龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉的研制及其體外調(diào)節(jié)腸道菌群作用

黃菲，周文君，，易陽(yáng)，張名位，張瑞芬，劉磊，賈栩超，陳燕霞，池建偉*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610）（2.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

腸道菌群與人體健康緊密相關(guān)，腸道菌群失衡不僅會(huì)誘發(fā)腸道炎癥，影響機(jī)體免疫，還會(huì)參與其他一些疾病如肥胖、糖尿病的發(fā)病過(guò)程[1，2]。目前，腸道菌群的調(diào)節(jié)制劑主要集中在增加益生菌的攝入。然而，益生菌存在存活率低、貨架期短、在胃液中不耐受、定殖困難等問(wèn)題。益生元作為一種調(diào)節(jié)腸道菌群的膳食補(bǔ)充劑，可在一定程度上緩解腸道菌群失調(diào)問(wèn)題。目前市場(chǎng)上的益生元產(chǎn)品主要為功能性低聚糖類(lèi)產(chǎn)品，其他類(lèi)型的益生元產(chǎn)品缺乏。植物多糖作為一種新型益生元，其調(diào)節(jié)腸道菌群的功效逐漸被人們認(rèn)識(shí)。開(kāi)展植物多糖益生元及相應(yīng)產(chǎn)品研發(fā)可豐富益生元產(chǎn)品類(lèi)型，對(duì)提高人體健康水平具有重要的意義。

龍眼、枸杞和紅棗都是典型的食藥同源資源，具有補(bǔ)虛長(zhǎng)智、益精明目、養(yǎng)血安神等功效，研究發(fā)現(xiàn)多糖是其主要功能因子，龍眼、枸杞和紅棗的改善腸道功能、免疫調(diào)節(jié)等功效與其多糖調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)[3-5]。龍眼多糖、枸杞多糖、紅棗多糖作為潛在的天然益生元，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)短鏈脂肪酸生成，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道免疫的作用。本研究在前期發(fā)現(xiàn)龍眼多糖、枸杞多糖和紅棗多糖具有協(xié)同益生活性的基礎(chǔ)上[6]，擬以龍眼、枸杞和紅棗為原料，開(kāi)發(fā)一款具有調(diào)節(jié)腸道菌群功效的營(yíng)養(yǎng)餐粉。

龍眼干、枸杞干、紅棗干具有高糖高粘特點(diǎn)，難以直接制粉。因此，本研究首先通過(guò)添加大豆蛋白粉、抗性糊精、乳清蛋白等輔料，采用冷凍超微粉碎制得復(fù)合果粉，進(jìn)一步采用混料設(shè)計(jì)輔以其他營(yíng)養(yǎng)配料，以流動(dòng)性、穩(wěn)定性、感官評(píng)分等為考察指標(biāo)，研發(fā)龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉，并評(píng)價(jià)其調(diào)節(jié)腸道菌群的功效。旨在為消費(fèi)者提供一種具有調(diào)節(jié)腸道菌群功效的營(yíng)養(yǎng)餐粉，為相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍眼干產(chǎn)地廣東，品種為“儲(chǔ)良”；枸杞干產(chǎn)地寧夏，品種為“寧夏枸杞”；紅棗干產(chǎn)地新疆，品種為“灰棗”，以上三種原料購(gòu)自廣州天平架水果市場(chǎng)；大米膨化粉、抗性糊精、麥芽糊精、乳清蛋白、大豆分離蛋白、全脂奶粉、菊粉，廣州力衡臨床營(yíng)養(yǎng)品有限公司；植物脂肪粉，青島海智源生命科技有限公司；乙酸、丙酸、正丁酸（色譜純標(biāo)準(zhǔn)品），上海麥克林生化科技有限公司；Solution I快速連接液，日本Takara公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

