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    金柚幼果黃酮對(duì)AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

    2022-03-07 07:00:34納雨農(nóng)陳乃驛張渙悠王琴肖更生劉袆帆
    現(xiàn)代食品科技 2022年2期
    關(guān)鍵詞:黃酮

    納雨農(nóng) ,陳乃驛 ,張渙悠 ,王琴 ,2,3,肖更生 ,3,劉袆帆 ,2,3*

    (1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東 廣州 510550)(2.仲愷廣梅研究院,廣東 梅州 514799)(3.廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510550)

    柚子是我國廣泛種植的水果品種之一,廣東特色品種金柚已成為國家優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)[1]。未成熟的柚子在生長期自然脫落以及果農(nóng)進(jìn)行疏花疏果產(chǎn)生的落果稱為金柚幼果[2]。金柚幼果的研究主要包括膳食纖維、多糖、柚皮苷、活性肽等,本課題組在前期研究中提取了金柚幼果的膳食纖維[2]和多糖[3],其中總膳食纖維含量為75.63%,在四氧嘧啶誘導(dǎo)小鼠高血糖模型中有效降低小鼠血糖水平,通過調(diào)節(jié)腸道菌群豐度緩解糖尿病癥狀;發(fā)現(xiàn)金柚幼果多糖表面為光滑的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),借由小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞模型驗(yàn)證多糖的免疫活性。另外,采用響應(yīng)面法優(yōu)化后柚皮苷得率為3.8%,發(fā)現(xiàn)柚皮苷提取物能有效保護(hù)紅細(xì)胞免受AAPH自由基的攻擊,顯著降低紅細(xì)胞溶血率[4]。除了柚皮和幼果,該課題組還通過共發(fā)酵體系提高了柚子核活性肽的含量,在抑菌測(cè)試中共孵育柚核多肽,對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為12.50 μg/mL,其抑菌機(jī)理與細(xì)菌細(xì)胞膜形成孔洞有關(guān)[5]。金柚幼果中果瓤占比43%~48%,而柚子果實(shí)中黃酮主要存在于果瓤中且在未成熟期累積,故幼果中黃酮含量較高[6-8]。在前期的研究中,羅潔瑩等[6]使用微波超聲輔助法提取并經(jīng)過相應(yīng)面優(yōu)化,總黃酮的提取率達(dá)68.57%。經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后,金柚幼果黃酮類化合物(CF)能顯著抑制AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血,并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性[9]。

    AAPH氧化誘導(dǎo)劑常用于紅細(xì)胞氧化溶血模型中,在水溶液中經(jīng)熱分解會(huì)形成相對(duì)穩(wěn)定的過氧自由基,并且會(huì)引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),產(chǎn)生更多種類的自由基[10,11]。以抗氧化活性為跟蹤指標(biāo),構(gòu)建紅細(xì)胞氧化模型,測(cè)定過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的酶活性以及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量,描述模型中酶促抗氧化通路以及非酶促抗氧化通路的變化情況,以此判斷物質(zhì)抗氧化活性[10]。張艷梅等[12]建立 H2O2紅細(xì)胞溶血模型并發(fā)現(xiàn)沙蔥總黃酮濃度在30~520 μg/mL時(shí)均能夠抑制H2O2氧化損傷引起的紅細(xì)胞溶血,降低紅細(xì)胞中MDA含量,提高紅細(xì)胞中GSH-Px、SOD、CAT活性,且呈劑量效應(yīng)性關(guān)系。蘇健裕等[13]發(fā)現(xiàn)楊梅酮處理會(huì)導(dǎo)致 ROS和 MDA含量的降低以及 SOD和GSH-Px的酶活性的增加,且具有一定的劑量依賴性。說明楊梅酮對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)主要是通過增強(qiáng) SOD和GSH-Px酶活性來清除過多ROS。在前期的研究中,發(fā)現(xiàn)CF能直接清除自由基,控制自由基引起的氧化損傷,使酶促抗氧化與非酶促抗氧化保持平衡,從而抑制AAPH引起的紅細(xì)胞溶血[9]。

