解析了近原子分辨率的細(xì)菌視紫紅質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，有力證明了電子顯微鏡在生物大分子高分辨率成像方面所具備的潛力。1981年，瑞士洛桑大學(xué)的Jacques Dubochet團(tuán)隊(duì)發(fā)明了快速冷凍的方法，使得病毒顆粒、生物大分子等生物樣品可以通過(guò)冷凍固定保持其天然的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，并用于冷凍電鏡成像。他們的方法是將待觀察的樣品迅速冷凍于非晶態(tài)的冰中（也稱(chēng)玻璃態(tài)冰），既可以防止生物樣品暴露在高真空狀態(tài)下嚴(yán)重脫水，同時(shí)在低溫情況下可以顯著降低電子輻照損傷。在樣品快速冷凍制備和冷凍電鏡低劑量成像技術(shù)出現(xiàn)之后，第三個(gè)需要克服的問(wèn)題是生物大分子冷凍電鏡圖像的處理、解析和三維重構(gòu)。美國(guó)哥倫比亞大學(xué)喬基姆·弗蘭克（Joachim Frank）和他的同事則率先針對(duì)這個(gè)問(wèn)題提出了行之有效的計(jì)算處理方法，他們對(duì)同一生物大分子樣品多個(gè)不同拷貝的冷凍電鏡圖像進(jìn)行對(duì)齊和平均，以提高圖像的信噪比；在獲得了樣品不同角度的二維圖像后，再利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)其三維重構(gòu)從而得到樣品的三維結(jié)構(gòu)。至此，冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)（cryo-SPA）［4］完成了樣品快速冷凍玻璃態(tài)化［5］、生物樣品電子輻射損傷［6-7］、蛋白質(zhì)機(jī)器單顆粒圖像分類(lèi)分析［8］等關(guān)鍵技術(shù)理論的建立，從而發(fā)展成為一項(xiàng)研究蛋白質(zhì)機(jī)器三維結(jié)構(gòu)的重要手段。2017年，Richard Henderson、Jacques Dubochet和 Joachim Frank三 人由于“開(kāi)發(fā)冷凍電鏡，用于溶液中生物分子結(jié)構(gòu)的高分辨率測(cè)定”的原創(chuàng)奠基性工作，共同獲得了該年度的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

近些年來(lái)，冷凍電鏡技術(shù)取得飛速發(fā)展。在樣品制備方面，載網(wǎng)支持膜技術(shù)的完善（包括了石墨烯支持膜［9］、氧化石墨烯支持膜［10］、多晶金膜［11］、非晶鎳鈦合金膜［12］和疏水蛋白膜［13］等），以及新型快速冷凍技術(shù)的研發(fā)（包括VitroJet技術(shù)［14］和Spotiton技術(shù)［15］），使得冷凍樣品的制備效率和質(zhì)量得到顯著提高，在一定程度上避免了由氣液界面所帶來(lái)的蛋白樣品變性和取向優(yōu)勢(shì)問(wèn)題，提升了冷凍電鏡的成像質(zhì)量，減少了蛋白樣品的用量，可以獲得更高質(zhì)量和更高分辨率的生物樣品三維結(jié)構(gòu)。

在軟硬件設(shè)備方面，具有先進(jìn)電子光學(xué)系統(tǒng)的高穩(wěn)定電子顯微鏡（FEI Titan Krios）、高性能直接電子探測(cè)相機(jī)（Gatan K2/K3，ThermoFisher Scientific Falcon III/IV，DE-20/64）、能量過(guò)濾器的開(kāi)發(fā)與使用（ThermoFisher Scientific Selectris X）、數(shù)據(jù)采集自動(dòng)化程度不斷地提高（SerialEM，Leginon，EMAutomation和 UCSFImage4）、電子束傾斜（beam tilt）和電子束平移（beam-image-shift）的校正使得數(shù)據(jù)收集的效率和質(zhì)量得到顯著提高。在數(shù)據(jù)處理方面，高度自動(dòng)化軟件的開(kāi)發(fā)，如RELION［16］、cryoSPARC［17］、Warp［18］等，逐漸替代了人工干預(yù)，使得冷凍電鏡三維重構(gòu)分辨率得到進(jìn)一步提高［19］。

基于上述軟硬件設(shè)備和數(shù)據(jù)處理算法的突破，2013年程亦凡與合作者利用cryo-SPA技術(shù)首次獲得膜蛋白TRPV1的3.4?結(jié)構(gòu)［20］，標(biāo)志著冷凍電鏡技術(shù)正式打開(kāi)近原子分辨率結(jié)構(gòu)的大門(mén)，到2020年，Yip等［21］依賴于硬件的進(jìn)步（球差校正器、單色儀等）解析獲得了1.25?分辨率的脫鐵鐵蛋白結(jié)構(gòu)，Nakane等［22］使用冷場(chǎng)發(fā)射槍?zhuān)芰窟^(guò)濾器和更靈敏的直接電子探測(cè)相機(jī)獲得了人膜蛋白β3GABAA受體的1.7?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)和小鼠脫鐵鐵蛋白1.22?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)提供揭示了前所未有的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。在這期間，同時(shí)有大量復(fù)雜蛋白質(zhì)機(jī)器的高分辨率結(jié)構(gòu)通過(guò)cryo-SPA技術(shù)得到了解析，包括酵母剪接體2.9-3.8?的高分辨率結(jié)構(gòu)［23］、非洲豬瘟病毒顆粒精細(xì)三維結(jié)構(gòu)［24-25］、G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）［26-33］、線粒體呼吸鏈系統(tǒng)中的眾多膜蛋白復(fù)合體［34-36］。在新冠疫情防控中，冷凍電鏡技術(shù)扮演著十分重要的角色，如新冠病毒的刺突蛋白結(jié)構(gòu)［37-42］、RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）結(jié)構(gòu)［43］均通過(guò)單顆粒分析技術(shù)迅速解析，進(jìn)一步證明冷凍電鏡cryo-SPA技術(shù)在生物樣品精細(xì)結(jié)構(gòu)解析方面的巨大潛力。

冷凍電鏡技術(shù)除了可以觀察溶液中的蛋白質(zhì)分子，也可以對(duì)細(xì)胞、組織等復(fù)雜的生物學(xué)樣品進(jìn)行成像，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的各種蛋白質(zhì)機(jī)器進(jìn)行指認(rèn)和分析，解析蛋白質(zhì)機(jī)器在接近自然狀態(tài)下的三維結(jié)構(gòu)，這就是蛋白質(zhì)分子機(jī)器的冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）技術(shù)。該技術(shù)最早由德國(guó)馬普生化細(xì)胞所的Baumeister等［44］發(fā)展起來(lái)。近年來(lái)，由于各項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)步和突破，包括透射電鏡平行光照明技術(shù)、直接電子探測(cè)技術(shù)、相位板技術(shù)［45-46］、基于直接電子探測(cè)相機(jī)的新型圖像處理技術(shù)、輻射損傷補(bǔ)償技術(shù)、三維圖像分類(lèi)處理技術(shù)以及聚焦離子束（focused ion beam，F(xiàn)IB）銑削技術(shù)［47-49］等，使蛋白質(zhì)機(jī)器的冷凍電鏡原位結(jié)構(gòu)解析技術(shù)取得了進(jìn)一步發(fā)展，包括細(xì)菌細(xì)胞鞭毛馬達(dá)［50-53］的原位結(jié)構(gòu)分析、肌動(dòng)蛋白［54-55］的原位結(jié)構(gòu)分析以及核孔復(fù)合物（nuclear pore complex）［56-58］的高分辨率原位結(jié)構(gòu)解析。這些蛋白質(zhì)機(jī)器在細(xì)胞原位的高分辨率結(jié)構(gòu)解析會(huì)極大推動(dòng)人們對(duì)于蛋白質(zhì)機(jī)器在生理環(huán)境下結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)的認(rèn)識(shí)。