GHRH-20熱泵干燥機(jī)，廣東省農(nóng)業(yè)機(jī)械研究所；XDW-6B1振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)，濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司；SX2-5-12N馬弗爐，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SOX416脂肪測(cè)定儀，德國(guó)Gerhardt分析儀器有限公司；Bio Tek Gen5酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；Biofuge Stratos Sorvall高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；StarchMaster2 RVA快速粘度儀，瑞典Perten（波通）公司；GC-2010Plus氣相色譜儀，日本島津公司；CFX96定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰公司；K5500紫外分光光度計(jì)，北京凱奧公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合果粉粉碎工藝優(yōu)化

根據(jù)前期發(fā)現(xiàn)龍眼多糖、枸杞多糖和紅棗多糖具有協(xié)同益生活性的最佳質(zhì)量配比（龍眼多糖:枸杞多糖:紅棗多糖=2:3:1）及其多糖得率（龍眼多糖得率1.59%，枸杞多糖得率1.84%，紅棗多糖得率4.07%）計(jì)算龍眼干、枸杞干和紅棗干的質(zhì)量比為3.59:4.60:1[6]。將3種原料混合后，選擇大米膨化粉、抗性糊精、麥芽糊精、乳清蛋白或大豆分離蛋白作為輔料。將原料與輔料按一定比例配比，進(jìn)行冷凍超微粉碎，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化制粉工藝。選擇原輔料質(zhì)量配比與冷凍超微粉碎時(shí)間為變量，具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，以過(guò)篩率和吸濕率為考察指標(biāo)，利用L25（56）正交表設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)復(fù)合果粉的過(guò)篩率和吸濕率，根據(jù)公式（1）和（2）計(jì)算綜合評(píng)分，以綜合評(píng)分作為考察指標(biāo)優(yōu)化制粉工藝[7]。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and their levels of orthogonal test

1.2.2 龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉的配方優(yōu)化

采用軟件Design Expert 8.0.6中D-最優(yōu)混料試驗(yàn)（D-optimal）設(shè)計(jì)，固定復(fù)合果粉為50 g，配料為50 g，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定配料中全脂奶粉、植物脂肪粉、大米膨化粉和麥芽糊精的添加水平范圍，即各輔料占配料的質(zhì)量比值范圍，結(jié)合軟件設(shè)計(jì)得到的 20個(gè)配方，采用綜合評(píng)分法對(duì)不同配方營(yíng)養(yǎng)餐粉的流動(dòng)性、粘結(jié)性、水溶性、吸水性、持油能力、粘度、穩(wěn)定性、分散穩(wěn)定時(shí)間、感官評(píng)分進(jìn)行權(quán)重評(píng)分。混料試驗(yàn)因素和水平范圍見(jiàn)表2。

表2 混料試驗(yàn)因素和水平范圍（質(zhì)量比值）Table 2 Factors and their levels of mixture design test

1.2.3 粉體特性測(cè)定

1.2.3.1 過(guò)篩率測(cè)定

過(guò)篩率可以表示粉體顆粒的粒徑大小，間接反映粉體物料的結(jié)塊性。過(guò)篩率越小，說(shuō)明粉體顆粒粒徑越大，粉體物料結(jié)塊程度越嚴(yán)重。

在環(huán)境相對(duì)濕度40%、溫度25 ℃條件下，準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g樣品，通過(guò)90目標(biāo)準(zhǔn)篩，稱(chēng)量篩下物重量[8]。

1.2.3.2 吸濕率測(cè)定

吸濕率反映粉劑產(chǎn)品在貯存過(guò)程中，由于吸收環(huán)境中水分而導(dǎo)致結(jié)塊的程度。吸濕率越小說(shuō)明產(chǎn)品越不易吸收水分，產(chǎn)品質(zhì)量越穩(wěn)定。

用恒重稱(chēng)量皿準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g樣品，打開(kāi)蓋子置于內(nèi)有NaCl飽和溶液的干燥器中（相對(duì)濕度=57.28%），于25 ℃放置24 h[9]。