    本研究通過制備液相色譜儀進(jìn)一步純化CF得到含量最高的組分 PF,并使用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)[14-16]鑒定PF的化學(xué)成分;構(gòu)建紅細(xì)胞抗氧化模型評(píng)價(jià)體系,探討 PF的抗氧化活性及其機(jī)理,本研究為金柚幼果黃酮開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持;為柚子副產(chǎn)物綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    金柚幼果采自廣東省梅州市五華縣金柚種植園。分析純級(jí)無水乙醇購自天津市大茂化學(xué)試劑廠;甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純,購買于美國天地公司;2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)購自上海瑞永生物科技有限公司;PBS磷酸緩沖液(pH=7.2)購自北京雷根生物技術(shù)有限公司;6% O型紅細(xì)胞,抗氧化指標(biāo)檢測(cè)試劑盒(LDH、MDA、SOD、GSH-Px、CAT、GSH)均購買于南京建成生物工程研究所。

    1.2 設(shè)備

    XO-SM 超聲波-微波協(xié)同反應(yīng)系統(tǒng),南京西安歐儀器制造有限公司;PHS-25數(shù)顯pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;FA1204B分析天平,上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;SC-3610低速離心機(jī),安徽中佳科學(xué)儀器有限公司;Waters I class液相色譜串聯(lián)Q-Tof質(zhì)譜,美國Agilent公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 金柚幼果黃酮的分離與純化

    金柚幼果切碎后,在-40 ℃真空冷凍干燥后磨碎成粉并經(jīng)過60目篩網(wǎng),得到的金柚粉避光存放于干燥器中。根據(jù)王琴[6]的方法提取金柚幼果粗黃酮:使用60%乙醇作為溶劑進(jìn)行超聲-微波協(xié)同提取,提取過程中溫度控制在60±2 ℃以內(nèi),提取完成后以4000 r/min進(jìn)行離心,時(shí)間為10 min,得上清液。將黃酮水提上清液緩慢加入AB-8大孔樹脂柱,避光吸附4 h,洗脫水溶性雜質(zhì)后用40%乙醇水溶液進(jìn)行洗脫并收集后,真空濃縮,冷凍干燥得粗黃酮CF。

    1.3.2 制備型高效液相色譜制備分離黃酮類化合物PF

    將CF充分溶解后上樣于制備液相色譜柱,制備色譜柱為美國沃特斯 Symmetry Prep C18柱(300 mm×7.8 mm,10 μm);流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈,線性梯度洗脫程序如表1所示;流速為1.0 mL/min。流動(dòng)相在使用前需經(jīng)0.45 μm微孔濾膜抽濾,超聲脫氣;進(jìn)樣量為400 μL;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長為280 nm。收集峰面積最大的組分,真空濃縮冷凍干燥后得金柚幼果黃酮(PF)。

    表1 制備液相梯度洗脫程序Table 1 Preparation of liquid phase gradient eluting procedure

    1.3.3 ESI-LC-MS/MS分析

    液相色譜條件如下Waters Cortecs C18色譜柱(2.1 mm ×50 mm,1.7 μm),流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫程序如表2所示;流速為 0.3 mL/min,進(jìn)樣量20 μL;柱溫40 ℃。

    表2 ESl-LC-MS/MS液相梯度洗脫程序Table 2 Gradient eluting procedure of ESI-LC-MS/MS

    質(zhì)譜條件如下,離子方式:EIS+;毛細(xì)管電壓:2.98 kV;錐孔電壓:25 V;離子源溫度:100 ℃;脫溶劑氣溫度:350 ℃;質(zhì)量范圍:50~1200m/z;分析儀真空度:3.25e-7 mBar;錐孔氣體流量:49 L/h;脫溶劑氣體流量:790 L/h。

    1.3.4 PF對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

    1.3.4.1 紅細(xì)胞氧化損傷模型的建立

    參考劉袆帆等[17]的方法,使用PBS溶解PF后分別配成濃度為600、700、800、900、1000 μg/mL的待測(cè)液。紅細(xì)胞懸液在4 ℃下以3000 r/min離心5 min去除上清液,再加入適量PBS溶液后離心,此步驟重復(fù)三次后將紅細(xì)胞配成體積比為 6%的紅細(xì)胞懸液。取0.2 mL紅細(xì)胞懸液并加入200 μL待測(cè)液,AAPH組加入等體積 AAPH溶液,空白對(duì)照組加入等體積PBS溶液,與紅細(xì)胞充分混勻,37 ℃下避光緩和震蕩孵育30 min后,加入AAPH溶液,混勻,相同條件下孵育2.5 h后測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三次平行取平均。

