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    超聲誘導(dǎo)對發(fā)芽花生的轉(zhuǎn)錄組分析及苯丙烷類合成相關(guān)基因的挖掘

    2022-03-07 07:00:38解夢汐于淼魯明付欣張良晨石太淵
    現(xiàn)代食品科技 2022年2期
    關(guān)鍵詞:丙烷白藜蘆醇花生

    解夢汐,于淼,魯明,付欣,張良晨,石太淵

    (遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品與加工研究所,遼寧 沈陽 110034)

    花生(Arachis hypogaeaL.)又名“長生果”,是我國一種重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物,含有大量蛋白質(zhì)、膳食纖維和不飽和脂肪酸。花生發(fā)芽過程中總酚含量和反式白藜蘆醇等生物活性成分增加,具有高抗氧化活性,因此發(fā)芽花生被專家視為理想的新型功能芽菜品種,也稱花生芽[1]?;ㄉ诎l(fā)芽過程中通過調(diào)控苯丙烷代謝途徑提高苯丙烷類化合物如酚酸、白藜蘆醇和黃酮類物質(zhì)的含量。大量研究證實了酚類物質(zhì)的產(chǎn)生有助于植物應(yīng)對多種外界生物和非生物的脅迫,而這些物質(zhì)的產(chǎn)生涉及植物次生代謝過程信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控作用[2,3]。

    在實際生產(chǎn)中,為解決花生芽生產(chǎn)周期長、活性成分富集消減速度慢等問題,國內(nèi)外學(xué)者通過利用物理場誘導(dǎo)如超聲處理[4-6]、紫外照射[7,8]、外源添加[9]、高壓靜電場[10]等手段對花生或發(fā)芽花生的生物活性成分進(jìn)行富集。Sales等[8]研究表明,經(jīng)過超聲誘導(dǎo)的花生總酚含量從0.84 mg GAE/g提升至1.22~1.89 mg GAE/g;Yu等[4,5]研究表明超聲誘導(dǎo)能夠顯著提高發(fā)芽花生的白藜蘆醇含量,且隨著超聲頻率和發(fā)芽時長而變化,此現(xiàn)象也與花生品種的差異密切相關(guān)。但是未見超聲誘導(dǎo)對發(fā)芽花生苯丙烷類活性物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控的研究報道。

    為了加強(qiáng)對發(fā)芽花生更深層次的開發(fā)利用,本研究選用超聲誘導(dǎo)處理后的發(fā)芽花生作為研究對象進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并利用生物信息學(xué)方法對其測序數(shù)據(jù)進(jìn)行功能注釋分類、代謝通路分析,探討超聲誘導(dǎo)處理對發(fā)芽花生苯丙烷類合成相關(guān)基因的表達(dá)的作用。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料及超聲處理

    材料于2020年6月采自遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院沙地治理研究所花生研究基地,所選品種為阜花23號。選取大小均一且無破損的200粒花生籽粒放在紗布上,用體積分?jǐn)?shù)為 1%的次氯酸鈉(次氯酸鈉:水=1:100)浸泡消毒20 min,再用純凈水沖洗三次,避光浸泡6 h后,連同紗布放在燒杯里,燒杯加水沒過花生,放入超聲儀器中進(jìn)行超聲處理。超聲參數(shù)設(shè)置為 35 ℃、30 min、240 W(60%)、85 kHz。處理后,種子放置在托盤上,底部鋪上濾紙,鋪上紗布然后另一半紗布蓋上進(jìn)行避光發(fā)芽。經(jīng)過72 h后,取空白對照組和超聲誘導(dǎo)下的花生胚芽置于液氮中快速冷凍,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫椭辽虾C兰镉邢薰尽?/p>

    1.2 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建和測序

    從組織樣品中提取total RNA,利用Nanodrop 2000對所提RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,Agilent 2100測定RIN值。樣品檢測合格后利用帶有 Oligo(dT)的磁珠與 ployA 進(jìn)行A-T堿基配對,加入fragmentation buffer,可以將mRNA隨機(jī)斷裂,通過磁珠篩選分離出300 bp左右的小片段。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,加入六堿基隨機(jī)引物(random hexamers),以mRNA為模板反轉(zhuǎn)合成一鏈cDNA,隨后進(jìn)行二鏈合成,形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。然后加入End Repair Mix將其補(bǔ)成平末端,隨后在3’末端加上一“A”堿基,用于連接Y字形的接頭。最后通過PCR擴(kuò)增,純化PCR產(chǎn)物,得到最終文庫。文庫質(zhì)量檢測合格后,不同文庫按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行 pooling,利用Illumina平臺進(jìn)行測序(PE文庫,讀長2×150 bp)。