冷凍電鏡技術(shù)的飛速發(fā)展也推動(dòng)了生物三維電鏡技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，這方面的介紹可以參考《生物三維電子顯微成像技術(shù)展望》一書(shū)［59］。

冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展至今，其解析的結(jié)構(gòu)已達(dá)17 000多個(gè)，涉及動(dòng)物學(xué)、分子植物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域（引自https://www.ebi.ac.uk/emdb/statistics）。本文將對(duì)近年來(lái)人們利用冷凍電鏡技術(shù)在植物光合作用及脅迫響應(yīng)等方面進(jìn)行的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述，以此展望未來(lái)冷凍電鏡技術(shù)在分子植物學(xué)研究領(lǐng)域的重要應(yīng)用前景。

2 冷凍電鏡在光合作用分子機(jī)理研究方面的應(yīng)用

光合作用是科學(xué)界公認(rèn)的、地球上最重要的生化反應(yīng)。植物體通過(guò)直接吸收光能，分解水釋放氧氣，將二氧化碳轉(zhuǎn)換為碳水化合物。光合作用的分子機(jī)制十分復(fù)雜，包含光反應(yīng)及暗反應(yīng)兩個(gè)階段，其中涉及光能的吸收、電子的傳遞和能量的轉(zhuǎn)化等一系列物理化學(xué)及生物化學(xué)反應(yīng)。目前，光合作用的機(jī)理依然有諸多問(wèn)題需探索，諸如蛋白復(fù)合體之間如何組裝、相關(guān)蛋白如何捕獲并吸收光能等。X-射線晶體學(xué)在植物光合作用的研究中已發(fā)揮了重要的作用［60-61］，PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)該方法解析結(jié)構(gòu)的數(shù)量也具有較高的占比（圖1），為我們了解光合作用的分子機(jī)理提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。但鑒于該方法受限于獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)結(jié)晶，極大地限制了光系統(tǒng)中復(fù)雜生物大分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)解析，因此通過(guò)X-射線晶體學(xué)方法僅局限于分子量較小的光合作用相關(guān)蛋白研究，這限制了我們對(duì)光合作用分子機(jī)制的進(jìn)一步探究。冷凍電鏡技術(shù)的興起與發(fā)展填補(bǔ)了這一缺陷，不需要結(jié)晶，能夠保持樣品的天然狀態(tài)，為深入了解植物體的光合作用分子機(jī)制提供了新的技術(shù)手段。

圖1 光合作用相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)解析采用的手段Fig. 1 Methods used for structural analysis of photosynthesis-related proteins

在整個(gè)光合作用的過(guò)程中，各蛋白復(fù)合物之間的電子傳遞是其核心部分。目前冷凍電鏡技術(shù)在植物光合作用領(lǐng)域的研究主要集中在對(duì)電子傳遞鏈中各重要組分的結(jié)構(gòu)解析，以闡明光合作用的原理與機(jī)制。在所有能夠進(jìn)行光合作用的生物體內(nèi)，都具有光系統(tǒng) I（photosystem I，簡(jiǎn)稱(chēng)PSI）和光系統(tǒng) II（photosystem II，簡(jiǎn)稱(chēng)PSII）兩個(gè)主要組成部分。其中PSI因其能被波長(zhǎng)為700 nm的光所激發(fā)，故也被稱(chēng)為P700；同理，PSII可被波長(zhǎng)為680 nm的光激發(fā)，也被稱(chēng)為P680。PSI和PSII通過(guò)電子傳遞鏈連接在一起，并高度有序地排列在類(lèi)囊體膜上，它們主要起到電子傳遞和質(zhì)子傳遞的功能。本小節(jié)將對(duì)利用冷凍電鏡技術(shù)研究光合作用相關(guān)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行綜述。

2.1 冷凍電鏡在光系統(tǒng)I結(jié)構(gòu)與功能研究中的應(yīng)用

PSI復(fù)合物分子量低于PSII復(fù)合物，它僅存在于基質(zhì)和基粒片層的非堆疊區(qū)域。PSI的核心復(fù)合體由反應(yīng)中心色素PSI、電子受體和捕光復(fù)合體（light harvesting complex I，LHCI）所組成。關(guān)于PSI復(fù)合體的研究，冷凍電鏡技術(shù)扮演著十分重要的角色（圖2）。2020年，Mazor團(tuán)隊(duì)結(jié)合冷凍電鏡技術(shù)和光譜學(xué)方法在集胞藻PCC 6803中解析了嵌合的PSI復(fù)合物結(jié)構(gòu)［62］，該結(jié)構(gòu)具有高度保守的核心天線，由11個(gè)亞基和90多個(gè)葉綠素組成。它在紅色光譜區(qū)域顯示出增強(qiáng)的吸收值，這主要得益于捕獲紅光的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，同時(shí)也可對(duì)光收集效率進(jìn)行調(diào)節(jié)。該研究確定了光系統(tǒng)I復(fù)合物結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以此揭示了能量傳遞途經(jīng)的多樣性。

圖2 光系統(tǒng)I的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)Fig. 2 cryo-EM structure of photosystem I

在真核藻類(lèi)和高等植物中，PSI被LHCI蛋白包圍，進(jìn)而形成PSI-LHCI超復(fù)合體，其主要功能是將電子從質(zhì)體藍(lán)素傳遞至鐵氧還蛋白，并將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。沈建仁及隋森芳兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)于2018年合作解析了紅藻PSI-LHCI超復(fù)合體近原子分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［63］，分辨率達(dá)3.63-3.82?。該項(xiàng)研究得到的結(jié)構(gòu)存在兩種不同的形式，一種與高等植物相似，PSI同3個(gè)Lhcr亞基相連；另一種PSI與兩個(gè)Lhcr亞基相連。此外，紅藻類(lèi)的PSI核心還顯示出類(lèi)似于藍(lán)藻和高等植物PSI的特征，表明從原核生物向真核生物的進(jìn)化過(guò)程中存在某種中間類(lèi)型。該研究成果揭示了紅藻區(qū)別于高等植物PSI-LHCI的獨(dú)特電子傳遞途徑，為研究其對(duì)多變環(huán)境的適應(yīng)能力以及在低等植物向高等植物進(jìn)化過(guò)程中PSI-LHCI的結(jié)構(gòu)變化提供了新思路。2019年，Minagawa團(tuán)隊(duì)通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)解得萊茵衣藻的PSI-LHCI復(fù)合體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［64］，該復(fù)合體包含9個(gè)LHCI。該研究同時(shí)證明相比于陸地植物，萊茵衣藻的 PSI 具有更大、更明顯的外周天線組織和更高的光捕獲能力。同年，李梅團(tuán)隊(duì)聯(lián)合章新政團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡技術(shù)將萊茵衣藻的PSI-LHCI復(fù)合體結(jié)構(gòu)的分辨率提高至近原子分辨率［65］，相比于Minagawa團(tuán)隊(duì)取得的結(jié)果，該結(jié)構(gòu)同時(shí)揭示了兩種不同排列方式的LHCI，一種包含8個(gè)與PSI核心相關(guān)的LHCI，另一種則包含10個(gè)與PSI核心相關(guān)的LHCI，為超復(fù)合物中天線組織和色素排列提供了更加詳細(xì)的信息。觸角中高度密集且緊密排列的葉綠素闡明了CrPSI-LHCI中光收集和激發(fā)能轉(zhuǎn)移的高效率，并為理解CrPSI-LHCI中光收集和能量轉(zhuǎn)移的高效率提供了新見(jiàn)解。2020年，Nelson團(tuán)隊(duì)綜合使用X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡技術(shù)從耐鹽綠藻杜氏鹽藻中確定了PSI-LHCI的結(jié)構(gòu)［66］。該結(jié)構(gòu)揭示了一種新的PSI內(nèi)核配置，它僅由7個(gè)亞基組成，形成已知最小的PSI，而植物和萊茵衣藻中則為14-16個(gè)亞基。該研究為揭示PSI的組織及物種進(jìn)化保守性提供了重要信息。