1.2.3.3 流動(dòng)性和粘結(jié)性測(cè)定

參照 Carr[10]和 Hausner[11]等人的方法測(cè)定不同配比營(yíng)養(yǎng)餐粉的流動(dòng)性和粘結(jié)性。取一定量的樣品，倒入預(yù)先稱(chēng)重的25 mL量筒中，加樣品至25 mL時(shí)記錄此時(shí)粉體體積數(shù)V1（mL），將量筒置于渦旋振動(dòng)器上振動(dòng)2 min以排除顆粒間的間隙，記錄此時(shí)粉體體積數(shù)V2（mL）。以Carr’s指數(shù)（Carr Index，CI）和Hausner比（Hausner Ratio，HR）表示的粉末流動(dòng)性和粘結(jié)性分級(jí)見(jiàn)表3，不同配比營(yíng)養(yǎng)餐粉的流動(dòng)性和粘結(jié)性指數(shù)根據(jù)CI和HR計(jì)算，計(jì)算公式如下：

表3 基于CI和HR指標(biāo)分級(jí)的粉末流動(dòng)性和粘結(jié)性Table 3 Classification of powder flowability and cohesiveness based on Carr index and Hausner ratio

1.2.3.4 吸水性和水溶性測(cè)定

參考 Anderson等人[12]的方法測(cè)定不同配比營(yíng)養(yǎng)餐粉的吸水性指數(shù)（Water absorbability index，WAI）和水溶性指數(shù)（Water solubility index，WSI）。稱(chēng)取2.5 g的樣品（M1），放入50 mL離心管（M2）中，再加入30 mL蒸餾水，渦旋振動(dòng)均勻后，以200 r/min速率振搖30 min，然后以4000 r/min，離心15 min，上清液到入恒重干燥皿（M3）中，放入105 ℃烘箱中干燥至恒重（M4）；離心后的沉淀物直接稱(chēng)重（M5）。WAI和WSI的計(jì)算公式如下：

式中：

M1——樣品質(zhì)量，g；

M2——離心管質(zhì)量，g；

M3——恒重干燥皿質(zhì)量，g；

M4——上清液干燥后和干燥皿的質(zhì)量，g；

M5——沉淀物和離心管質(zhì)量，g。

1.2.3.5 粘度測(cè)定

樣品粘度的測(cè)定：參考GB/T 24852-2010，采用快速粘度儀法測(cè)定。

1.2.3.6 穩(wěn)定性測(cè)定

稱(chēng)取10 g樣品置于150 mL量筒中，量取80～90 ℃的蒸餾水100 mL倒入量筒中攪拌，靜置120 min，測(cè)量上清液體積h和沖調(diào)液總體積H，得到?jīng)_調(diào)穩(wěn)定性K值，K值越小，穩(wěn)定性越高[13]。K按照下式計(jì)算：

式中：

h——上清液體積，mL；

H——沖調(diào)液總體積，mL。

1.2.3.7 分散穩(wěn)定時(shí)間

取2.5 g樣品，溶于25 mL蒸餾水中，攪拌震蕩均勻，轉(zhuǎn)移到100 mL量筒內(nèi)，記錄開(kāi)始靜置時(shí)間到溶液分層時(shí)間；重復(fù)三次，取其平均值，作為該樣品分散穩(wěn)定時(shí)間[14]。

1.2.3.8 感官評(píng)價(jià)

將龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉與 80 ℃的蒸餾水以1:4（g/mL）的比例沖調(diào)攪拌1～2 min后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，指標(biāo)包括色澤與形態(tài)、香氣、口感和滋味。感官評(píng)價(jià)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表4。

表4 感官評(píng)價(jià)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Sensory evaluation scoring criteria

