RNA編輯的研究進展

朱琳 鮮鳳君 張倩楠 胡駿

（武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院雜交水稻國家重點實驗室，武漢 430072）

RNA編輯（RNA editing）是指在RNA水平上發(fā)生的堿基增加、刪除和替換，使核苷酸序列與基因組DNA序列不同從而引起遺傳信息的改變，是一種遺傳物質(zhì)的間接性、高特異性的修復(fù)機制，這一轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程廣泛存在于生物有機體中［1］。1986年，RNA編輯一詞首次被提出，用來描述錐蟲（Try panosoma）線粒體中尿苷酸的添加和刪除［2］。植物界首次確定的RNA編輯為1989年在月見草（Oenothera biennis L.）線粒體轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)的C-to-U替換［3］，1991年也在玉米（Zea mays L.）葉綠體中被確認［4］，與細胞器基因的表達調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性密切相關(guān)。1993年，由載脂蛋白B mRNA編輯酶1（apolipoprotein B mRNA-editing enayme catalytic polypeptide-like1，APOBEC1） 介 導(dǎo)的胃腸組織中ApoB mRNA第6 666位胞苷脫氨為尿苷而產(chǎn)生不成熟的終止密碼子的過程是哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的首個C-to-U類型編輯［5］，另外由腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase acting on RNA，ADAR）催化A-to-I的編輯［6］也在動物體內(nèi)廣泛存在，在組織器官發(fā)育與功能發(fā)揮中具有重要的調(diào)控作用。因此，研究RNA編輯的作用機制，有助于我們進一步了解RNA編輯的本質(zhì)及其發(fā)生的生物學(xué)意義。

1 RNA編輯的作用機制

RNA編輯的作用機制主要有兩種形式，分別為由引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA）介導(dǎo)的核苷插入或刪除編輯，和由脫氨酶介導(dǎo)的堿基特異替換編輯。在堿基插入或刪除的編輯形式中，插入位點的精確定位和核苷數(shù)目的準確數(shù)目通常需要依賴gRNA的介導(dǎo)，gRNA分子是一種小型非編碼RNA，可以與mRNA下游編輯位點結(jié)合形成10-15 bp大小的錨定雙螺旋，依賴位點特異性內(nèi)切酶識別并切開雙螺旋序列，隨后由尿嘧啶轉(zhuǎn)移酶或3′尿嘧啶特異性外切酶介導(dǎo)完成尿嘧啶的插入或刪除，最終依賴RNA連接酶將mRNA連接起來，這一系列酶促反應(yīng)完成編輯過程。這種編輯形式首先在錐蟲線粒體中發(fā)現(xiàn)［2］，其細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ（CoxⅡ）轉(zhuǎn)錄本與基因序列不匹配，存在4個非DNA編碼的尿嘧啶，后來在變形菌（Proteusbacillus vulgaris）和副粘病毒（Paramyxoviridae）基因中也分別發(fā)現(xiàn)了C插入和G插入的現(xiàn)象［7］。

在高等植物中，RNA編輯主要為細胞器內(nèi)由脫氨酶介導(dǎo)的堿基替換類型，存在胞嘧啶到尿嘧啶（C-to-U）、尿嘧啶到胞嘧啶（U-to-C）以及腺嘌呤到次黃嘌呤（A-to-I）3種形式的轉(zhuǎn)換，而且編輯事件發(fā)生的頻率相當高，其中大部分以C-to-U的編輯形式發(fā)生，脫氨酶將胞嘧啶核苷C6位氨基水解脫氨形成尿嘧啶核苷。RNA編輯事件在mRNA的編碼區(qū)域較為普遍［8］，通常會使密碼子的第一或第二位置發(fā)生改變，如通過將ACG改變?yōu)锳UG生成起始密碼子，將CGA改變?yōu)閁GA或?qū)AA改變?yōu)閁AA引入翻譯終止信號，這種方式為存在缺陷的細胞器轉(zhuǎn)錄本提供了一個可能的校對修復(fù)機制，使其產(chǎn)生功能完全的蛋白質(zhì)［9］。有時，C-to-U編輯形式也會發(fā)生在非翻譯區(qū)域和結(jié)構(gòu)RNA中影響剪接和翻譯效率，例如植物II型內(nèi)含子V域的RNA編輯變化就是剪接過程發(fā)生的必要性因素［10］。U-to-C編輯形式也可以改變終止密碼子，如將終止信號UAA轉(zhuǎn)換為甘氨酸的CAA三聯(lián)體編碼等，這種編輯形式在除蕨類、苔蘚和石松科以外的其余陸生植物中很少見，但Ruchika等［11］在擬南芥幼苗中觀察到了罕見的U-to-C編輯形式發(fā)生在成熟mRNA的3′UTR區(qū)，影響核基因mRNA的穩(wěn)定性。A-to-I的編輯通常發(fā)生在細胞質(zhì)中的tRNA上［12］。

