IQ-Check Salmonella II Kit方法對食品中沙門氏菌檢測的評價

安琳，余文，崔生輝

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

沙門氏菌屬（Salmonella）是周生鞭毛的革蘭氏陰性腸道桿菌[1]，是食源性疾病的主要致病菌之一[2]，易造成胃腸炎、敗血癥、傷寒等相關(guān)疾病[3]。所以針對食品原料、產(chǎn)品等進行沙門氏菌檢測是我國食品監(jiān)管部門及食品相關(guān)企業(yè)的必檢項目[4]。現(xiàn)有檢測方法主要包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測及分子生物學(xué)方法[5]。傳統(tǒng)培養(yǎng)法操作較復(fù)雜、檢測周期較長，且需要消耗大量培養(yǎng)基[6]。分子生物學(xué)方法中的實時熒光PCR方法（Real-time fluorescent PCR，RT-PCR）通過特異性擴增沙門菌的基因片段，從而高效準(zhǔn)確的對其進行檢測，具有用時間短，易操作等優(yōu)點，在食品微生物快速檢測中具有良好的應(yīng)用前景[7]。鑒于沙門氏菌檢測在食品安全中的重要地位，不同檢測試劑公司也開發(fā)了一系列針對沙門氏菌的檢測試劑盒[8]。

BIO-RAD公司開發(fā)的IQ-Check Salmonella II試劑盒方法（以下簡稱試劑盒方法）是利用RT-PCR方法，采用專利設(shè)計的引物和熒光探針，同時96孔位上機測定，實現(xiàn)了食品中沙門氏菌的特異性高通量檢測。該試劑盒檢測預(yù)增菌后食品樣品可實現(xiàn)12 h內(nèi)報告結(jié)果，與我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》方法（以下簡稱GB方法）所需5～7 d相比極大節(jié)省了檢驗時間[9]。但試劑盒方法性能及能否準(zhǔn)確檢測食品中病原菌還有待驗證。本研究采用試劑盒方法對50株沙門氏菌和50株非沙門氏菌進行檢測，分析該方法對不同菌株的靈敏性和特異性。同時參考ISO 16140[10]方法，對GB方法和試劑盒方法進行了比較驗證，初步分析和探討了兩種檢測方法的一致性，為試劑盒方法的有效性確認(rèn)及食品中沙門氏菌快速檢測工作提供更加優(yōu)化的解決方案。

1 材料與方法

1.1 菌株及食品樣品信息

本研究采用菌株包括實驗室保存的50株已確認(rèn)血清型沙門氏菌和50株非沙門氏菌（見表1、2）。菌株來源主要為中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心CMCC注冊菌株、美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC菌株及中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC菌株。

表1 沙門氏菌菌株信息Table 1 The information of Salmonella strain

表2 非沙門氏菌菌株信息Table 2 The information of non-Salmonella strain

本研究采用的食品樣品包括液體奶、嬰幼兒配方乳粉、肉及肉類制品3大類，每類樣品各25個，均購自大型購物超市。

1.2 試劑與儀器

胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）購自美國BD公司；緩沖蛋白胨水、四硫酸磺鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂平板、亞硫酸鉍（BS）瓊脂平板均購自北京君立康；IQ-Check Salmonella II RT-PCR試劑盒由美國BIO-RAD公司提供。

PL2002電子天平，梅特勒；MLS-3780高壓滅菌器，日本三洋；ESCO生物安全柜；金屬浴，Eppendorf；MIR262生化培養(yǎng)箱，日本三洋；21R微量離心機，美國Thermo；全自動微生物平皿螺旋加樣系統(tǒng)，西班牙IUL；CFX96 Touch Deep Well實時定量PCR系統(tǒng)，美國BIO-RAD。

1.3 實驗方法

1.3.1 IQ-Check試劑盒方法及結(jié)果判讀

DNA模板制備標(biāo)準(zhǔn)方法：取1 mL增菌液，12000×g轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，向沉淀中加入200 μL試劑A裂解液，渦旋混勻，97 ℃金屬浴裂解15 min，渦旋混勻后離心，DNA于上清液中備用。

DNA模板制備簡單方法：100 μL待測菌懸液加入100 μL裂解液試劑A，渦旋混勻，97 ℃金屬浴裂解15 min，渦旋混勻后離心，DNA于上清液中備用。

取45 μL PCR反應(yīng)液和5 μL DNA模板于八連排PCR管中，短暫離心后上機。采用試劑盒配套 CFX MIDE 2.1軟件，選擇Salmonella程序開始檢驗，直至結(jié)束后收集實驗數(shù)據(jù)。PCR程序為：95 ℃ 10 min預(yù)變性，以95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s作為一個循環(huán)，共50個循環(huán)。熒光通道選擇FAM和HEX（內(nèi)部質(zhì)控）。