除PSI-LHCI復(fù)合體外，Akita團(tuán)隊(duì)解析了硅藻光系統(tǒng) I-葉綠素a/c蛋白 I（fucoxanthin chlorophyll a/c protein I，F(xiàn)CPI）超復(fù)合物的 2.4? 冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［67］。該結(jié)構(gòu)為硅藻PSI-FCPI的采光策略以及放氧光合生物光收集的進(jìn)化動(dòng)力學(xué)提供了新的見(jiàn)解。超級(jí)復(fù)合體由16個(gè)不同的FCPI亞基圍繞單體PSI核心組成，每個(gè)FCPI亞基具有不同的色素含量和結(jié)合位點(diǎn)，因而呈現(xiàn)不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，它們與PSI核心一起形成復(fù)雜的色素-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，以有效地收集和轉(zhuǎn)移光能。此外，研究者還在PSI核心中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)獨(dú)特的亞基。該結(jié)構(gòu)不僅為硅藻PSI-FCPI中的光捕獲策略提供了新見(jiàn)解，同時(shí)也為放氧光合生物中光收集器的進(jìn)化動(dòng)力學(xué)提供了新的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

在PSI-LHCI復(fù)合體的結(jié)構(gòu)研究基礎(chǔ)上，人們利用冷凍電鏡技術(shù)對(duì)更為復(fù)雜的超級(jí)復(fù)合體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。2018年，李梅團(tuán)隊(duì)聯(lián)合章新政團(tuán)隊(duì)報(bào)道了玉米來(lái)源的光系統(tǒng) I-捕光復(fù)合體 I-捕光復(fù)合體 II超級(jí)復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［68］，揭示了LHCII和PSI之間的識(shí)別位點(diǎn)。該結(jié)構(gòu)的LHCII和PSI核心內(nèi)的葉綠素網(wǎng)絡(luò)與此前的光譜結(jié)果一致，印證了LHCII三聚體作為高效光收集器的作用。同時(shí)每個(gè)亞基通過(guò)一對(duì)葉綠素分子將能量傳遞到PSI核心，進(jìn)而揭示了PSI核心與捕光天線之間能量轉(zhuǎn)移的路徑。該研究彌補(bǔ)了過(guò)去通過(guò)X-射線晶體學(xué)方法獲得的PSI結(jié)構(gòu)信息的缺失，為進(jìn)一步探索植物電子傳遞和能量轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，在揭示高等植物對(duì)自然界多變光照環(huán)境適應(yīng)性機(jī)理的同時(shí)，也為PSI和PSII的捕光機(jī)制及能量調(diào)節(jié)提供了新的理論依據(jù)。

2021年，中科院植物所和浙江大學(xué)合作利用冷凍電鏡技術(shù)解析了大麥葉綠體PSI-NDH超分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)［69］，這是首次解析獲得的高等植物PSI-NDH復(fù)合體高分辨結(jié)構(gòu)。該復(fù)合體由2個(gè)PSI-LHCI、1個(gè)NDH及一個(gè)未知蛋白（unidentified stromal protein，USP）組成，共包含55個(gè)蛋白亞基、298個(gè)葉綠素分子、67個(gè)類(lèi)胡蘿卜素分子和25個(gè)脂分子，總分子量達(dá)1.6 MD，是目前解析得到的最大的光合作用相關(guān)蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)。該研究揭示了NDH亞基特有的10個(gè)高等植物葉綠體的精確位置及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，首次闡明高等植物PSI-LHCI-NDH相互作用及組裝的機(jī)理，在填補(bǔ)高等植物NDH結(jié)構(gòu)信息的同時(shí)，也為高等植物PSI-NDH介導(dǎo)光合環(huán)式電子傳遞的功能及調(diào)控提供了新的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

此外，冷凍電鏡技術(shù)也被用于更加復(fù)雜的PSI：質(zhì)體藍(lán)蛋白（plastocyanin，PC）-鐵氧還蛋白（ferredoxin，F(xiàn)d）的復(fù)合結(jié)構(gòu)解析［70］。該復(fù)合體中含19個(gè)亞基與Fd結(jié)合，其中包含3個(gè)β-胡蘿卜素和15個(gè)脂質(zhì)分子，各組分在高光脅迫下的環(huán)式電子流中發(fā)揮不同的作用。結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步揭示了OPS亞基在藍(lán)藻暴露于強(qiáng)光脅迫期間的調(diào)節(jié)作用。這一結(jié)構(gòu)闡明了從Fd到NDH的電子轉(zhuǎn)移鏈結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時(shí)揭示了復(fù)合體內(nèi)所有的接觸部位及相互作用的電子載體和PSI之間的相互作用方式。