    1.3.4.2 紅細(xì)胞溶血率的計(jì)算

    將孵育結(jié)束后的反應(yīng)液在 4 ℃條件下以 3000 r/min離心10 min,上清液使用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處吸光值A(chǔ)。取相同濃度的紅細(xì)胞懸液加入等體積的水進(jìn)行裂解,同樣在540 nm處測(cè)得吸光值B。

    1.3.4.3 紅細(xì)胞氧化損傷實(shí)驗(yàn)

    將孵育結(jié)束后的紅細(xì)胞用PBS洗滌2~3次,加入4倍體積超純水裂解細(xì)胞,冰浴后于4 ℃、3000 r/min離心5 min,上清液保存于-40 ℃冰箱備用。采用未稀釋的裂解液按照試劑盒的操作方法測(cè)定 GSH-Px和LDH,測(cè)定GSH-Px和LDH的酶活。GSH的含量測(cè)定時(shí),用超純水將裂解液稀釋5倍,具體操作按照試劑盒的指示進(jìn)行。將裂解液稀釋20倍后,按照試劑盒的方法測(cè)定MDA的含量。將裂解液稀釋80倍,按照試劑盒表明的方法測(cè)定 SOD的酶活。以上所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    使用SPSS 25.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD),以Duncan多邊檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)均值進(jìn)行差異顯著分析(p<0.05)。用Origin 2018對(duì)分析數(shù)據(jù)作圖。

    2 結(jié)果與討論

    表3 PF化學(xué)成分鑒定表Table 3 Table of chemical constituents from young fruit extract of golden pomelo

    2.1 金柚幼果黃酮PF的制備及化合物種類分析

    如圖所示,經(jīng)梯度洗脫后的CF共有6個(gè)明顯的尖峰。其中,19.852~20.942 min的峰面積為27532.896,標(biāo)記為峰A。收集峰A,凍干后得到PF。

    PF經(jīng)LC-MS分析后發(fā)現(xiàn)共有33種物質(zhì),含量最高為12-甲基十四酸甲酯,經(jīng)鑒定比對(duì),PF中含有8種有機(jī)酸、3種有機(jī)酸酯、7種生物堿以及2種黃酮類物質(zhì)。詳細(xì)結(jié)果如表2所示。物質(zhì)相對(duì)含量如圖2a所示,PF中有機(jī)酸及有機(jī)酸酯相對(duì)含量最高;黃酮類化合物占PF物質(zhì)含量的28.19%,兩種黃酮類化合物分別為四羥基查爾酮及美鼠李苷,相對(duì)含量分別為15.57%、12.62%。

    四羥基查爾酮是PF中含量最高的黃酮類化合物,其相對(duì)含量為15.57%。如圖3a所示,其化合物分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特,含有多個(gè)反應(yīng)中心,可以與多種受體結(jié)合,從而表現(xiàn)出廣泛的生物活性,可以作為有機(jī)合成及藥物合成中間體[28],天然產(chǎn)物提取的查爾酮類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用[19,29]。Zhong等[30]使用四羥基查爾酮作為中間體合成出的查爾酮類抗白癜風(fēng)藥物表現(xiàn)出較高的黑素生成能力、抗氧化活性及較低的毒性。美鼠李苷是一種黃酮甙類化合物,具有一定的抗氧化活性[20,31]。黃酮甙類物質(zhì)具有良好的DDPH自由基清除能力,且能夠抑制α-糖苷酶的活性影響糖代謝,從而對(duì)糖尿病小鼠血糖指標(biāo)有改善作用[32-34]。