植物細胞器中的RNA編輯是相對復(fù)雜的過程，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)植物細胞器中的RNA編輯并不僅僅是由核編碼的RNA編輯因子介導(dǎo)，而是通過與其他不同類型的蛋白質(zhì)共同組裝成編輯復(fù)合體來行使編輯功能的。研究表明，擬南芥線粒體中的編輯位點多達619個［13］，水稻線粒體中有491個［14］，還有一些未知位點尚未報道。但是參與RNA編輯的復(fù)合體數(shù)量遠遠少于細胞器內(nèi)編輯位點的數(shù)量，由此可見RNA編輯復(fù)合體在行使編輯功能時具有復(fù)雜、靈活、多變等特點。到目前為止發(fā)現(xiàn)的編輯因子有三角狀五肽重復(fù)序列（pentatricopeptide repeat，PPR）蛋白、多細胞器RNA編輯因子（multiple organellar RNA editing factors，MORF）蛋白家族，也被稱為RNA編輯因子互作蛋白（RNA editing factor interacting proteins，RIP）、細胞器RNA識別基序（organelle RNA recognition motif，ORRM）蛋白、細胞器鋅指（organelle zinc-finger，OZ）蛋白和原卟啉原IX氧化酶1（protoporphyrinogen IX oxidase 1，PPO1）等，此外，可能還存在其他的未知因子參與RNA編輯。Planchard等［14］對RNA編輯的程度是否影響后續(xù)的翻譯過程進行了研究，結(jié)果表明，經(jīng)過部分編輯的RNA可以進行翻譯，且植物線粒體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中有不可忽視的比例可能來自部分編輯的轉(zhuǎn)錄本。通過在擬南芥線粒體的全基因組規(guī)模上對總mRNA及核糖體相關(guān)mRNA中所有位點的編輯水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)許多編輯位點都是部分編輯的，這表明線粒體mRNA的完全編輯并不是其翻譯的先決條件［12］。同時，核糖體也會對RNA編輯產(chǎn)生一定程度的影響，Rugen等［15］的研究表明，當RNA與核糖體結(jié)合時，編輯位點會更容易接近編輯復(fù)合體或者優(yōu)先翻譯編輯程度更高的RNA，而且編輯因子與核糖體也存在著某種關(guān)聯(lián)。

在動物體內(nèi)也存在RNA編輯現(xiàn)象，主要存在兩種形式，一種是載脂蛋白B mRNA編輯酶（APOBEC）催化的C-to-U的編輯，另一種是腺苷酸脫氨酶（ADAR）催化A-to-I的編輯［5-6］。此外，CRISPR/Cas是微生物體內(nèi)抵御外源核酸物質(zhì)入侵的一種防御機制［16］，具有強大、精準、廉價、易于操作等特點，是基因工程領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵編輯技術(shù)，尤其是靶向DNA的CRISPR/Cas9技術(shù)，然而靶向RNA 的技術(shù)雖然進步迅速但仍處于研究應(yīng)用的開始階段，目前已經(jīng)證實VI型CRISPR/Cas系統(tǒng)和相關(guān)的Cas13效應(yīng)器以及III-E型CRISPR/Cas系統(tǒng)和相關(guān)的Cas7-11效應(yīng)器是具有潛力的RNA靶向候選工具［17-18］。與靶向DNA技術(shù)所具有的可遺傳性和不可恢復(fù)性相比，干預(yù)RNA所引起的改變是暫時性的，并不會造成永久性的遺傳，通過調(diào)控還能更好地滿足不同的需要，因此可以作為更安全、更通用的技術(shù)方法［19］。