當(dāng)FAM信號檢出Ct值≥10，測試結(jié)果報告陽性；當(dāng)FAM信號未檢出，HEX信號檢出Ct值≥28，測試結(jié)果報告陰性。樣品平行測試結(jié)果均為陽性，即判定樣品為陽性。樣品平行測試如出現(xiàn) 1個陰性，即判定樣品陰性。

1.3.2 方法靈敏性評價

將50株經(jīng)過鑒定的沙門氏菌新鮮二代培養(yǎng)物用無菌生理鹽水調(diào)成1.5 MCF菌懸液，梯度稀釋至104、103、102CFU/mL，使用簡單方法進行 DNA模板制備及RT-PCR檢測，設(shè)置三平行測試，同時進行E50螺旋涂布菌落計數(shù)，檢測結(jié)果報告陽性的最低細菌濃度為試劑盒方法檢出限。

1.3.3 方法特異性評價

將50株經(jīng)過鑒定的非沙門氏菌新鮮培養(yǎng)物用無菌生理鹽水調(diào)成1.0 MCF菌懸液（108CFU/mL），使用簡單方法進行DNA模板制備及RT-PCR檢測，以沙門氏菌作為陽性對照，考察試劑盒方法特異性，設(shè)置雙平行測試。

1.3.4 方法一致性評價

分別按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016[9]和BIO-RAD公司所提供的IQ-Check試劑盒操作方法進行檢驗。取液體乳、嬰幼兒配方乳粉、肉及肉類制品25 g加入于225 mL BPW混勻，采用人工污染腸炎沙門氏菌CICC21482制備污染水平為0、10-1、100、101CFU/25 g樣品，經(jīng)36 ℃培養(yǎng)24 h預(yù)增菌后，增菌液采用試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方法進行DNA模板制備及RT-PCR檢測，設(shè)置三平行測試。同時參照GB方法進行TTB和SC肉湯增菌后，劃線XLD和BS平板進行分離培養(yǎng)及沙門氏菌鑒定試驗。

參考ISO 16140[10]中的原則，計算試劑盒方法（替代方法）與GB方法（參照方法）的相對準(zhǔn)確性（AC）、相對特異性（SP）和相對靈敏度（SE）并按照ISO 16140附件F的統(tǒng)計檢驗方法評價兩方法的一致性。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法靈敏性評價

采用試劑盒方法測定50株沙門氏菌的檢出限見表3。當(dāng)沙門氏菌濃度在103CFU/mL及以上時，RT-PCR對所有菌株檢測結(jié)果均為陽性。當(dāng)沙門氏菌濃度稀釋至102CFU/mL，仍有36株沙門氏菌能夠檢出。通過計算可知試劑盒方法對50株沙門氏菌檢出限的平均值為6.98×102CFU/mL，說明該方法具有良好的靈敏性。

表3 試劑盒方法對于50株沙門氏菌的檢出限Table 3 Detection limit of 50 Salmonella strains by kit method

2.2 方法特異性評價

采用試劑盒方法對50株非沙門氏菌進行檢測，除陽性對照外所有菌株的檢測結(jié)果均為陰性，見圖1。說明試劑盒方法有很好的特異性，與其他細菌無交叉反應(yīng)。

2.3 方法一致性評價

以液體奶（n=100）、嬰幼兒配方乳粉（n=100）、肉及肉類制品（n=100）3類食品作為樣品基質(zhì)，采用試劑盒方法和 GB方法對沙門氏菌人工染菌樣品的檢測結(jié)果如表4所示。不添加污染菌的空白對照結(jié)果均為陰性，101CFU/25 g染菌濃度三類食品樣品的兩方法檢測結(jié)果均為陽性（75/75）；100CFU/25 g染菌濃度的液體奶樣品兩方法檢出結(jié)果一致（21/21）；10-1CFU/25 g染菌濃度的10#、17#液體奶樣品GB方法檢測陰性試劑盒方法檢測陽性，9#、18#液體奶樣品 GB方法檢測陽性試劑盒方法檢測陰性。試劑盒方法對100CFU/25 g染菌濃度的嬰幼兒配方乳粉樣品檢出數(shù)高于GB方法（18/17），23#樣品GB方法檢測陰性試劑盒方法檢測陽性；10-1CFU/25 g染菌濃度的嬰幼兒配方乳粉樣品兩方法檢出結(jié)果一致（4/4）；試劑盒方法對100CFU/25 g和10-1CFU/25 g染菌濃度的肉及肉類制品檢出數(shù)均高于GB方法（23/22和13/11），16#和17#、19#樣品GB方法檢測陰性試劑盒方法檢測陽性。結(jié)果分析可知試劑盒方法與 GB方法的陽性檢出率為98.77%（161/163）和96.32%（157/163）。