    1.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

    使用軟件SeqPrep去除reads中的接頭序列,去除由于接頭自連等原因?qū)е聸]有插入片段的reads;將序列末端(3’端)低質(zhì)量(質(zhì)量值小于30)的堿基修剪掉,如剩余序列中仍然有質(zhì)量值小于10的堿基,則將整條序列剔除,否則保留;去除含N比率超過10%的reads;舍棄去adapter及質(zhì)量修剪后長度小于50 bp的序列得到clean data,使用TopHat2(http://tophat.cbcb.umd.edu/)軟件進(jìn)行序列比對分析。

    1.4 差異表達(dá)基因的篩選

    以樣品KB組作為對照樣品,與樣品CS進(jìn)行基因表達(dá)量的比較。將錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,F(xiàn)DR)≤0.001且差異倍數(shù)(fold change)≥2作為DEG的篩選標(biāo)準(zhǔn),滿足此篩選標(biāo)準(zhǔn)的基因即為DEG。

    1.5 DEG的功能注釋

    通過BLAST軟件將篩選到的所有DEG分別與NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Non-redundant Protein Sequence Database,NR)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫、基因本體論(GeneOntology,GO)、蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫(COG)、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot)、蛋白數(shù)據(jù)庫(TrEMBL)和非冗余蛋白序列庫(NR)等一系列數(shù)據(jù)庫,并對基因進(jìn)行功能注釋、分析以及統(tǒng)計。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 發(fā)芽花生轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    表1 發(fā)芽花生轉(zhuǎn)錄組測序統(tǒng)計Table 1 Transcriptomic sequencing statistics of peanut sprout

    將構(gòu)建好的發(fā)芽花生轉(zhuǎn)錄組文庫通過HiSeq 2000高通量測序,得到超聲處理 CS組和空白對照組 KB的三次生物學(xué)重復(fù)間的相關(guān)系數(shù)均大于0.9,ReadSum的平均值分別為46208369條和49367041條,數(shù)據(jù)過濾后超聲處理CS組和空白對照組KB的平均總堿基數(shù)分別是6.98 Gb和7.45 Gb,GC含量分別為45.00%和45.13%,這些序列的Q20和Q30分別在98%和94%以上。以上數(shù)據(jù)說明全部樣品轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高,可為后續(xù)的差異表達(dá)基因分析提供了科學(xué)的依據(jù)。

    2.2 發(fā)芽花生轉(zhuǎn)錄組功能注釋

    將組裝獲得的所有基因和轉(zhuǎn)錄本與 NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG六個常用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(圖1),最終獲得有注釋信息的表達(dá)基因數(shù)目為 48660,各個數(shù)據(jù)庫注釋到的表達(dá)基因有較大的區(qū)別,其中NR數(shù)據(jù)庫注釋到47998個表達(dá)基因,占比98.64%,GO和COG分別有27880個和46411個表達(dá)基因,占比57.30%和95.38%,得到注釋最少的數(shù)據(jù)庫為KEGG,僅有22200個表達(dá)基因,占比為 45.62%。長度位于 300~1000 bp和長度≥1000 bp的數(shù)目分別有18310個和19233個(表2)。

    表2 基因功能注釋統(tǒng)計Table 2 Functional annotation of ref genes

    2.3 花生芽響應(yīng)超聲誘導(dǎo)DEGs數(shù)目的分析

    為研究發(fā)芽花生響應(yīng)超聲誘導(dǎo)的基因表達(dá)情況,對超聲處理后的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析(圖2)。兩組樣品中共篩選出1104個DEGs,其中上調(diào)DEGs共有583個,用紅色點(diǎn)表示;下調(diào)DEGs共有521個,用綠色點(diǎn)表示;灰色點(diǎn)代表非差異表達(dá)基因。結(jié)果表明,上調(diào)DEGs的數(shù)目低于下調(diào)DEGs的數(shù)目。