2 植物RNA編輯的作用機制

2.1 PPR蛋白

細胞器中RNA結(jié)合蛋白對其基因的表達調(diào)控起著舉足輕重的作用［20］。大量研究表明，三角狀五肽重復(fù)序列（PPR）蛋白家族是參與細胞器轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的主要因子之一，可以作為位點特異性的RNA結(jié)合蛋白參與植物細胞器中RNA切割、剪接、穩(wěn)定、降解、編輯和翻譯等RNA加工過程［21］。

2.1.1 PPR蛋白的結(jié)構(gòu)特征 PPR基序通常由35個氨基酸組成的簡并序列串聯(lián)重復(fù)［22］，每個基序會形成兩個反向平行的α螺旋A和B，它們相互作用會產(chǎn)生螺旋-折疊-螺旋基序，螺旋A的第3、6、7、10位和螺旋B的第19、22、23、26位的氨基酸在此過程中發(fā)揮重要作用［23］，且其突變可能會導(dǎo)致PPR蛋白螺旋重復(fù)結(jié)構(gòu)的丟失。典型的PPR蛋白一般是由2-27個數(shù)量不等的PPR基序組成［24］，一系列PPR基序在整個蛋白質(zhì)中形成的螺旋-折疊-螺旋基序會產(chǎn)生一個具有中央凹槽的超螺旋，為蛋白質(zhì)提供RNA的結(jié)合位點［25］。當結(jié)合位點發(fā)生突變時，結(jié)合RNA的能力會顯著受到影響，比如螺旋A中第2位和第14位的殘基的取代會導(dǎo)致體外RNA結(jié)合能力的改變。

PPR蛋白具有3種長度不同的PPR基序：P、L和S基序。P基序即代表含有35個氨基酸的標準PPR基序，而L和S基序與PPR基序相關(guān)，分別含有35或36個氨基酸和31個氨基酸，依據(jù)這些氨基酸基序的區(qū)別，PPR蛋白可以細致區(qū)分為只包含P基序的P亞類和包含P、L、S三種基序的PLS亞類。除PPR基序外，其N端通常還包含不保守的細胞器定位序列肽段，其C端序列相對保守，可以分為E、E+及DYW三種結(jié)構(gòu)域。P亞類蛋白通常缺乏C端額外的結(jié)構(gòu)域，能與靶標RNA發(fā)生特異性結(jié)合進而保護其免受核酸內(nèi)切酶的消化［26］，還可以特異性抑制或激活某些RNA的翻譯來調(diào)控其表達，在細胞器RNA穩(wěn)定、切割、剪接以及翻譯等細胞器基因表達的大多數(shù)方面具有功能［27］。而PLS亞類具有特定的氨基酸保守模式，主要作為編輯因子參與RNA編輯［25］，但是并非所有的PPR-RNA編輯因子都是PLS亞類，P亞類PPR蛋白PPME被證實可以參與RNA編輯［28］。根據(jù)不同的C端結(jié)構(gòu)域，PLS亞類可以進一步細分為3類：E類成員還包含C端延伸的E結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域并不是催化結(jié)構(gòu)，預(yù)測是招募編輯酶的蛋白質(zhì)相互作用基元［29-30］；E+亞類額外包含E和E+結(jié)構(gòu)域；另一個PLS亞類不僅包含PPR基序和E、E+結(jié)構(gòu)域，還包含DYW結(jié)構(gòu)域，因其位于C端高度保守的天冬氨酸（D）、酪氨酸（Y）和色氨酸（W）三肽得名［31］，后來也發(fā)現(xiàn)極少數(shù)的PPR蛋白末端的3個保守氨基酸為天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）和色氨酸（W）。