    2-O-咖啡?;芄帐且环N多酚類物質(zhì),最初發(fā)現(xiàn)于杜鵑花科熊果屬小灌木植物中[35],其 DPPH自由基清除率效果略差于Vc[21]。熊果苷能治療由紫外線誘導(dǎo)的各種皮膚色素作用,控制羥基自由基的產(chǎn)生熊果苷是酪氨酸酶抑制劑。它阻斷多巴及多巴醌的合成,從而抑制黑素的生成[36],在護(hù)膚用品和發(fā)用制品方面有廣泛的用途[37]。水蘇堿和甜菜堿為生物堿,具有抗菌消炎的作用[38-40]。水蘇堿是益母草抗栓、抗凝、降脂的主要有效成分[25],已有相關(guān)報(bào)道表明其對(duì)大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[41,42],對(duì)CCl4所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[43,44]。水蘇堿主要通過抑制炎癥因子的表達(dá)和氧化應(yīng)激以及調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs系統(tǒng)來抵抗肝纖維化。水蘇堿有望成為治療肝纖維化的候選藥物[45]。甜菜堿可以保護(hù)細(xì)胞在高滲透條件下免受損傷。甜菜堿并不能直接清除AAPH自由基,卻可以使機(jī)體抗氧化酶活力恢復(fù)至正常水平,從而提高植物在逆境中的抵抗能力[11]。Zhang等[24]的研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿能通過蛋氨酸-同型半胱氨酸循環(huán)提高腺苷甲硫氨酸和蛋氨酸的水平,提高系統(tǒng)清除活性氧簇的能力。PF具有多種活性物質(zhì),故推測(cè)其具有較好的抗氧化活性,為下一步PF的紅細(xì)胞抗氧化模型評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

    2.2 PF的紅細(xì)胞抗氧化模型評(píng)價(jià)

    通過PF對(duì)AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血模型的保護(hù)作用研究發(fā)現(xiàn),不同濃度PF下對(duì)AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血保護(hù)效果表現(xiàn)出劑量反應(yīng),如圖4所示。在相同的孵育條件下,陰性組添加PBS而不經(jīng)AAPH處理,自然產(chǎn)生的溶血率為20.83%,而AAPH組的溶血率為52.79%,顯著高于經(jīng)PF處理后的實(shí)驗(yàn)組(p<0.01)。當(dāng)PF的含量為1000 μg/mL時(shí),溶血率為31.63%與900 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組無顯著差異。在陳華敏等[46]的研究中,使用AB-8大孔樹脂純化高粱糠多酚提取物并得到五種類型酚,其中游離酚、束縛型酚和可溶性酯型酚濃度達(dá)到 200 μg/mL時(shí),紅細(xì)胞溶血率已降至10%與空白組無顯著性差異而可溶性苷型酚的溶血率仍為28.84%,其中可溶性苷型酚和束縛型苷型酚的抗溶血活性相對(duì)較弱,黃酮與苷酚結(jié)構(gòu)相似,酯型酚類化合物抗溶血活性更高。

    2.2.1 PF對(duì)非酶促抗氧化體系的影響

    在紅細(xì)胞氧化溶血模型中,自由基攻擊細(xì)胞會(huì)造成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)生,丙二醛(MDA)則是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中的副產(chǎn)物之一,MDA的含量被用作脅迫反應(yīng)過程的生物標(biāo)志[10,47,48]。各組 MDA 的含量如圖5所示:AAPH組MDA含量顯著高于陰性組,在經(jīng)過1000 μg/mL的PF處理后,MDA的含量為27.39 nmol/mg與陰性組25.01 nmol/mg無顯著差異且在不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間表現(xiàn)出劑量反應(yīng)。

    乳酸脫氫酶(LDH)參與丙酮酸的代謝,該酶的酶活性與細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外的量有關(guān)進(jìn)而可用于表示細(xì)胞的受損程度。如圖6所示,LDH的酶活隨PF的濃度升高而降低,AAPH組LDH酶活為470.85 U/L,明顯高于實(shí)驗(yàn)組。當(dāng)PF濃度為1000 μg/mL時(shí)的LDH的酶活為314.85 U/L,顯著高于濃度為600 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組,而與AAPH組有顯著差異,當(dāng)PF濃度為1000 μg/mL時(shí),LDH的釋放量顯著高于陰性組。

    GSH廣泛存在于細(xì)胞中,既能維持正常的免疫系統(tǒng)功能,同時(shí)參與非酶促抗氧化體系,可以在GSH-Px的催化下與GSSG相互轉(zhuǎn)化從而應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激[10,49]。GSH的含量水平可以表征自由基對(duì)細(xì)胞氧化脅迫反應(yīng)的程度。圖7可知,AAPH組GSH含量為258.40 μmol/L,顯著低于經(jīng)過 PF處理的實(shí)驗(yàn)組,且實(shí)驗(yàn)組在不同濃度下存在一定的劑量反應(yīng),其中 PF含量大于900 μg/mL時(shí),可以較好維持細(xì)胞內(nèi)GSH含量。