    2.4 DEGs的蛋白聚類分析

    將DEGs和COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,并對DEGs的功能進(jìn)行預(yù)測和統(tǒng)計歸類,結(jié)果顯示,共有 14497條DEGs與數(shù)據(jù)庫中的基因相似度高。根據(jù)功能分類,可初步將花生種子轉(zhuǎn)錄組中的差異基因分為21類(圖3),數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),DEGs的COG功能涉及大多數(shù)的生命活動,其中種類全面,數(shù)量最多的是轉(zhuǎn)錄類的基因,其次是碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、重復(fù)和修復(fù)及翻譯后修飾、蛋白代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等類別;輔酶的運(yùn)輸和代謝類數(shù)量最少,只有4個;與油脂轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝相關(guān)的基因有654個;此外仍有643個DEGs未知功能類別(圖3)。

    2.5 基因功能分類分析

    對超聲誘導(dǎo)下發(fā)芽花生的DEGs進(jìn)行了GO富集分析,共分為生物進(jìn)程(biological process)、分子功能(molecular functions)和細(xì)胞組分(cellular component)三個大類。在DEGs富集數(shù)目的共33個亞類中(圖4),生物進(jìn)程注釋到13個分支,DEGs主要集中在細(xì)胞組成或生物發(fā)生和細(xì)胞進(jìn)程,分別有292個和241個基因功能得到注釋,說明細(xì)胞組分類的相關(guān)基因在超聲誘導(dǎo)花生發(fā)芽的生物進(jìn)程中起著非常重要的作用。富集在細(xì)胞組分的DEGs主要分為10個分支,其中細(xì)胞組分包含的基因數(shù)目最多,共有217個,其次是膜的組成部分。在分子功能的9個分支中,參與催化活性和涉及結(jié)合功能的基因數(shù)量遠(yuǎn)超過參與其他生物過程的基因數(shù),分別有338個和245個基因。

    2.6 DEGs的代謝通路富集分析

    為了進(jìn)一步探索DEGs的生物學(xué)功能,解析花生芽在超聲誘導(dǎo)下的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對 DEGs進(jìn)行了KEGG富集分析,共有327個DEGs富集到了97條通路中。在富集顯著的前20條代謝通路中(圖5),包含苯丙烷生物合成(24)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(15)、胞吞作用(12)、植物與病原體的相互作用(11)、黃酮類生物合成(10)、淀粉和蔗糖代謝(8)、核糖體(8)、剪接體(7)、亞油酸代謝(6)、磷酸肌醇代謝(6)、谷胱甘肽代謝(6)、甘油磷脂代謝(6)、錯配修復(fù)(6)、同源重組(6)、基因復(fù)制(6)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(5)、類胡蘿卜素的生物合成(5)、氨?;鵷RNA的生物合成(5)、抗壞血酸和藻酸鹽代謝(5)、α-亞麻酸代謝(5)、精氨酸和脯氨酸代謝(5)、氨基糖和核苷酸糖代謝(5)、糖酵解/糖異生(5)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(5)、核苷酸切除修復(fù)(5)等。富集分析結(jié)果說明花生芽通過代謝、合成次生代謝物等途徑參與超聲誘導(dǎo)的響應(yīng)。

    2.7 花生芽在超聲誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄因子分析

    轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物非生物脅迫抗性方面起著重要作用[11-13],本研究分析超聲誘導(dǎo)下花生芽的DEGs,共屬于48個轉(zhuǎn)錄因子家族。其中B3家族包含293個基因,其次是MYB家族288個、bHLH家族281個,MYB_related家族261個以及ERF家族210個,說明這些家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在發(fā)芽花生受超聲誘導(dǎo)下調(diào)控效果顯著。

    本研究發(fā)現(xiàn)B3轉(zhuǎn)錄因子是發(fā)芽花生在超聲處理下表達(dá)量變化最多的家族。研究表明已知MYB、B3、WRKY、bHLH、bZIP等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量變化能提高植物適應(yīng)逆境的能力[14]。其中B3家族是一類含有B3功能域的轉(zhuǎn)錄因子家族,在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,其功能域是一種可以和DNA特異結(jié)合且高度保守的結(jié)構(gòu)域[15]。B3家族轉(zhuǎn)錄因子除了有參與DNA結(jié)合B3結(jié)構(gòu)域外,還有其他保守的結(jié)構(gòu)域,包括AP2,生長素應(yīng)答因子,生長素/吲哚-3-乙酸等。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的基因家族之一,廣泛的參與了植物代謝、發(fā)育及對各種脅迫的應(yīng)答機(jī)制[16]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,廣泛參與植物生理生化過程,包括植物表皮組織細(xì)胞分化、外界環(huán)境因素響應(yīng)、激素應(yīng)答等[17]。研究表明,MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能多種多樣,對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要。例如,MYB轉(zhuǎn)錄因子可通過控制各個細(xì)胞分裂時期來實現(xiàn)對細(xì)胞周期的調(diào)控,也可通過調(diào)節(jié)植物次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)花青素、類黃酮等次生代謝產(chǎn)物的合成,在非生物脅迫和生物脅迫響應(yīng)中也扮演了重要的角色[15]。此外,MYB轉(zhuǎn)錄因子還能調(diào)控植株對植物激素的響應(yīng)[16]。