DYW結(jié)構(gòu)域中包含與介導(dǎo)C-to-U轉(zhuǎn)化的胞苷脫氨酶活性位點相匹配的保守催化殘基HxE（x）nPCxxC［32］，同時其保守的脫氨酶殘基還具有與胞苷脫氨酶類似的鋅結(jié)合能力［33］，在鋅結(jié)合基序的位置具有組氨酸和半胱氨酸特征，保守的組氨酸和半胱氨酸在胞苷脫氨酶活性位點與鋅原子結(jié)合，而保守的谷氨酸則是催化脫氨反應(yīng)所必需的，DYW域也因此被認為是編輯結(jié)構(gòu)域。Hayes等［34］的研究已經(jīng)證實了DYW結(jié)構(gòu)域具有脫氨酶活性，并且結(jié)構(gòu)域中的PG-box部分可能對功能性DYW蛋白或酶的募集起著至關(guān)重要的作用。而且，DYW結(jié)構(gòu)域的脫氨功能在體外也已經(jīng)得到證實［35］，來自小立碗蘚（Physcomitrella patens）的PPR65和PPR56蛋白可以在體外被純化，并對同源的外源靶標RNA進行C-to-U的編輯，在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達分別實現(xiàn)了ccmFC和nad3/nad4轉(zhuǎn)錄本中共表達蛋白的編輯［36］，其編輯活性還受鋅離子的含量影響。Hayes也證實了PPR65重組蛋白在體外具有足夠的C-to-U活性［37］。而缺少完整的DYW結(jié)構(gòu)域的E類編輯因子和E+類編輯因子可能需要由含有DYW結(jié)構(gòu)域的反式因子補充后才能行使編輯功能。比如，DYW1可以為CRR4提供缺失的C端序列；DYW2截斷的C端結(jié)構(gòu)域與E+類PPR蛋白缺失的C端結(jié)構(gòu)域相匹配，可以填補E+亞類PPR蛋白缺失的DYW結(jié)構(gòu)域。

2.1.2 PPR蛋白的識別特征 研究發(fā)現(xiàn)，參與RNA編輯的PPR蛋白是通過一個基序?qū)?yīng)一個核苷酸的組合形式，序列特異性地與RNA相互作用，其PPR基序特異識別編輯位點上游的核苷酸序列并與之結(jié)合，隨后進行脫氨反應(yīng)完成C-to-U的編輯［38］。當編輯位點的順式元件沒有明顯的保守性時，一些PPR蛋白也可以參與多個位點的編輯事件。Barkan等［39］研究發(fā)現(xiàn)兩個相鄰PPR 基序上的3個位置的氨基酸對RNA的識別起著至關(guān)重要的作用，核苷酸特異性主要依賴于每個基序中第3、第6位和下一個基序的第1位（定義為1’）的氨基酸特征，（6，1’）位點上的（Thr，Asp）和（Thr，Asn）分別與G和A結(jié)合 ；（6，1’）位點的（Asn，Asp/Asn/Ser）組合與嘧啶的識別相關(guān)，（Asn，Asp）對U的顯著偏好高于C，第3位氨基酸起到輔助蛋白質(zhì)-RNA結(jié)合的作用；Yagi等［40］的研究也驗證了Barkan的結(jié)論，表明PPR蛋白識別可編輯C殘基的上游序列，且PPR-RNA序列與可編輯C之間的距離被證明是保守的，其第1、4和“ii”位置的3個氨基酸組成PPR基序的NSRs（nucleotide-specifyingresidues），第4位氨基酸（同第6位）是識別嘌呤或嘧啶基團的關(guān)鍵殘基，其次，識別氨基或酮基的第“ii”位殘基（同第1’位）決定了對靶標RNA序列的序列特異性識別，第1位則提供了附加的限制結(jié)合核苷酸。此外，Yin等［41］觀察蛋白晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，P亞類PPR10蛋白中串聯(lián)排列的19個PPR重復(fù)單元連在一起，組成兩圈右手超螺旋，RNA結(jié)合殘基位于其內(nèi)側(cè)表面，第2、5、35位的氨基酸特異性識別RNA堿基。第2位的疏水氨基酸殘基與RNA堿基相互作用；第5位起到最關(guān)鍵的RNA堿基識別作用，天冬氨酸與識別靶標RNA的嘧啶堿基相關(guān)，絲氨酸或蘇氨酸與嘌呤堿基識別相關(guān)；第35位穩(wěn)定第5位的構(gòu)象，為PPR蛋白特異識別單鏈RNA的分子機制提供了進一步的理論依據(jù)。

2.1.3 PPR蛋白與植物生長發(fā)育的關(guān)系 RNA編輯在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，調(diào)控細胞器形成、植物開花、胚及胚乳的發(fā)育、植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、對特定環(huán)境條件的響應(yīng)和雄性不育等一系列生物過程。如果RNA編輯事件不能正常進行，會引發(fā)一系列的植物生長缺陷，比如線粒體和葉綠體的形成受損、幼苗生長緩慢、胚及胚乳發(fā)育緩慢、開花延遲、對逆境敏感等現(xiàn)象。表1總結(jié)了已發(fā)表的PPR蛋白參與RNA編輯事件從而調(diào)控植物生長發(fā)育過程的相關(guān)報道，可見RNA編輯對植物正常生長發(fā)育是必要的。