表4 試劑盒方法和GB方法對沙門氏菌人工染菌食品樣品檢測結(jié)果Table 4 Test results of artificially contaminated food samples with Salmonella by kit method and GB method

試劑盒方法對三類食品基質(zhì)中沙門氏菌加標(biāo)樣品的相對準(zhǔn)確度（AC）、相對靈敏度（SE）和相對特異性（SP）結(jié)果如表5所示。對液體奶、嬰幼兒配方乳粉、肉及肉類制品加標(biāo)樣品檢測相對準(zhǔn)確度為：96%、99%、97%，總體準(zhǔn)確度為97.33%；檢測靈敏度為：96.22%、100%、100%，總體靈敏度為 98.73%；檢測特異性結(jié)果為：95.74%、98.15%、92.86%，總體特異性為95.80%。根據(jù)ISO 16140：2003附錄F計算出兩種方法的一致性，結(jié)果如下：PD=6，ND=2；Y=PD+ND=8；6≤Y≤8，M=0，m＞M。故得出結(jié)論：兩種方法在統(tǒng)計學(xué)意義上無顯著性差異。

表5 試劑盒法的相對準(zhǔn)確度（AC）、相對靈敏度（SE）和相對特異性（SP）結(jié)果Table 5 Relative accuracy (AC)， relative sensitivity (SE) and relative specificity (SP) of the kit method

IQ-Check試劑盒方法是基于實時熒光PCR原理的檢測方法，該類方法對目標(biāo)物通常具有較低的檢出限[11]。謝雨龍等[12]建立的實時熒光PCR法對模擬污染的預(yù)包裝柳州螺螄粉模經(jīng)過一步增菌18 h后最低檢測出4 CFU/25 g沙門氏菌。麻麗丹等[13]建立的Taqman MGB實時熒光PCR法對江瑤貝和蜆子肉中添加腸炎沙門氏菌的最低檢測低限為130 CFU/mL。本研究數(shù)據(jù)表明試劑盒方法對 50株不同血清型沙門氏菌的檢出限為102～103CFU/mL，與相關(guān)研究結(jié)果基本一致。當(dāng)菌濃度達到103CFU/mL及以上時，50株沙門氏菌檢測結(jié)果均為陽性。然而由于該方法靈敏性高，為避免陽性樣本的交叉污染，需要對實驗室分區(qū)、設(shè)備和器具規(guī)范使用、人員操作和環(huán)境等提出更嚴(yán)格要求[14]。本研究采用50株包含多屬種的高濃度（108CFU/mL）非沙門細菌以驗證試劑盒法的特異性，結(jié)果表明試劑盒與其他細菌無交叉反應(yīng)，該結(jié)果具有比較充分的代表性。

本研究采集75份不同品牌液體奶、嬰配乳粉、肉及肉制品食品樣品并選擇101、100、10-1CFU/25 g三個較低的染菌濃度條件，考察試劑盒方法與GB方法的一致性。實驗結(jié)果表明：與GB方法相比，試劑盒方法對不同樣品中人工污染的沙門氏菌的檢測呈現(xiàn)較好的一致性和準(zhǔn)確度（總體準(zhǔn)確度97.33%），且兩方法在統(tǒng)計學(xué)無顯著差異。實驗中只有個別樣品檢測結(jié)果存在差異，其中國標(biāo)方法檢出陽性試劑盒方法未檢出的 2份染菌濃度為10-1CFU/25 g液體奶樣本，可能是由于染菌濃度過低而出現(xiàn)的隨機性結(jié)果，4份國標(biāo)方法未檢出而試劑盒方法檢出陽性的10-1CFU/25 g液體奶和肉類樣品，可能是試劑盒方法更為靈敏的體現(xiàn)。此外采用試劑盒方法進行食品樣品檢測僅需要2 d，該方法可以彌補傳統(tǒng)方法在處理一些突發(fā)食品安全事件中，由于檢測時效慢而不能滿足快速檢測的需求。

3 結(jié)論

綜上表明，IQ-Check試劑盒方法對沙門氏菌檢驗具有良好的靈敏性和特異性，在液體奶、嬰配奶粉和肉及肉類制品樣品中，該方法與國標(biāo)法相比呈現(xiàn)了良好的一致性和準(zhǔn)確度。鑒于該方法具有操作簡單、耗時短的特點，因此該方法適用于公司企業(yè)進行沙門氏菌的快速檢測，具有較好的可推廣性。