    2.8 花生芽在超聲誘導(dǎo)下DEGs的苯丙烷類生物合成途徑

    苯丙烷類生物合成途徑為DEGs富集數(shù)目最多的代謝通路,分析該調(diào)控途徑對研究玉米響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制具有重要意義(圖7)。發(fā)現(xiàn)共有21 DEGs得到富集,其中過氧化物酶(E1.11.1.7)注釋到10個,下調(diào)3個,上調(diào)7個;β-葡糖苷酶上調(diào)(EC3.2.1.21)1個;四氫大麻酸合酶上調(diào)1個;甘露醇脫氫酶上調(diào)2個;網(wǎng)狀氧化酶樣蛋白上調(diào)1個;4-香豆酸酯-CoA連接酶上調(diào)2個;亞精胺羥肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶上調(diào)1個;氰基β-葡萄糖苷酶上調(diào)1個,下調(diào)1個;咖啡酰-CoAO-甲基轉(zhuǎn)移酶上調(diào)2個;肉桂酰基-CoA還原酶上調(diào)2個。

    前人研究報道白藜蘆醇在植物體內(nèi)是以苯丙氨酸為底物,通過苯丙烷途徑生成[18],因此本研究所得的所有轉(zhuǎn)錄本與KEGG通路數(shù)據(jù)庫中的苯丙烷合成途徑(map00940)進(jìn)行比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn)花生芽中arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.DXZI51、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.VGN2GE、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.Y23DM6這三個基因顯著上調(diào)與白藜蘆醇合成途徑相關(guān),其中arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.DXZI51為肉桂?;o酶A還原酶(Cinnamoyl-CoA reductase 2)參與了肉桂酸的合成。苯丙氨酸(PHE,Phenylalanine)首先經(jīng)過苯丙氨酸解氨酶(PAL,phenylalanine ammonia lyase)脫氨基作用失去氨基之后轉(zhuǎn)化為肉桂酸(Cinnamic acid),肉桂酸再通過肉桂酸羥化酶(C4H,cinnamate-4-hydroxylase)發(fā)生羥基化磷脂反應(yīng)得到對香豆酸(Cinnamoyl-COA),在本通路結(jié)果中arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.VGN2GE、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.Y23DM6基因均為4-香豆酸酯-CoA連接酶(4-coumarate-CoA ligase),參與了由4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL,4-coenzyme A ligase)得到對香豆輔酶A的生物合成。前人報道香豆輔酶A(4-coumaroyl-COA)最后在外界因素刺激下,開啟白藜蘆醇生成途徑,由1分子的對香豆酰輔酶A和3分子的丙二酰輔酶A(Malonyl-COA)在芪合酶(STS,stilbene synthase)的催化作用下縮合生成1分子的反式白藜蘆醇[19]。由此可以說明在花生芽在超聲誘導(dǎo)下產(chǎn)生機(jī)械損傷,通過調(diào)控arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.DXZI51、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.VGN2GE、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.Y23DM6促進(jìn)白藜蘆醇的富集。