1.2.3.9 綜合評(píng)分

參照劉玉環(huán)[15]和何夢(mèng)影[16]等研究中的評(píng)分方法，對(duì)產(chǎn)品吸水性、水溶性、粘度、穩(wěn)定性、分散穩(wěn)定時(shí)間、感官評(píng)價(jià)的權(quán)重進(jìn)行分值分配。水溶性和吸水性主要影響營(yíng)養(yǎng)餐粉的沖調(diào)特性；穩(wěn)定性和分散穩(wěn)定時(shí)間主要是考察營(yíng)養(yǎng)餐粉沖調(diào)后的穩(wěn)定性能；結(jié)合流動(dòng)性、粘結(jié)性、黏度、感官評(píng)分等指標(biāo)來(lái)整體評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)餐粉的產(chǎn)品特性。由于流動(dòng)性和粘結(jié)性的模型并不顯著，所以不考察其分值，僅作為營(yíng)養(yǎng)餐粉的參考指標(biāo)。吸水性和水溶性作為粉體沖調(diào)性的重要指標(biāo)，提高其權(quán)重；分散穩(wěn)定時(shí)間直接反映了粉體沖調(diào)后的穩(wěn)定性能，感官品質(zhì)是營(yíng)養(yǎng)餐粉重要的商業(yè)指標(biāo)，也分別提高權(quán)重。根據(jù)綜合評(píng)分方法：

（1）吸水性指數(shù)評(píng)分（滿(mǎn)分20分）的計(jì)算公式為：

式中：

WAIact——實(shí)測(cè)吸水性指數(shù)值，g/g；

WAImax——所測(cè)吸水性指數(shù)的最大值，g/g。

（2）水溶性指數(shù)評(píng)分（滿(mǎn)分20分）的計(jì)算公式為：

式中：

WSIact——實(shí)測(cè)水溶性指數(shù)值，%；

WSImax——所測(cè)水溶性指數(shù)的最大值，%。

（3）粘度評(píng)分（滿(mǎn)分10分）的計(jì)算公式為：

式中：

Rmin——所測(cè)粘度的最小值，RUV；

Ract——實(shí)測(cè)粘度值，RUV。

（4）穩(wěn)定性評(píng)分（滿(mǎn)分10分）的計(jì)算公式為：

式中：

Kact——實(shí)測(cè)穩(wěn)定性值；

Kmax——所測(cè)穩(wěn)定性的最大值。

（5）分散穩(wěn)定時(shí)間評(píng)分（滿(mǎn)分20分）的計(jì)算公式為：

式中：

Tact——實(shí)測(cè)分散穩(wěn)定時(shí)間值，min；

Tmax——所測(cè)分散穩(wěn)定時(shí)間的最大值，min。

（6）感官評(píng)分（滿(mǎn)分20分）的計(jì)算公式為：

式中：

Gact——實(shí)測(cè)感官評(píng)分；

Gmax——所測(cè)感官評(píng)分的最大值。

（7）綜合評(píng)分（滿(mǎn)分100分）的計(jì)算公式為：

1.2.4 營(yíng)養(yǎng)餐粉成分檢測(cè)

（1）水分含量的測(cè)定：參考 GB 5009.3-2016，105 ℃烘箱干燥法。

（2）粗蛋白含量的測(cè)定：參考GB 5009.5-2016，凱氏定氮法。

（3）粗脂肪含量的測(cè)定：參考GB 5009.6-2016，索氏抽提法。

（4）灰分含量的測(cè)定：參考GB 5009.4-2016，灼燒法。

（5）碳水化合物含量的測(cè)定：

（6）多糖含量：參考SN-T 4260-2015，苯酚-硫酸法[17]。

（7）總熱量參考衛(wèi)生部印發(fā)的《食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽管理規(guī)范》[18]，計(jì)算公式見(jiàn)式（18）：

式中：

C——碳水化合物，g；

P——蛋白質(zhì)，g；

F——脂肪，g。

1.2.5 營(yíng)養(yǎng)餐粉體外模擬消化酵解

1.2.5.1 體外模擬消化

模擬人體消化液參照Mills[19]和Maccaferri[20]的方法制備：模擬口腔液：將3.9 g淀粉酶溶于1.25 mL 1 mmol/L CaCl2溶液。模擬胃液：將3.1 g NaCl、1.1 g KCl、0.15 g CaCl2、0.6 g NaHCO3溶于1 L蒸餾水中制得胃電解液；在150 mL胃電解液中添加35.40 g豬胃蛋白酶和1.5 mL 1 mol/L CH3COONa，用0.5 mol/L HCl調(diào)pH=2.0得到模擬胃液。模擬小腸液：將5.4 g NaCl、0.65 g KCl、0.25 g CaCl2溶于1 L蒸餾水中制得小腸電解液；在25 mL小腸電解液中添加50 mL 4%豬膽汁鹽，25 mL 7%豬胰腺胰酶上清液，13 g胰蛋白酶，用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH=7.0得到模擬小腸液。