2.2 冷凍電鏡在光系統(tǒng)II結(jié)構(gòu)與功能研究中的應(yīng)用

PSII反應(yīng)中心、捕光復(fù)合體 II（light harvesting complex II，LHCII）和放氧復(fù)合體（oxygen-evolving complex，OEC）等亞單位共同組成了PSII超復(fù)合體。其主要功能是利用光能將水氧化并還原質(zhì)體醌。目前，冷凍電鏡技術(shù)在PSII復(fù)合體的研究也已得到廣泛的應(yīng)用（圖3）。2016年，柳振峰、章新政、常文瑞/李梅團(tuán)隊(duì)合作利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)成功解析了菠菜PSII-LHCII超級(jí)復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)［71］。該復(fù)合體總分子量約1 100 kD，分辨率為3.4?。PSIILHCII超復(fù)合體是一個(gè)同源二聚體的超分子體系，其中每個(gè)單體都含有25個(gè)蛋白亞基、105個(gè)葉綠素分子、28個(gè)類(lèi)胡蘿卜素分子和眾多的其它輔因子。該項(xiàng)工作解析了蛋白亞基CP29的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)及CP26的結(jié)構(gòu)，揭示了不同外周捕光復(fù)合物與核心復(fù)合物間的裝配方式，彼此之間的相互作用位點(diǎn)，和各亞基間的排布規(guī)律，對(duì)于深入了解PSII-LHCII超級(jí)復(fù)合物中的能量傳遞具有重大意義。2017年，該團(tuán)隊(duì)又解析豌豆C2S2M2型PSII-LHCII超級(jí)復(fù)合體2.7-3.2?冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［72］，總分子量達(dá)到1 400 kD。與菠菜的PSII-LHCII超級(jí)復(fù)合體結(jié)構(gòu)相類(lèi)似，該超級(jí)復(fù)合體也是同源二聚體。不同于菠菜PSII-LHCII復(fù)合物，該復(fù)合體的每個(gè)單體中所包含的蛋白亞基、葉綠素分子及類(lèi)胡蘿卜素分子均多于菠菜的PSIILHCII復(fù)合物。該項(xiàng)研究還解析了蛋白亞基CP24與M-LHCII的結(jié)構(gòu)，通過(guò)比較兩種不同狀態(tài)的C2S2M2結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)CP24與M-LHCII結(jié)合的位點(diǎn)不是保守的，說(shuō)明高等植物PSII復(fù)合物能夠及時(shí)感受環(huán)境變化并做出響應(yīng)。該項(xiàng)研究對(duì)進(jìn)一步理解高等植物PSII復(fù)合物中的電子傳遞及能量轉(zhuǎn)化，揭示高等植物在土壤、水體等弱光條件下實(shí)現(xiàn)高效捕光分子機(jī)理具有重要意義。此外，Boekema團(tuán)隊(duì)及其合作者使用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)以5.3 ?的總分辨率解析得到了擬南芥C2S2M2超復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)［73］，除PsbJ和PsbY以及LHCII三聚體和次要天線復(fù)合物以外，該結(jié)構(gòu)包含了在不同PSII復(fù)合物中均保守的膜結(jié)合核心亞基，解析了所有葉綠素在亞基中的位置，揭示了這些葉綠素在介導(dǎo)能量從外圍觸角到核心流動(dòng)中的作用。

圖3 光系統(tǒng)II的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)Fig.3 Cryo-EM structure of photosystem II

除高等植物外，冷凍電鏡技術(shù)又迅速被應(yīng)用于低等植物的PSII復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析。沈建仁、匡廷云研究組聯(lián)合隋森芳團(tuán)隊(duì)解析了中心綱硅藻PSIIFCPII超級(jí)復(fù)合體3.0 ?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［74］。該結(jié)構(gòu)顯示PSII-FCPII超級(jí)復(fù)合體為二聚體，每個(gè)單體包含24個(gè)PSII亞基和11個(gè)FCPII亞基，同時(shí)還有200多個(gè)色素分子以及大量的脂質(zhì)分子，共70個(gè)蛋白亞基，分子量高達(dá)1.4 MD。該P(yáng)SII與藍(lán)藻和高等植物的PSII結(jié)構(gòu)相似，但區(qū)別于二者，硅藻的PSII在放氧中心存在5個(gè)外周蛋白以及兩個(gè)與PSII和FCPII相連接的跨膜蛋白。此外，硅藻PSIIFCPII復(fù)合體的組裝形式也顯著不同，F(xiàn)CPII主要由兩個(gè)四聚體組成，分別與PSII核心存在兩種結(jié)合形式，緊密結(jié)合與松散結(jié)合。而硅藻FCP四聚體兩種結(jié)合方式的位置與高等植物L(fēng)HCII三聚體的緊密結(jié)合及松散結(jié)合的位置剛好相反。該復(fù)合體構(gòu)建了硅藻PSII-FCPII復(fù)雜的蛋白和色素網(wǎng)絡(luò)，揭示了復(fù)合體中各個(gè)亞基的相互作用方式及硅藻PSII中獨(dú)特的捕光天線組裝排布，為研究硅藻PSII對(duì)光能高效吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同年，柳振峰團(tuán)隊(duì)與合作者也解析了衣藻來(lái)源的C2S2和C2S2M2L2型復(fù)合物的近原子分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［75］，發(fā)現(xiàn)了衣藻C2S2型復(fù)合物中的強(qiáng)結(jié)合型LHCII三聚體結(jié)構(gòu)的亞基組成。C2S2M2L2復(fù)合物與C2S2復(fù)合物的裝配方式十分相似，但前者更為復(fù)雜。相對(duì)于C2S2復(fù)合物，C2S2M2L2復(fù)合物的兩側(cè)分別結(jié)合了一對(duì)M-LHCII三聚體和一對(duì)LHCII三聚體。C2S2M2L2復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)還揭示了L-LHCII與CP29、L-LHCII與M-LHCII彼此之間的相互作用方式與裝配機(jī)制。該些研究結(jié)果對(duì)理解藻類(lèi)植物在水體及土壤等弱光環(huán)境下高效捕獲光能的分子機(jī)理提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2.3 冷凍電鏡在光合電子傳遞鏈結(jié)構(gòu)與功能研究中的應(yīng)用

除兩類(lèi)光系統(tǒng)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能研究外，冷凍電鏡技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于其他光合作用組分的結(jié)構(gòu)及功能研究之中，并取得了突破性的結(jié)果。在整個(gè)電子傳遞的過(guò)程中，細(xì)胞色素b6f（cytochrome b6f，Cyt b6f）復(fù)合體也扮演著十分重要的角色。它是一個(gè)帶有幾個(gè)輔基的多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合體，主要生理功能是將光系統(tǒng) I與光系統(tǒng) II聯(lián)系起來(lái)，將還原態(tài)質(zhì)子醌中的電子傳遞給質(zhì)體藍(lán)素（plastocyanin，PC），同時(shí)將H+釋放到類(lèi)囊體的腔。2019年，Johnson團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析得到高等植物菠菜細(xì)胞色素b6f復(fù)合體3.6?高分辨率結(jié)構(gòu)（圖4）［76］，該復(fù)合物包含多達(dá)3個(gè)天然結(jié)合的質(zhì)體醌（plastoquinone，PQ）分子。第一個(gè)PQ1位于PQ氧化位點(diǎn)（Qp）附近的一個(gè)cytb6f單體中，與血紅素bp和葉綠素a相鄰。PQ2跨越單體間的空腔，部分阻礙PQ1側(cè)的PQ還原位點(diǎn)（Qn），并使電子轉(zhuǎn)移網(wǎng)絡(luò)在相鄰單體中占據(jù)的Qn位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換。第3個(gè)PQ分子的位置與Q循環(huán)期間相反單體中Qp和Qn位點(diǎn)之間的轉(zhuǎn)變一致。因此，該結(jié)構(gòu)成功揭示了Q循環(huán)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其氧化還原功能的分子機(jī)理，指出菠菜細(xì)胞色素b6f復(fù)合體與質(zhì)體醌的結(jié)合位點(diǎn)，為了解該復(fù)合物如何在光合作用中發(fā)揮催化和調(diào)節(jié)作用提供了新的見(jiàn)解。并為葉綠素吸收并轉(zhuǎn)化光能的機(jī)制及Q循環(huán)期間各位點(diǎn)之間進(jìn)行PQ交換時(shí)所涉及的構(gòu)象變化等問(wèn)題提供了精確的解答。

圖4 菠菜細(xì)胞色素b6f復(fù)合體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)Fig. 4 cryo-EM structure of spinach cytochrome b6f complex