    本研究發(fā)現(xiàn)苯丙烷類生物合成途徑是富集數(shù)目最顯著的一條代謝通路,共有21個相關(guān)基因得到注釋。在植物次生代謝途徑中,所有黃酮類物質(zhì)、木質(zhì)素和白藜蘆醇等大部分酚類物質(zhì)均經(jīng)苯丙氨酸代謝途徑合成,研究已經(jīng)表明,植物體內(nèi)這些關(guān)鍵酶在應(yīng)對外界生物及非生物逆境時起到至關(guān)重要的調(diào)控次生代謝作用[20-23]。例如,PAL活性的提高增強(qiáng)了大豆根部木質(zhì)素的合成進(jìn);甘草黃酮類物質(zhì)的提高與PAL、C4H基因及其酶活性的增加有著不可分割的聯(lián)系[24,25]。上述結(jié)果表明,超聲誘導(dǎo)提高了發(fā)芽花生苯丙烷類合成途徑中基因的表達(dá),這意味著發(fā)芽花生苯丙烷代謝途徑中的下游產(chǎn)物也將可能被超聲誘導(dǎo)所改變,這也進(jìn)一步驗證了本研究在前期試驗中發(fā)現(xiàn)超聲誘導(dǎo)能夠顯著提高發(fā)芽花生的白藜蘆醇含量的結(jié)果[4-6]。殷向靜[26]利用超聲誘導(dǎo)葡萄富集白藜蘆醇,發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的富集受到白藜蘆醇合酶的轉(zhuǎn)錄控制,而超聲處理能夠引起白藜蘆醇合酶活性升高。此外,李淑瑩[27]的研究表明,超聲聯(lián)合苯丙氨酸誘導(dǎo)可對花生芽中白藜蘆醇的富集產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),原因是由于超聲可以提高肉桂酸-4-羥基化酶、4-香豆酸-輔酶A連接酶、類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶4種酶的活性。Ling等[28]研究超聲處理(400 W,6 min)與0.4%過乙酸在20 ℃對枇杷貯藏過程中生理變化的影響,結(jié)果表明,聯(lián)合超聲和乙酸處理后,枇杷果實中總黃酮含量在第3 d達(dá)到最高值,且高于對照組。這可能是因為超聲聯(lián)合過乙酸在處理可以提高枇杷果實內(nèi)多酚氧化酶和過氧化物酶的活性,而這兩種酶則是參與苯丙烷途徑和氧化過程的重要酶,從而產(chǎn)生多種具有結(jié)構(gòu)和防御功能的酚類化合物[2]。此外,卞紫秀等[23]研究表明,利用超聲處理可以有效地促進(jìn)苦蕎麥種子的萌發(fā),從而富集苦蕎芽苗中黃酮類化合物。這可能要?dú)w因于超聲處理能有效激活植物種子萌發(fā)期的各種酶類的活性[24],顯著提高種子萌發(fā)率,同時誘導(dǎo)種子中一些生物活性成分的合成,這與本研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致,說明超聲誘導(dǎo)能夠調(diào)控發(fā)芽花生苯丙烷類生物合成代謝途徑的基因表達(dá)情況。

    3 結(jié)論

    為了揭示發(fā)芽花生如何應(yīng)答超聲外源場誘導(dǎo),篩選在超聲誘導(dǎo)后起重要調(diào)節(jié)作用的基因,本研究在前期研究基礎(chǔ)上,選出適宜富集白藜蘆醇的花生品種阜花23號為試驗原料,是較有代表性的一個研究材料,為此次研究奠定了良好的材料基礎(chǔ)。研究了經(jīng)超聲誘導(dǎo)后的發(fā)芽花生(CS)和未經(jīng)誘導(dǎo)處理的發(fā)芽花生(KB)的轉(zhuǎn)錄組差異,證實了超聲能夠影響發(fā)芽花生苯丙烷類物質(zhì)的生物合成,從兩組樣品中共篩選出1104個差異基因,其中上調(diào)583個,下調(diào)521個。通過與七大數(shù)據(jù)庫的比對分析,解析了發(fā)芽花生在超聲誘導(dǎo)下所涉及到的功能分類、代謝通路及生物進(jìn)程的調(diào)控,功能注釋表明差異基因主要富集在遺傳信息處理、代謝途徑和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換。并挖掘到 3個(arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.DXZI51、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.VGN2GE、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.Y23DM6)參與發(fā)芽花生苯丙烷類物質(zhì)的顯著基因,這些研究結(jié)果為揭示發(fā)芽花生苯丙烷類物質(zhì)的生物合成途徑提供一定的參考依據(jù)。但眾多基因復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及發(fā)芽過程中酚酸、木質(zhì)素及總黃酮等物質(zhì)在超聲誘導(dǎo)處理下的代謝機(jī)理需要進(jìn)一步深入探討,目的在于將來通過外援手段改變此類基因的調(diào)節(jié)功能,讓發(fā)芽花生的營養(yǎng)和功能性成分的變化向?qū)θ祟愑欣陌l(fā)現(xiàn)發(fā)展。

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