模擬體外消化參照龔凌霄[21]和柳芳偉[22]的方法進(jìn)行：將12 g龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉溶于200 mL蒸餾水，加入7 mL模擬口腔液，在37 ℃水浴中振搖30 min進(jìn)行模擬口腔消化；再用 6 mol/L HCl調(diào)pH=2.0，加入5 mL模擬胃液，在37 ℃水浴中振搖2 h進(jìn)行模擬胃消化；再用6 mol/L NaOH調(diào)pH=6.8，加入25 mL模擬小腸液，在37 ℃水浴中振搖3 h后倒入1 ku的透析袋中透析14 h進(jìn)行模擬小腸消化；將消化后的營(yíng)養(yǎng)餐粉凍干得到消化粉。

1.2.5.2 體外模擬酵解

生長(zhǎng)培養(yǎng)基制備：將2 g蛋白胨、2 g酵母提取物、0.1 g NaCl、0.04 g K2HPO4、0.04 g KH2PO4、0.01 g MgSO4·7H2O、0.01 g CaCl2、2 g NaHCO3、0.5 g L-鹽酸半胱氨酸、0.5 g膽汁鹽、1 mg刃天青和2 mL吐溫80溶于1 L蒸餾水中，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH=6.8，經(jīng)高壓滅菌冷卻后備用。

糞便菌懸液制備：選取兩位志愿者（普通飲食，腸道健康，至少 3個(gè)月沒(méi)有抗生素治療史），每人取10 g糞便，將兩人的糞便混合均勻后使用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋?zhuān)╓:V=1:10）后用4層紗布過(guò)濾得到人體糞便菌懸液。

體外酵解參照Guergoletto[23]的方法進(jìn)行：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（Black Control，BC）、陽(yáng)性對(duì)照組（Positive Control，PC）、龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉組（CF）。空白對(duì)照組添加蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照組添加菊粉，餐粉組為添加消化后的龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉，各組的添加量均為1%。分別將各組0.1 g樣品加入9 mL的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并加入1 mL人體糞便菌懸液，培養(yǎng)24 h，分別于0、6、12、24 h取樣，4000 r/min離心10 min，沉淀和上清液分別于-80 ℃保存待測(cè)。

1.2.5.3 有益菌數(shù)量的測(cè)定

參考石夢(mèng)玄[24]的方法采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）對(duì)樣品中乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、阿克曼氏菌等細(xì)菌進(jìn)行絕對(duì)定量。以上述4種細(xì)菌的特異性擴(kuò)增引物（表5）采用基因克隆方法構(gòu)建相應(yīng)細(xì)菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，梯度稀釋后制作 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

以總DNA為模板，利用特異性引物（表5）進(jìn)行qPCR測(cè)定。擴(kuò)增體系（20 μL）：正、反向引物各0.5 μL，2×SsoRobust Taq PCR ProMix 10 μL，模板DNA 1 μL，滅菌水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性 95 ℃ 10 s；退火 60 ℃ 30 s；延伸 72 ℃ 10 s；35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)延伸72 ℃ 5 min。根據(jù)各細(xì)菌的特異性基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出各個(gè)樣品中不同細(xì)菌的特異性基因拷貝數(shù)，以每毫升酵解液中所含的不同細(xì)菌的特異性基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)（lg copies/μL）表示菌濃度。

表5 各基因引物序列Table 5 Sequence of primers for intestinal microbiota

1.2.5.4 短鏈脂肪酸的測(cè)定

短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：精確量取一定量的乙酸、丙酸、正丁酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合均勻后添加適量的雙蒸水，梯度稀釋成不同濃度，每個(gè)濃度分別取1 mL，過(guò)0.22 μm水相濾膜后進(jìn)行氣相色譜分析，用雙蒸水作為空白對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程。