環(huán)式電子流是由PSI參與的一種重要光保護(hù)機(jī)制，光合作用生物可通過(guò)該機(jī)制調(diào)節(jié)有效光合作用所需的ATP和NADPH水平。脫氫酶復(fù)合物：NDH在大多數(shù)放氧光合生物中均是關(guān)鍵組成部分，將源自PSI的NADPH氧化為NADP+，同時(shí)還原質(zhì)體醌，泵送質(zhì)子穿過(guò)質(zhì)體膜，建立質(zhì)體膜兩側(cè)的質(zhì)子濃度梯度，該質(zhì)子濃度梯度被ATP合成酶用來(lái)合成ATP。2019年，Davies團(tuán)隊(duì)成功解析了嗜熱藍(lán)藻的NDH復(fù)合物3.1?的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［77］，揭示了主要OPS亞基在NDH復(fù)合物中的結(jié)構(gòu)與排列信息，并觀察到外周臂中靠近質(zhì)體醌結(jié)合位點(diǎn)的外輔因子，同時(shí)也從結(jié)構(gòu)上推測(cè)了NDH可能具有的幾種電子傳遞途徑，解釋了NDH如何最大限度避免半質(zhì)體醌自由基的產(chǎn)生?？茖W(xué)界普遍認(rèn)為藍(lán)藻并非植物，但其卻可以進(jìn)行光合作用并產(chǎn)生氧氣，該結(jié)構(gòu)的成功解析為整個(gè)光合作用的電子傳遞途徑和機(jī)理提供了新的見(jiàn)解，同時(shí)也為光合作用系統(tǒng)各關(guān)鍵組分彼此之間的相互作用提供了新的認(rèn)知。

光合作用是地球上所有生物賴以生存的基礎(chǔ)。在各種能夠進(jìn)行光合作用的植物中，藻類(lèi)植物可為全球的光合作用貢獻(xiàn)近半數(shù)的力量。藻膽體由藻膽蛋白和接頭蛋白組成，是藻類(lèi)植物中的主要捕光復(fù)合物，有著接近100%的光能捕獲效率。藻膽體作為部分低等植物重要的捕光天線系統(tǒng)，能將捕獲的光能傳遞至光合機(jī)器核心，其組裝方式以及高效的能量傳遞機(jī)制一直是光合作用研究領(lǐng)域的關(guān)鍵問(wèn)題。2017年底，隋森芳團(tuán)隊(duì)報(bào)道了太平洋凋毛藻（G.pacifica）藻膽體的3.5 ?分辨率的冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)［78］，這是第一個(gè)完整藻膽體的近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)。該復(fù)合體包含862個(gè)蛋白亞基，分子量約16.8 MD。該項(xiàng)工作也是首次獲得該復(fù)合體在功能組裝狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，同時(shí)首次確定了藻膽體中全部2 048個(gè)色素的整體排布，揭示了接頭蛋白如何影響生色團(tuán)的微環(huán)境，并闡明了藻膽蛋白與連接蛋白組裝的分子機(jī)制，為高效的能量傳遞途經(jīng)提供了堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2020年，該團(tuán)隊(duì)又成功解析了鹽澤紅藻紫球藻（P. purpureum）藻膽體的冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)［79］，并將分辨率提高到了2.8 ?。將兩次結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，鹽澤紅藻藻膽體僅含有706個(gè)蛋白亞基，包含1 598個(gè)色素分子，比海洋紅藻藻膽體的整體尺寸小。對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)色素分子與周?chē)B接蛋白上的芳香族氨基酸相互作用，從而改變色素分子的能量狀態(tài)，以保證高效的能量傳遞。2021年，隋森芳團(tuán)隊(duì)聯(lián)合李雪明團(tuán)隊(duì)，應(yīng)用冷凍聚焦離子束減薄技術(shù)（cryo-FIB milling）和冷凍電子斷層技術(shù)（cryo-ET）解析紅藻細(xì)胞內(nèi)藻膽體-光系統(tǒng)復(fù)合物 II原位結(jié)構(gòu)，獲得了離體研究無(wú)法獲得的新的結(jié)構(gòu)信息（圖5）［80］。原位結(jié)構(gòu)給予了更加豐富的生物學(xué)信息，該研究發(fā)現(xiàn)紅藻細(xì)胞內(nèi)的藻膽體在類(lèi)囊體膜上以齒狀交互的方式規(guī)則排布。同時(shí)，相比于高分辨率單顆粒結(jié)構(gòu)及PSII晶體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞原位藻膽體-PSII超復(fù)合物還存在3個(gè)未知的蛋白密度介導(dǎo)藻膽體的不同亞基與PSII相互連接。細(xì)胞水平的藻膽體與PSII存在多個(gè)相互作用界面以保證高效的能量傳遞過(guò)程。紅藻細(xì)胞內(nèi)部分區(qū)域的相鄰類(lèi)囊體膜之間相連接形成“樓梯狀”的接孔，從而實(shí)現(xiàn)膜間信息交換與能量傳遞，為類(lèi)囊體膜系統(tǒng)形成高度連接的膜網(wǎng)絡(luò)奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖5 藻膽體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［80］Fig. 5 cryo-EM structure of phycobilisome［80］

總之，冷凍電鏡技術(shù)逐漸成為了研究光合作用相關(guān)生物大分子的重要手段，它成功解析了光系統(tǒng)II、細(xì)胞色素b6f及ATP合酶等光合作用中重要結(jié)構(gòu)，使得我們對(duì)于光合作用機(jī)制的深入了解成為可能。同時(shí)也為深入了解光能捕獲機(jī)制、高效的電子傳遞能力以及能量轉(zhuǎn)化的機(jī)理提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)（圖6）。

圖6 冷凍電鏡技術(shù)在植物光合作用研究領(lǐng)域的應(yīng)用Fig. 6 Application of cryo-EM in the field of plant photosynthesis research

3 冷凍電鏡在植物感知與應(yīng)答環(huán)境脅迫分子機(jī)制研究方面的應(yīng)用

植物的生長(zhǎng)暴露于持續(xù)變化的自然環(huán)境，經(jīng)常需要抵御各種不利于植物生長(zhǎng)和發(fā)育的生存脅迫。這些生存脅迫包括生物脅迫（如病原體感染和食草動(dòng)物的啃食損傷）和非生物脅迫（主要包括干旱、高溫、鹽害、營(yíng)養(yǎng)匱乏等）。不同的環(huán)境脅迫會(huì)導(dǎo)致植物在基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生理性狀方面的特異性反應(yīng)［81］。近年來(lái)，隨著基因組學(xué)、生物信息學(xué)、遺傳學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等技術(shù)方法的應(yīng)用，人們對(duì)植物感知脅迫信號(hào)并進(jìn)行抵御的分子機(jī)制理解不斷加深，其中冷凍電鏡技術(shù)為研究植物感知與應(yīng)答環(huán)境脅迫相關(guān)生物大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)功能研究方面發(fā)揮了重要作用。