表1 參與RNA編輯的PPR蛋白及其對模式植物生長發(fā)育的調(diào)控Table 1 PPR protein involved in RNA editing and its regulation on model plant growth and development

續(xù)表 Continued

2.2 非PPR蛋白

植物線粒體RNA編輯是由多個編輯因子直接或間接參與的復(fù)雜生物學(xué)過程，PPR蛋白特異性地識別靶標位點附近的順式作用元件并與其結(jié)合，并且為其他編輯體成員的附著提供了一個場所。除PPR蛋白家族外，RIP/MORF 蛋白［76］、ORRM 蛋白［77］、OZ 蛋白［78］、NUWA 蛋白［79］、CP31 蛋白［80］、PPO1蛋白［81］以及OCP3蛋白［82］等都已經(jīng)被鑒定為植物RNA編輯體的組成部分。

第一類被發(fā)現(xiàn)的非PPR蛋白的RNA編輯因子是RIP/MORF家族蛋白，在水稻中有5個含有保守RIP/MORF基序的蛋白質(zhì)，擬南芥中已發(fā)現(xiàn)10個，其中MORF2和MORF9定位于葉綠體中，MORF8雙定位于兩個細胞器［60］，其余蛋白定位于線粒體。在擬南芥rip1突變體中，400多個線粒體編輯位點活性顯著降低，從而造成線粒體功能性障礙［83］；MORF1和MORF3的突變會對線粒體中的50多個編輯位點造成影響［84］；MORF8控制70%以上位點的編輯［85］。有研究表明，RIP/MORF蛋白之間也可以形成異源二聚體，在某些位點的功能也可以被同源二聚體取代。

此外，擬南芥中已有6種ORRM蛋白被報道為RNA編輯因子［86］。ORRM1和ORRM6定位在葉綠體中，其余4個蛋白為線粒體編輯因子［87］，并且由于其位點的特異性影響了大量編輯事件。ORRM2和ORRM3的瞬時沉默會分別導(dǎo)致35個和32個線粒體位點的編輯效率降低［88］。ORRMs也可與RIP/MORF因子相互作用，形成同源或異源二聚體［86］。

與RIP1的發(fā)現(xiàn)類似，OZ1也在orrm1共純化蛋白復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)［78］，在擬南芥中OZ家族包括4個成員，其中OZ3定位于線粒體，另外3個定位于葉

綠體。在擬南芥中，OZ1的缺失導(dǎo)致30個質(zhì)體位點的編輯缺陷。該家族蛋白中唯一有注釋的結(jié)構(gòu)域是RanBP2型鋅指結(jié)構(gòu)，但是否通過這種結(jié)構(gòu)與鋅離子結(jié)合進而在RNA編輯復(fù)合體中起作用還需要進一步研究。

Andrés-Colás等［89-90］的研究表明，P 類 PPR 蛋白NUWA的突變體中許多RNA編輯位點可以被E+亞類PPR編輯因子所靶向，增強了E+亞類PPR 蛋白SLO2與線粒體DYW2的相互作用，且NUWA蛋白在體內(nèi)還與MORF蛋白相關(guān)聯(lián)，與 MORF1或MORF2蛋白共沉淀，有關(guān)NUWA的研究表明其他P類PPR蛋白可能也參與形成植物細胞器中的RNA編輯復(fù)合物。另外3種蛋白質(zhì)CP31、PPO1和OCP3被發(fā)現(xiàn)影響質(zhì)體中的RNA編輯效率。CP31缺失會導(dǎo)致多個質(zhì)體位點的編輯水平降低［80］，且突變體中轉(zhuǎn)錄本的豐度大大降低，這表明CP31可能影響RNA的穩(wěn)定性［91］。PPO1是四吡啶代謝的關(guān)鍵酶，突變會造成18個質(zhì)體位點的編輯減弱，但不會完全失去編輯功能，可以直接與質(zhì)體RIP /MORFs相互作用，但不與PPR因子相互作用［81］。OCP3編碼一種陽離子過氧化物酶，突變后質(zhì)體ndhB轉(zhuǎn)錄本中多個位點的編輯程度輕微降低，削弱NADPH脫氫酶（NDH）復(fù)合體的活性從而增強植物對真菌感染的抗性［92］。