樣品測(cè)定：將酵解上清液過(guò)0.22 μm水相濾膜后進(jìn)行氣相色譜分析。氣相色譜分析條件如下：選用DB-FFAP色譜柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器；載氣為N2，N2的流速30.0 mL/min，空氣的流速400 mL/min，H2流速為30 mL/min，分流比為1:5。柱前壓為136.5 kPa，氣化室溫度、檢測(cè)器溫度、進(jìn)樣口溫度以及柱溫均為240 ℃；每個(gè)樣品的進(jìn)樣體積是1 μL，進(jìn)樣前用溶劑清洗8次，進(jìn)樣后用溶劑清洗10次，每個(gè)樣品均重復(fù)測(cè)定3次。色譜柱升溫程序：先升溫至70 ℃并保持1 min，然后以10 ℃/min的速度升溫至220 ℃保持 5 min，最后以10 ℃/min的速度升溫至240 ℃保持14 min。每次測(cè)定時(shí)間42.47 min。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算每個(gè)樣品中各短鏈脂肪酸和總短鏈脂肪酸含量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，通過(guò)SPSS 19.0.0軟件分析數(shù)據(jù)，并用 Duncan檢驗(yàn)比較組間差異，以不同小寫(xiě)字母表示（p＜0.05）。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用Origin 9.0和Excel軟件制表作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合果粉的粉碎工藝

復(fù)合果粉粉碎工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見(jiàn)表6和表7，結(jié)果表明對(duì)復(fù)合果粉粉體影響最大的是輔料種類(lèi)，其次為原輔料質(zhì)量配比，最后為冷凍超微粉碎時(shí)間。粉體效果最好的方案為A4B3C3，即輔料為乳清蛋白，原輔料質(zhì)量比為1:1.5，冷凍超微粉碎時(shí)間為150 s。該方案并未列入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定最佳方案下復(fù)合果粉的過(guò)篩率為91.24%、吸濕率為5.01%。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析Table 6 Orthogonal experiment result and result analysis

表7 正交試驗(yàn)的方差分析表Table 7 Variance analysis table of score

2.2 營(yíng)養(yǎng)餐粉配方優(yōu)化的混料試驗(yàn)

混料設(shè)計(jì)中不同配方營(yíng)養(yǎng)餐粉粉體特性及綜合評(píng)分見(jiàn)表8，從表中可以看出，20個(gè)配方餐粉的CI指數(shù)在27.52%～39.26%，平均值為31.26%，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)餐粉的流動(dòng)性一般；HR比在 0.61%～0.72%，平均值為0.69%，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)餐粉的粘結(jié)性較低；WAI在1.72～3.57 g/g，平均值為2.45 g/g，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)餐粉一般可吸收自身兩倍重量的水；WSI在 56.28%～78.66%，平均值為68.92%，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)餐粉至少有一半以上的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可溶于水；粘度在10～48 RVU，平均值為25.25 RVU，說(shuō)明不同配比的營(yíng)養(yǎng)餐粉粘度差異較大；K值范圍是0.72～0.96，平均值為0.88，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)餐粉沖調(diào)120 min仍然較為穩(wěn)定；分散穩(wěn)定時(shí)間范圍是34.10～59.10 min，平均值為47.12 min，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)餐粉沖調(diào)半小時(shí)后仍不會(huì)出現(xiàn)沉積；感官評(píng)價(jià)得分范圍是 66～95，平均值為78.33，說(shuō)明不同配比的營(yíng)養(yǎng)餐粉的感官特性差異較大。

表8 D-optimal試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 D-optimal mixture design andthe result