3.1 冷凍電鏡在植物感知與應(yīng)答生物脅迫分子機(jī)制研究中的應(yīng)用

自然環(huán)境中，為了抵御細(xì)菌、真菌、病毒等病原體脅迫因子，植物進(jìn)化出一套以細(xì)胞為單位的雙重免疫防線：（1）通過(guò)細(xì)胞膜上錨定的模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）識(shí)別病原微生物分泌的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）來(lái)激活植物免疫反應(yīng)，稱(chēng)為病原體相關(guān)模式分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMPstriggered immunity，PTI）， 包 括 活 性 氧 ROS 的 劇增、Ca2+大量?jī)?nèi)流、防御基因表達(dá)上調(diào)和氣孔關(guān)閉等［82-83］；另外，植物損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也隸屬第一道免疫防線；（2）通過(guò)細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合和富亮氨酸重復(fù)受體（nucleotide-binding and leucine-rich repeat receptors，NLR）直接或間接地感受病原菌分泌的特異性效應(yīng)因子（virulence protein effector），所激發(fā)的植物免疫反應(yīng)，被稱(chēng)為病原體效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity，ETI）［84-85］。PTI是植物基礎(chǔ)抗性的重要組成部分，該抗性具有廣譜性，但抗性較弱。ETI通常具有物種特異性，形式上更進(jìn)化，能夠更有效抵抗病原菌［86-88］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，植物的ETI免疫防線依賴于PTI防線，同時(shí)激活的ETI免疫反應(yīng)還可以增強(qiáng)PTI免疫防線［89-92］。因此，植物利用相互依賴的兩道免疫防線協(xié)同激活植物的防衛(wèi)反應(yīng)，以抵抗病原菌的入侵。

細(xì)胞膜上錨定的模式識(shí)別受體PRR家族可分為受體樣激酶（receptor like kinase，RLK）和受體樣蛋白（receptor like protein，RLP）。RLK-PRRs包含負(fù)責(zé)識(shí)別配體的胞外區(qū)（extracellular domain，ECD）、負(fù)責(zé)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)和膜錨定的跨膜區(qū)（transmembrane domain，TM）和負(fù)責(zé)下游信號(hào)傳導(dǎo)的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，而RLP-PRRs可能不包含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域［93］。

到目前為止，研究較為充分的幾類(lèi)PRRs基本都有原子分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，包括FLS2、PEPR1、AtCERK1、CEBiP等［93］。FLS2和 PEPR1屬 于 典型的LRR-RLKs受體，兩者分別識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白flg22和植物誘導(dǎo)肽Pep1，分別啟動(dòng)LRR-RLK/PAMP和LRR-RLK/DAMP模式，通過(guò)下游信號(hào)通路觸發(fā)PTI免疫反應(yīng)［93-94］；來(lái)自于擬南芥的AtCERK1和來(lái)自于水稻的OsCEBiP均屬于典型的LysM-PRRs，識(shí)別真菌幾丁質(zhì)和細(xì)菌肽聚糖后被激活，通過(guò)下游信號(hào)分子與MAPK級(jí)聯(lián)連接，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種免疫反應(yīng)［95-96］。

為了達(dá)到侵襲感染植物細(xì)胞的目的，病原體進(jìn)化出可以干擾或抑制PTI信號(hào)傳導(dǎo)的效應(yīng)因子，從而繞過(guò)第一道防線，侵襲植物細(xì)胞。相應(yīng)的，植物為了抵御這種侵襲，進(jìn)一步進(jìn)化出細(xì)胞內(nèi)免疫受體NLR，通過(guò)識(shí)別病原體效應(yīng)分子或其活動(dòng)，誘導(dǎo)病原體效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)ETI。植物細(xì)胞內(nèi)免疫受體NLRs通常包含N端特定結(jié)構(gòu)域、中部保守的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide-binding site，NBS）結(jié)構(gòu)域和C端高度可變的富含亮氨酸的重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）結(jié)構(gòu)域。特定N端結(jié)構(gòu)域?yàn)?TIR（toll/interleukin-1 receptor）、CC（coiled-coil）或 RPW8（resistance to powdery mildew 8）結(jié)構(gòu)域，相應(yīng)的NLR受體形成相應(yīng)的亞家族TNLs，CNLs和RNLs［83］。

NLR作為ETI免疫防線的主要組成，可通過(guò)“直接識(shí)別”、“間接識(shí)別”或者“NLR IDs”［97］多種方式識(shí)別病原體分泌的效應(yīng)因子，觸發(fā)細(xì)胞超敏反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，從而將病原體感染限制在侵染部位。在動(dòng)物中，NLR在結(jié)合其效應(yīng)子后寡聚化是下游活動(dòng)的關(guān)鍵，但植物系統(tǒng)在許多方面有所不同，其激活機(jī)制不太清楚［98］。在過(guò)去的20年中，人們努力了解植物NLRs的作用機(jī)制，而冷凍電鏡在其中發(fā)揮了重要作用。

2019年，柴繼杰、周儉民和王宏偉研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)使用冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)并使用Volta相位板合作解析了首個(gè)植物NLR蛋白ZAR1的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)［99］。結(jié)構(gòu)信息表明：分子內(nèi)相互作用和ADP結(jié)合導(dǎo)致了ZAR1蛋白的自抑制狀態(tài)；來(lái)自病原體的效應(yīng)蛋白AvrAC尿苷化免疫信號(hào)通路關(guān)鍵分子BIK1阻斷PTI免疫信號(hào)通路的同時(shí)，也導(dǎo)致植物分泌的誘餌分子PBL2的尿苷化，即PBL2UMP，進(jìn)而會(huì)被預(yù)先形成的復(fù)合體ZAR1-RKS1識(shí)別并結(jié)合，導(dǎo)致ZAR1NBD構(gòu)象發(fā)生變化，ADP脫落，ZAR1活化進(jìn)入中間狀態(tài)，形成ZAR1-RKS1-PBL2UMP單體復(fù)合物（圖7）。該研究為ZAR1蛋白自抑制狀態(tài)的維持機(jī)制、ZAR1與RKS1的相互作用、ZAR1通過(guò)ZAR1-RKS1間接識(shí)別PBL2UMP的機(jī)制，以及PBL2UMP誘導(dǎo)ZAR1活化的機(jī)制提供了詳盡的理論基礎(chǔ)。同時(shí)，該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步使用冷凍電鏡方法揭示了處于中間狀態(tài)的單體ZAR1-RKS1-PBL2UMP復(fù)合物寡聚化形成抗病小體機(jī)制和激活機(jī)制［100］（圖7），并結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)和單分子成像進(jìn)一步揭示了其生物學(xué)功能［101］。這一系列研究揭示了植物NLR寡聚化形成抗病小體發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子機(jī)制，同時(shí)也比較了NLR抗病小體與NLRC4炎性小體或Apaf-1凋亡小體的結(jié)構(gòu)差異，以及因此所導(dǎo)致的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的不同。

圖7 植物NLR蛋白ZAR1由靜息狀態(tài)進(jìn)入激活狀態(tài)并寡聚化形成抗病小體的構(gòu)象變化Fig. 7 Conformational changes of plant NLR protein ZAR1 from inactive state to active state and then oligomerized to form resistsome