多種RNA編輯因子協(xié)調(diào)配合，共同組成編輯復(fù)合體，靈活多變地在細胞器RNA編輯過程中發(fā)揮作用。PLS型PPR蛋白識別并特異性結(jié)合編輯位點，PPR-RNA復(fù)合物與其他一些非PPR蛋白因子組成編輯體，非PPR蛋白可能作為編輯效率的調(diào)節(jié)器或者利用額外的輔助因子招募位點特異性的PPR蛋白進入活性編輯機制［93］。

3 動物RNA編輯的作用機制

動物體內(nèi)主要存在兩種形式的RNA編輯現(xiàn)象，一種是載脂蛋白B mRNA編輯酶（APOBEC）催化的C-to-U的編輯，哺乳動物中主要存在11種APOBEC蛋 白， 其 中 APOBEC1、APOBEC3F和APOBEC3G具有催化活性［94］；另一種是腺苷酸脫氨酶（ADAR）催化A-to-I的編輯，哺乳動物中主要存在3種ADAR蛋白，其中ADAR1和ADAR2具有催化活性［95］。除脫氨酶介導(dǎo)的編輯形式外，CRISPR/Cas編輯復(fù)合體是近年來RNA編輯領(lǐng)域的研究熱點。

RNA靶向VI型CRISPR/Cas系統(tǒng)于2016年被首次發(fā)現(xiàn)，East-Seletsky等［96］在微生物基因組和宏基因組數(shù)據(jù)中搜索候選CRISPR/Cas位點時發(fā)現(xiàn)，Cas13具 有 Cas13a、Cas13b、Cas13c和 Cas13d四種亞型。Abudayye等［97］首次證實了Cas13是一種RNA靶向的新型CRISPR酶，可以進行精確的RNA堿基編輯，Jing等［98］發(fā)現(xiàn)VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)可以介導(dǎo)裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的RNA敲除和單堿基RNA編輯；Cox等［99］研究發(fā)現(xiàn)，將失活的Cas13b融合到ADAR2腺嘌呤脫氨酶結(jié)構(gòu)域可以實現(xiàn)A-to-I的單堿基替換，命名為REPAIR（RNA editing for programmable A to I replacement），可以特異性地識別A/C錯配，實現(xiàn)特定位點核苷酸的高效精確編輯，隨后Abudayyeh等［100］用胞苷脫氨酶替換腺嘌呤脫氨酶，實現(xiàn)了從C-to-U的單堿基編輯，并命名為RESCUE（RNA editing for specific C to U exchange），填補了RNA編輯工具中的關(guān)鍵空白。

Liu 等［101］與 Knott等［102］解析 Cas13a單蛋白、Cas13a-crRNA二元復(fù)合物、Cas13a-crRNA及靶RNA三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)后，指出Cas13a是一種RNA介導(dǎo)的具有RNase活性的Cas效應(yīng)蛋白，可自我加工pre-crRNA形成成熟crRNA，通過其2個HEPN（higher eukaryotic and prokaryotic nucleasedomains）結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保守氨基酸可以有效地降解ssRNA（singlestranded RNA）。此外，Cas13a與組織特異性啟動子聯(lián)合可以敲除特定組織中的目標RNA，與核定位信號融合可以靶向非編碼細胞核轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，擴大了作用范圍［103］，有助于進一步研究RNA結(jié)合蛋白的功能。