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立指標(biāo)模型概況如表9所示。流動(dòng)性和粘結(jié)性的回歸方程p值均為0.48，不具有顯著性（p＞0.05）。水溶性、分散穩(wěn)定時(shí)間、吸水性、粘度、穩(wěn)定性、感官評(píng)價(jià)的回歸方程，具有顯著性（p＜0.05）。因此，在綜合評(píng)分時(shí)，對(duì)不具有顯著性的指標(biāo)不考察其分值，僅作為營(yíng)養(yǎng)餐粉的參考指標(biāo)。對(duì)綜合評(píng)分用Quadratic回歸方程法進(jìn)行分析，建立綜合評(píng)分的回歸模型，方差分析結(jié)果見(jiàn)表10。通過(guò)方差分析得到模型的F 值是5.2929＞F0.05（9，10）=4.9424，這表明模型極其顯著（p＜0.01），能夠很好的描述各因素與綜合評(píng)分之間的關(guān)系。同時(shí)，失擬項(xiàng)F值0.2796及其P值0.9059，表明失擬項(xiàng)并不顯著。決定系數(shù)（R2）為0.8265，這表明模型中82.65%的穩(wěn)定性變化歸因于自變量（A、B、C和D）。校正后的相關(guān)系數(shù)RAdj2=0.6703，表明模型方程能較好地?cái)M合綜合評(píng)分和配方之間的關(guān)系。校正后本實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)為3.48%，說(shuō)明置信度較高，這些結(jié)果證明所建模型足以表現(xiàn)出各條件參數(shù)之間的真實(shí)關(guān)系，可以用來(lái)預(yù)測(cè)綜合評(píng)分。通過(guò)擬合得到回歸方程：

表9 指標(biāo)模型概況Table 9 Summary of the model parameters

表10 綜合評(píng)分回歸模型的方差分析表Table 10 Variance analysis table of comprehensive score regression model

對(duì)回歸方程進(jìn)行分析計(jì)算，得到龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉混料設(shè)計(jì)的最佳配方為復(fù)合果粉添加量為50%，全脂奶粉添加量為 5%，植物脂肪粉添加量為5%，大米膨化粉添加量為 10%，麥芽糊精添加量為30%，選用該配比進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，三次平行試驗(yàn)得到，營(yíng)養(yǎng)餐粉的水溶性指數(shù)、吸水性指數(shù)、粘度、穩(wěn)定性、分散穩(wěn)定時(shí)間、感官評(píng)分分別為77.74%、1.88 g/g、16 RVU、0.97、68.50 min、98.00，綜合評(píng)分（90.52）與理論值（88.62）較為接近，重復(fù)性好，說(shuō)明該模型得到的數(shù)據(jù)結(jié)論準(zhǔn)確可靠。

2.3 龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉的營(yíng)養(yǎng)成分

龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉的營(yíng)養(yǎng)成分如表11所示，該營(yíng)養(yǎng)餐粉的蛋白質(zhì)主要由乳清蛋白粉和全脂奶粉提供，富含優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源；過(guò)多的脂肪攝入會(huì)導(dǎo)致肥胖等一系列疾病的發(fā)生，該營(yíng)養(yǎng)餐粉的脂肪供能比遠(yuǎn)小于《中國(guó)居民膳食指南》[25]中規(guī)定的30%；碳水化合物的供能比與60%相近，符合從一歲小朋友到八十歲以上的老人的營(yíng)養(yǎng)需求；食鹽攝入過(guò)高會(huì)引起人體高血壓、胃癌或腦卒中的發(fā)生，該營(yíng)養(yǎng)餐粉低鈉少鹽，適合多種人群食用。此外，該餐粉中多糖含量為1.50 g/100 g，根據(jù)前期研究復(fù)合多糖益生活性效果可推測(cè)該營(yíng)養(yǎng)餐粉具有促進(jìn)益生菌增殖功效。

表11 龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉的成分及供能比Table 11 Composition and energy supply ratio of nutritious meal replacement powder composed with longan， goji and jujube