2021年5月，繼首個(gè)CNL類(lèi)NLR受體ZAR1全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)得到解析后，兩種TNL-NLR受體復(fù)合物及相應(yīng)抗病小體結(jié)構(gòu)首次通過(guò)冷凍電鏡被解析。柴繼杰研究組及其合作者報(bào)告了TNL類(lèi)抗病蛋白R(shí)PP1直接識(shí)別其效應(yīng)蛋白ATR1后激活并形成全酶的分子機(jī)制，區(qū)別于ZAR1-RKS1通過(guò)結(jié)合PBL2UMP而間接識(shí)別效應(yīng)蛋白的作用機(jī)制。該研究通過(guò)冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)成功解析了RPP1-ATR1四聚體復(fù)合物激活狀態(tài)的3.2 ?分辨率的結(jié)構(gòu)［102］。結(jié)構(gòu)分析揭示了LRR結(jié)構(gòu)域和新發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域C-JID對(duì)效應(yīng)蛋白ATR1的識(shí)別，揭示了RPP1抗病小體的形成并作為全酶催化NAD+水解活性的機(jī)制（圖8）。生化和功能數(shù)據(jù)表明C-JID結(jié)構(gòu)域在TNL類(lèi)NLR受體中廣泛存在，作為特異性識(shí)別ATR1的主要決定因素，可能對(duì)TNL識(shí)別配體具有廣譜作用。與ATP作為CNL類(lèi)NLR受體ZAR1激活并寡聚化不同的是，RPP1中相應(yīng)基序的突變導(dǎo)致結(jié)合在NOD結(jié)構(gòu)域的是ADP，而非dATP/ATP。該研究促進(jìn)了TNL下游免疫通路信號(hào)傳遞機(jī)制的研究，為理解植物TNL類(lèi)抗病蛋白活化機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

同時(shí)，Nogales和Staskawicz研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了病原體底物結(jié)合的免疫受體復(fù)合物ROQ1-XopQ的3.8?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，揭示了以ROQ1作為范式的TNLs的直接識(shí)別、寡聚和TIR結(jié)構(gòu)域激活機(jī)制［103］（圖 8）。該研究進(jìn)一步佐證了 TNL-NLRs與病原體的直接識(shí)別作用機(jī)制：ROQ1的LRR和C-JID通過(guò)直接識(shí)別病原體效應(yīng)器XopQ，通過(guò)與底物的結(jié)合進(jìn)而解除TNLs的自抑制狀態(tài)，允許NB-ARC結(jié)構(gòu)域過(guò)渡到與ATP結(jié)合、準(zhǔn)備寡聚化形成抗病小體。ROQ1-XopQ的寡聚化組裝使TIR結(jié)構(gòu)域緊密接觸，導(dǎo)致TIR結(jié)構(gòu)域?qū)AD+的切割，釋放二磷酸腺苷核糖（一種觸發(fā)胞漿Ca2+內(nèi)流的信號(hào)分子），進(jìn)而導(dǎo)致抗病性的下游信號(hào)通路激活和局部細(xì)胞死亡。

圖8 RPP1-ATR1與ROQ1-XopQ分別寡聚化組裝形成抗病小體［103］Fig. 8 Resistosomes oligomerized respectively from RPP1-ATR1 and ROQ1-XopQ

作為植物兩大類(lèi)NLR受體CNLs和TNLs的代表，ZAR1與RPP1和XopQ的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析結(jié)果是植物抗病蛋白研究領(lǐng)域數(shù)十年來(lái)一直期待的重大突破?？共〉鞍自谥参锩庖呦到y(tǒng)中扮演著核心角色，因此關(guān)于其生化活性及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一直是植物免疫領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，但無(wú)論是PRR受體，還是NLR受體，其結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展并不顯著，尚未深入開(kāi)展結(jié)構(gòu)研究的PRR受體家族除了數(shù)量最多的LRR-RLK受體以外，還包括表皮生長(zhǎng)因子樣受體（EGF-like-PRRs）WAK［104］和凝集素結(jié)構(gòu)域型受體（EGF-like-PRRs）DORN1等［105-106］。病原物分泌的效應(yīng)子被寄主細(xì)胞識(shí)別后如何誘導(dǎo)了NLR受體的N端結(jié)構(gòu)域自我寡聚；效應(yīng)子與抗病蛋白之間的相互作用是否存在中間傳遞分子，以及其如何參與抗病蛋白的構(gòu)象變化和激活？冷凍電鏡技術(shù)將在這些問(wèn)題的回答中發(fā)揮重要作用。

3.2 冷凍電鏡在植物感知與應(yīng)答非生物脅迫分子機(jī)制研究中的應(yīng)用

非生物脅迫和病原菌侵染是影響作物產(chǎn)量和導(dǎo)致巨大損失的兩大主要原因。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，除了會(huì)受到病原體感染侵害之外，經(jīng)常會(huì)受到諸如高鹽、低溫、高溫、干旱和水澇等非生物脅迫的影響，造成作物生長(zhǎng)不良，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至死亡。為應(yīng)對(duì)各種逆境脅迫，植物已經(jīng)進(jìn)化出各種機(jī)制來(lái)感受外界環(huán)境，并通過(guò)基因表達(dá)調(diào)節(jié)形態(tài)、生理狀態(tài)的方式來(lái)對(duì)不同的脅迫作出適應(yīng)性響應(yīng)［81，107-108］。

研究人員一直致力于植物體脅迫感受器的鑒定和研究，以期解決植物是如何感知和響應(yīng)非生物脅迫，進(jìn)而改善植物抗逆性，提升作物產(chǎn)量和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)性。高滲脅迫是植物在干旱環(huán)境中面臨的主要生存壓力，植物細(xì)胞會(huì)通過(guò)一系列生理過(guò)程對(duì)該脅迫信號(hào)做出應(yīng)答。滲透脅迫可能通過(guò)激活某些Ca2+滲透通道快速增加胞質(zhì)Ca2+濃度。這些通道的激活可能是由細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架的滲透應(yīng)力產(chǎn)生的機(jī)械力所引起。2014年，研究人員發(fā)現(xiàn)擬南芥的一種質(zhì)膜蛋白OSCA1會(huì)形成高滲門(mén)控Ca2+通道，并認(rèn)為OSCA1是植物細(xì)胞對(duì)高滲信號(hào)的感受器［109］。另外，植物細(xì)胞利用機(jī)械門(mén)控的小電導(dǎo)離子通道MscS緩解滲透壓，參與線粒體內(nèi)膜電位的調(diào)節(jié)和非生物脅迫下氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持［110-111］。

2018年，高滲門(mén)控Ca2+通道OSCA1蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)被多個(gè)研究小組使用冷凍電鏡方法相繼解析。陳雷、宋晨和閆志強(qiáng)研究組通過(guò)冷凍電鏡方法率先解析了機(jī)械力敏感的非選擇性離子通道 AtOSCA1.1的二聚體結(jié)構(gòu)（3.5 ?）［112］，揭示了OSCA通道的組裝模式，并通過(guò)突變體的電生理研究及分子動(dòng)力學(xué)模擬，推測(cè)了該通道基于膜傳遞機(jī)械力激活的分子機(jī)制和孔道位置（圖9）。該研究通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)闡明了其功能和二聚體構(gòu)象，鑒定了二聚體界面形成的關(guān)鍵殘基。此外，研究團(tuán)隊(duì)還解析了4.8?分辨率的AtOSCA3.1的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。AtOSCA3.1與AtOSCA1.1在整體架構(gòu)和構(gòu)象上的相似性進(jìn)一步說(shuō)明了該蛋白質(zhì)家族的結(jié)構(gòu)保守性?；谒玫慕Y(jié)構(gòu)特征，研究人員推測(cè)滲透脅迫在脂質(zhì)雙層中產(chǎn)生張力會(huì)導(dǎo)致構(gòu)象變化進(jìn)而激活OSCA通道以允許Ca2+進(jìn)入，從而對(duì)高滲脅迫信號(hào)產(chǎn)生一系列應(yīng)答。

圖9 OSCA1蛋白的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及其激活構(gòu)象Fig. 9 cryo-EM structure and activated conformation of OSCA1