但是Cas13a酶本質(zhì)上是一種相對較大的蛋白質(zhì)，很難被包裝到靶組織中，這也是臨床應(yīng)用的一大障礙。2018年，Konermann等［17］發(fā)現(xiàn)了靶向RNA的Cas13d家族，是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物細胞中相對較小的Ⅱ類CRISPR效應(yīng)因子，關(guān)鍵特征在于依賴一種比以前研究中物理尺寸更小的酶，且對RNA靶點的切割不依賴于PFS序列（protospacer flanking sequence），可以靈活設(shè)計sgRNA。Cas13d家族成員CasRx來自腸道黃化瘤胃球 菌（Ruminococcus flavefaciens）XPD3002［104］， 是已發(fā)現(xiàn)的最小的效應(yīng)蛋白，比Cas13a-c小20%左右，更易包裝到AAV（adeno-associated virus）等容量有限的載體中實現(xiàn)體內(nèi)運輸，在編輯效率高達96%的同時沒有明顯脫靶效應(yīng)，已經(jīng)成為動物RNA編輯系統(tǒng)中的首選工具。Wang等［105］利用CasRx系統(tǒng)靶向石斑魚神經(jīng)壞死病毒以干擾其感染，為病毒免疫提供了潛在機制；Huynh等［106］依賴CasRx開發(fā)了在RNA水平操縱基因表達的工具，靶向果蠅體內(nèi)的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本；Brogan等［107］利用CasRx系統(tǒng)構(gòu)建 SENSR（sensitive enzymatic nucleic acid sequence reporter）檢測SARS-CoV-2，開發(fā)了迅速適應(yīng)新病原體的即時診斷工具。

脫靶效應(yīng)始終是評價編輯體系可靠性的重要指標，是RNA編輯應(yīng)用中尤為關(guān)鍵的安全性問題，與靶標RNA非常接近的片段有可能在編輯過程中被同時沉默，進而導(dǎo)致基因組的變異和染色體重排。Manghwar等［108］總結(jié)了當前的ZFN技術(shù)、TALEN技術(shù)和CRISPR/Cas系統(tǒng)等基因編輯工具產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)，并提出開發(fā)利用預(yù)測工具、設(shè)計高質(zhì)量靶標等有效減少或避免脫靶的策略。Grünewald等［109］的研究結(jié)果表明，單堿基編輯同樣面臨著造成大量突變的脫靶風險，使用兩個帶有rAPOBEC1突變的優(yōu)化編輯器（cytosine base editor，CBE）會使變異率分別減少390倍和3 800倍，可以減少RNA脫靶效應(yīng)的發(fā)生。

若要從技術(shù)源頭去規(guī)避脫靶效應(yīng)，開發(fā)精準性更高的新基因編輯系統(tǒng)是首選方案［107］。與RNAi相比，Cas13a系統(tǒng)脫靶率顯著降低［110］，Konermann等［17］也證實了Cas13d介導(dǎo)的基因沉默在數(shù)百個shRNA脫靶的情況下沒有脫靶，可見Cas13系統(tǒng)在精度、效率和實用性等方面有突出的優(yōu)勢，但Cas13并非完美的臨床應(yīng)用工具，由于其本身具有旁切活性，當其識別到靶標時，不僅能切割底物RNA，還會切割游離的任意單鏈RNA，對細胞造成一定程度的損傷。

2021年，Jonathan和Omar團隊篩選出獨特的III-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)攻克了這一難題［18］，該系統(tǒng)借助單一的效應(yīng)蛋白Cas7-11（包含4個Cas7的亞基和一個Cas11的亞基的融合蛋白），精準靶向RNA且沒有表現(xiàn)出傷害細胞的旁切活性，來自石本氏脫硫絲菌（Desulfonema ishimotonii）的DiCas7-11將pre-crRNA加工為成熟的crRNA，并在靶標位點精確切割RNA，保持其他RNA不受干擾，這意味著Cas7-11可以在不傷害細胞的情況下改變RNA中的特定堿基，從而校正基因突變帶來的錯誤。此外，Cas7-11還可以穩(wěn)定或破壞特定RNA分子來調(diào)節(jié)其編碼蛋白質(zhì)的水平。Cas7-11是一種高特異性且低細胞毒性的新型RNA編輯工具［18］，豐富了CRISPR/Cas系統(tǒng)多樣性，進一步推動了RNA編輯技術(shù)的發(fā)展。

目前，特異靶向RNA的VI型CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)成為動物RNA編輯系統(tǒng)中的熱門工具，由于該系統(tǒng)優(yōu)勢突出，也在植物中開展了研究，主要在抑制植物病毒方面發(fā)揮作用。在感染植物的病毒屬中，約70%是在其生命周期中不使用DNA中間產(chǎn)物的ssRNA病毒［111］，因此特異靶向ssRNA的CRISPR/Cas系統(tǒng)更適合用來抑制ssRNA病毒。在擬南芥中轉(zhuǎn)基因表達的LshCas13a首次證明了Cas13系統(tǒng)在植物中可以保持其pre-crRNA加工活性，干擾蕪菁花葉病毒的復(fù)制且不會引起細胞毒性作用［112］；RfxCas13d也對植物RNA病毒如蕪菁花葉病毒、煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒表現(xiàn)出強大特異的抗病毒活性，為抗病毒分子育種檢測提供了新的策略［113］。