2.4 營(yíng)養(yǎng)餐粉體外對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

雙歧桿菌和乳酸菌是腸道內(nèi)重要的益生菌；擬桿菌是健康人體腸道菌群中的主導(dǎo)菌種，為人體提供營(yíng)養(yǎng)并維持腸道的正常生理功能；阿克曼氏菌能改善腸道屏障，是一種潛在益生菌[26]。因此，本研究采用體外模擬酵解模型分析龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉對(duì)腸道內(nèi)乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和阿克曼氏菌的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1所示。與空白組相比，龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均能顯著促進(jìn) 4種菌增殖，且在0～6 h期間，4種菌增殖速度較快，6～24 h逐漸趨于穩(wěn)定。龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉對(duì)乳酸桿菌的增殖效果在6 h和24 h與菊粉相當(dāng)，但在12 h低于菊粉（p＜0.05），但顯著高于空白對(duì)照組。龍眼-紅棗-枸杞營(yíng)養(yǎng)餐粉促雙歧桿菌增殖效果顯著強(qiáng)于菊粉，兩者均優(yōu)于空白對(duì)照組。3個(gè)發(fā)酵組中擬桿菌屬含量較高，其對(duì)擬桿菌促增殖效果為：龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉＞菊粉＞空白對(duì)照。3個(gè)發(fā)酵組中阿克曼氏菌屬豐度最低，菊粉和空白對(duì)照組中其增殖效果相當(dāng)，顯著低于龍眼-紅棗-枸杞營(yíng)養(yǎng)餐粉。由此表明，龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉對(duì)腸道益生菌有顯著的促增殖作用。

短鏈脂肪酸是腸道微生物代謝的主要產(chǎn)物，本研究分析了龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉酵解液中 SCFAs的種類(lèi)和含量，結(jié)果見(jiàn)表12。由表可知，在0 h時(shí)，空白對(duì)照組、餐粉組和菊粉陽(yáng)性對(duì)照組的SCFAs含量均較低，經(jīng)過(guò)24 h的發(fā)酵后，3組發(fā)酵產(chǎn)物中SCFAs含量表現(xiàn)不同程度的增加，其中餐粉組總短鏈脂肪酸含量由初始的 1.88 μL/mL提高為 8.22 μL/mL，提高了337.23%，與空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比，分別提高了262.11%和38.15%。與空白組相比，餐粉能顯著提高乙酸、丙酸和丁酸含量，且提高程度為丁酸＞乙酸＞丙酸（p＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照相比，餐粉中丁酸和乙酸含量顯著提高（p＜0.05），丙酸含量相對(duì)較少。由上可知，龍眼-枸杞-紅棗餐粉能顯著促進(jìn)短鏈脂肪酸增加，尤其是丁酸和乙酸。乙酸是腸道內(nèi)含量最多的一種短鏈脂肪酸，主要給機(jī)體心臟、肌肉、大腦等組織供能，參與脂肪生成和糖異生過(guò)程[27]；丁酸是腸上皮細(xì)胞的重要能量來(lái)源，在調(diào)節(jié)結(jié)腸細(xì)胞、T細(xì)胞增殖，腸粘膜免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[28]。因而，龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉對(duì)人體健康有較好的促進(jìn)作用。

表12 體外發(fā)酵各組短鏈脂肪酸種類(lèi)及含量變化Table 12 Changes of species and content of SCFAs of each group in vitro fermentation

3 結(jié)論

龍眼干、枸杞干、紅棗干的粉碎工藝為添加乳清蛋白輔料，原輔料質(zhì)量配比為1:1.5，冷凍超微粉碎時(shí)間為150 s，獲得復(fù)合果粉的過(guò)篩率為91.24%，吸濕率為5.01%。混料設(shè)計(jì)確定營(yíng)養(yǎng)餐粉的配方比例為復(fù)合果粉50%、全脂奶粉5%、植物脂肪粉5%、大米膨化粉10%、麥芽糊精30%。該配方得到的龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉沖調(diào)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、感官較佳、營(yíng)養(yǎng)均衡。經(jīng)體外模擬消化酵解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該營(yíng)養(yǎng)餐粉能顯著促進(jìn)腸道乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和阿克曼氏菌屬等益生菌增殖，促進(jìn)乙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物含量增加，具有顯著調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。關(guān)于該營(yíng)養(yǎng)餐粉的有效劑量以及人體的推薦劑量有待進(jìn)一步研究。本研究研制的龍眼-枸杞-紅棗營(yíng)養(yǎng)餐粉營(yíng)養(yǎng)均衡，具有調(diào)節(jié)腸道菌群功效，為今后相關(guān)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定的理論指導(dǎo)和參考價(jià)值。