同時(shí)，Jojoa-Cruz等［113］解析了擬南芥OSCA1.2通道蛋白的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（圖10，綠色），同一團(tuán)隊(duì)的Murthy等［114］對(duì)OSCA通道蛋白的生物物理特性進(jìn)行更深入的分析，電生理實(shí)驗(yàn)的亞電導(dǎo)狀態(tài)結(jié)果進(jìn)一步印證了上述研究所解析的OSCA通道蛋白的二聚體結(jié)構(gòu)。與此同時(shí)，孫林峰研究組及其合作者也運(yùn)用單顆粒冷凍電鏡方法對(duì)擬南芥OSCA1.2通道蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，最終獲得了3.7?的分辨率（圖10，紫色）。與其他研究組結(jié)果相比，雖然通道蛋白總體結(jié)構(gòu)非常相似，但在胞質(zhì)螺旋部分及其錨定區(qū)域存在一定差異［115］，暗示不同的胞質(zhì)螺旋結(jié)構(gòu)域可能部分導(dǎo)致了通道蛋白不同的生物物理特性。2019年，Maity等［116］報(bào)道了來(lái)自水稻的OSCA1.2通道蛋白的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，與擬南芥OSCA1.2相比，水稻OSCA1.2位于胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的延伸螺旋臂具有明顯的差異，結(jié)合生物化學(xué)、生物物理和計(jì)算研究，該研究提出水稻OSCA1.2如何在滲透脅迫下進(jìn)行運(yùn)輸途徑門(mén)控的模型，為研究植物細(xì)胞的機(jī)械傳感機(jī)制提供了分子框架。

圖10 AtOSCA1.2單體在多個(gè)方向的構(gòu)象Fig. 10 Conformations of AtOSCA1.2 monomer in multiple directions

2019年，孫林峰研究組及其合作者解析了響應(yīng)低滲刺激的擬南芥中小電導(dǎo)機(jī)械敏感通道MscS樣蛋白AtMSL1的3.3?的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［117］，總體結(jié)構(gòu)與細(xì)菌MscS非常相似，但AtMSL1的跨膜結(jié)構(gòu)域更大，羧基末端更具柔韌性，并且缺少在MscS中觀察到的β-桶狀結(jié)構(gòu)。AtMSL1中的側(cè)門(mén)明顯較小，通過(guò)誘變擴(kuò)大門(mén)的大小可以增加電導(dǎo)性。該研究明確了真核生物中小電導(dǎo)機(jī)械敏感離子通道的結(jié)構(gòu)框架和門(mén)控機(jī)制。2020年，Deng等［118］通過(guò)冷凍電鏡單

顆粒技術(shù)解析了小電導(dǎo)機(jī)械敏感通道MscS閉合和開(kāi)放的原子分辨率結(jié)構(gòu)（3.0?），結(jié)合電生理實(shí)驗(yàn)揭示了其通過(guò)橫向膜張力導(dǎo)致跨膜區(qū)域扁平化擴(kuò)張進(jìn)行門(mén)控的結(jié)構(gòu)機(jī)制。

鉀元素作為植物必需的三大基本營(yíng)養(yǎng)元素之一，可以參與多種植物代謝活動(dòng)，包括氮代謝、滲透調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞膜極化，對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。K+可以提高植物對(duì)干旱、高鹽等非生物脅迫的耐受性，同時(shí)也可以抵抗真菌等生物脅迫。植物通過(guò)體內(nèi)的鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)獲得足夠的K+，其中，鉀離子通道發(fā)揮了重要作用。2020年，基于冷凍電鏡技術(shù)，植物鉀離子通道的結(jié)構(gòu)與功能研究取得了一定進(jìn)展。Perozo小組率先解析了擬南芥中超極化激活的電壓門(mén)控鉀離子通道KAT1的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并據(jù)此提出了非結(jié)構(gòu)域交換Kv通道KAT1中機(jī)電耦合和門(mén)控極性的分子機(jī)制［119］。這種直接耦合機(jī)制與超極化激活環(huán)狀核苷酸門(mén)控通道（HCN）的變構(gòu)機(jī)制相反。同時(shí)，田長(zhǎng)麟小組及其合作者解析了擬南芥全長(zhǎng)KAT1的3.2?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［120］，確定了KAT1是非域交換離子通道，初步確定了其在超極化激活中門(mén)控機(jī)制的關(guān)鍵要素，并提出了相應(yīng)的門(mén)控模型，促進(jìn)了人們對(duì)超極化激活離子通道門(mén)控特性的了解。

通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)，研究人員已經(jīng)獲得了部分植物部分非生物脅迫感受器的分子結(jié)構(gòu)，但尚有眾多的脅迫感受器，比如增加耐熱性的擬南芥環(huán)核苷酸門(mén)控Ca2+通道CNGC6［121］，定位于水稻細(xì)胞質(zhì)膜上的低溫感受器COLD1［122-123］，水稻中可以提升冷凍耐受性的兩種鈣調(diào)蛋白受體樣細(xì)胞質(zhì)激酶CRLK1和CRLK2［124-125］和下調(diào)冷凍耐受性的低溫響應(yīng)性蛋白激酶CPRK1［126］，基于Ca2+成像遺傳篩選手段分離鑒定的在鹽脅迫信號(hào)感知中的關(guān)鍵蛋白MOCA1［127］，其結(jié)構(gòu)功能研究有待開(kāi)展，冷凍電鏡技術(shù)將發(fā)揮重要作用。

4 展望

綜上，冷凍電鏡技術(shù)在分子植物學(xué)領(lǐng)域已得到眾多應(yīng)用（表1），主要包括：光合作用復(fù)合物的結(jié)構(gòu)功能研究，為進(jìn)一步闡明光合作用分子機(jī)理提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；植物感應(yīng)生物脅迫的相關(guān)免疫受體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)功能研究，促進(jìn)了對(duì)植物免疫分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)；植物感應(yīng)非生物環(huán)境脅迫相關(guān)感受器的結(jié)構(gòu)功能研究，揭示了一類(lèi)新的植物離子通道激活的分子機(jī)理。未來(lái)，冷凍電鏡技術(shù)將在植物光合作用、脅迫響應(yīng)等方面的分子機(jī)理研究發(fā)揮更大的作用，這包括了對(duì)于高等植物光系統(tǒng) I復(fù)合體、低等植物細(xì)胞色素b6f等的結(jié)構(gòu)研究，包括了對(duì)于植物PRR受體WAK和DORN1等的結(jié)構(gòu)研究，包括了對(duì)于植物Ca2+通道CNGC6、低溫感受器COLD1和低溫響應(yīng)性蛋白激酶CPRK1等的結(jié)構(gòu)研究。此外，冷凍電鏡等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)近年來(lái)不斷發(fā)展和突破，特別是原位冷凍電鏡技術(shù)的突破和成熟［80］，人工智能結(jié)構(gòu)計(jì)算技術(shù)AlphaFold2的出現(xiàn)和成功［128］，為冷凍電鏡技術(shù)在分子植物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的更大的契機(jī)。這些新技術(shù)的成功應(yīng)用將有效推動(dòng)人們對(duì)植物光合作用、脅迫感知和抗病應(yīng)答分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為改良育種提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)做出貢獻(xiàn)。

表1 冷凍電鏡技術(shù)解析獲得的植物相關(guān)重要生物大分子結(jié)構(gòu)Table 1 Structure of important plant-related biological macromolecules solved by cryo-EM