4 RNA編輯與相關(guān)數(shù)據(jù)庫

隨著RNA編輯研究的不斷擴展，關(guān)于RNA編輯事件的數(shù)據(jù)庫資源也逐漸豐富完備（表2）。RNA編輯數(shù)據(jù)庫不僅全面完整地記錄了編輯事件、編輯位點等信息，還會將其編輯類型、編輯因子與編輯時之間的交互作用等詳細記錄，如REDIdb數(shù)據(jù)庫記錄了486個線粒體序列和220個葉綠體序列的編輯類型，其中67%是堿基替換，堿基的插入與刪除分別占比30%和3%［114］；PED不僅記錄了編輯類型，還包括8個模式物種中編輯因子在調(diào)控植物表型中的功能作用以及詳細的研究結(jié)論［115］。數(shù)據(jù)庫的建立與改進，有利于充分有效地管理和利用信息資源，為后續(xù)的科學(xué)研究提供了準確的數(shù)據(jù)支撐和強有力的理論支持。

表2 部分RNA編輯數(shù)據(jù)庫Table 2 Partial RNA editing database

5 總結(jié)與展望

RNA編輯使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不能準確反映DNA的一級序列，由此改變了遺傳信息，拓寬了中心法則的范圍，這一現(xiàn)象既豐富了基因表達產(chǎn)物的多樣性，也使得依賴于DNA序列而推測蛋白質(zhì)序列的傳統(tǒng)方法具有一定的不可靠性。

目前關(guān)于植物體內(nèi)RNA編輯的研究多集中在細胞器內(nèi)依賴于RNA編輯復(fù)合體的C-to-U的形式。在眾多的RNA編輯因子中，PPR蛋白是目前被發(fā)現(xiàn)的能夠和靶標編輯位點所在的順式作用元件直接結(jié)合的因子，隨著研究的深入，通過PPR基序預(yù)測識別RNA序列的機制也逐漸變得清晰，但是并非所有的PPR蛋白都能按照這一預(yù)測模型完全準確地識別其靶標位點，PPR蛋白中不同結(jié)構(gòu)域的功能以及發(fā)揮編輯功能的過程仍沒有被完全揭示。此外，編輯復(fù)合體中已知的非PPR蛋白的具體功能以及究竟還有多少種未知的編輯因子在發(fā)揮功能不得而知，其作用機制仍然需要大量的研究去闡述。

此外，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)以及相應(yīng)效應(yīng)器的RNA編輯技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用是生命科學(xué)領(lǐng)域的一大突破性進展，作為基因編輯工具發(fā)揮了相當重要的功能，但它仍需要進一步提高性能及其安全性。例如，提高對靶標RNA的編輯能力、Cas酶活性的調(diào)控、不同類別蛋白組分間融合進化的機制以及新型蛋白如何在體內(nèi)更好地遞送等都需要后續(xù)的深入研究，尤其是如何正確評估、檢測脫靶效應(yīng)并發(fā)展更高效精準的編輯系統(tǒng)，是當前基因編輯器和編輯工具安全應(yīng)用于臨床的重要研究方向。

目前，RNA編輯技術(shù)已經(jīng)在基礎(chǔ)研究、動植物性狀的定向改良、抗病毒分子育種、癌癥及神經(jīng)性疾病臨床治療、藥物及疫苗的研發(fā)等基因工程領(lǐng)域中發(fā)揮了不可替代的作用，是生命科學(xué)微觀領(lǐng)域的一大里程碑式探索，事實上，RNA編輯看似僅是一個簡單的生物學(xué)過程，仍有許多未知的科學(xué)問題需要進一步探索。如RNA編輯與細胞器進化、內(nèi)共生學(xué)說等存在何種聯(lián)系？為什么RNA編輯在不同組織間差異如此顯著？部分編輯與完全編輯這兩種編輯形式在體內(nèi)如何配合？對RNA編輯的本質(zhì)及作用機制的進一步研究，開拓新的發(fā)展方向，可以使人們對于生命科學(xué)的認識上升到新的高度，使RNA編輯成為基因工程以及基因治療中強有力的新型工具。