    PF濃度為1000 μg/mL可以阻止細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化反應(yīng),緩解非酶促抗氧化體系的氧化應(yīng)激;在AAPH誘發(fā)的氧化應(yīng)激下,細(xì)胞膜的完整性隨著 PF濃度的變化受到不同程度的保護(hù),PF濃度為 1000 μg/mL細(xì)胞膜仍受到損傷,但其保護(hù)作用表現(xiàn)出與AAPH對(duì)照組顯著的差異,同時(shí)GSH的含量隨PF濃度上升而提高,說明 PF具有一定的清除自由基的作用。MDA的含量下降,LDH的釋放降低,說明細(xì)胞膜完整性上升,PF對(duì)細(xì)胞膜具有保護(hù)作用,在王榮等[50]設(shè)計(jì)的AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血模型中,亞麻木酚素表現(xiàn)出相似的作用機(jī)理,在林戀竹等人[51]的研究中,在250、625、1250 μg/mL三個(gè)濃度下處理的紅細(xì)胞溶血率、SOD酶活、MDA含量并未表現(xiàn)出明顯劑量反應(yīng),與多酚黃酮的作用機(jī)理不同。

    2.2.2 PF對(duì)酶促與抗氧化體系的影響

    在紅細(xì)胞清除自由基的過程中,SOD是最先發(fā)揮作用的抗氧化酶之一,SOD能催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng),生成毒性相對(duì)較低H2O2,再經(jīng)過GSH-Px酶和CAT酶的催化后分解[10,11,49]。由圖8可知,經(jīng)PF處理后的實(shí)驗(yàn)組 SOD酶活均與陰性組無顯著差異,酶活均小于 241.04 U/L;AAPH組中 SOD酶活為1146.21 U/L,差異明顯(p<0.01),無劑量反應(yīng),說明在AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化系統(tǒng)中,經(jīng)PF處理的實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞的自由基平衡不通過酶促抗氧化體系完成。

    AAPH自由基誘導(dǎo)劑在水溶液中經(jīng)熱分解會(huì)形成相對(duì)穩(wěn)定的過氧自由基,并且會(huì)引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),H2O2也是其中的子產(chǎn)物之一[11]。由圖9可知經(jīng)AAPH處理的實(shí)驗(yàn)組 CAT酶活顯著高于陰性組 CAT酶活(16.99 U/L),而低于AAPH組CAT酶活(198.55 U/L),說明AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化的模型中參與過氧化氫分解而導(dǎo)致活性上升。CAT酶活性的測(cè)試與SOD酶活實(shí)驗(yàn)組相似,并未表現(xiàn)出劑量反應(yīng)。

    由圖10可知,在AAPH的刺激下,紅細(xì)胞內(nèi)的GSH-Px活性被激發(fā),AAPH組的酶活顯著高于實(shí)驗(yàn)組以及陰性組,當(dāng)PF濃度為1000 μg/mL時(shí),GSH-Px酶活顯著低于其余實(shí)驗(yàn)組且高于未經(jīng)AAPH處理的陰性組。GSH-Px參與紅細(xì)胞內(nèi)的酶促抗氧化體系[52],同時(shí)參與催化GSH與GSSG的相互轉(zhuǎn)化。結(jié)合SOD酶活和 CAT酶活的結(jié)果,酶促抗氧化體系并不是此模型中應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的主要通路,所以主要是 GSH與GSSG的相互轉(zhuǎn)化使得GSH-Px的需求量增加。

    綜上所述,經(jīng)PF處理的實(shí)驗(yàn)組在AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化模型中可以起到抑制紅細(xì)胞溶血的作用。1000 μg/mL時(shí)MDA含量為27.39 nmol/mL與陰性組25.01 nmol/mL無明顯差異,LDH酶活為314.75 U/L高于陰性組144.96 U/L,說明在模型中,細(xì)胞膜受到影響,PF可以起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用。SOD酶活在不同濃度PF處理后未產(chǎn)生劑量反應(yīng),說明細(xì)胞超氧陰離子并非經(jīng)SOD分解。細(xì)胞內(nèi)H2O2含量增加導(dǎo)致CAT酶活增加;GSH含量降低而導(dǎo)致GSH-Px酶活增加,說明細(xì)胞內(nèi)自由基主要經(jīng)過非酶促抗氧化體系清除。

    綜合上述指標(biāo),紅細(xì)胞溶血率降低,完整性得到保護(hù)。其內(nèi)在原因是PF緩解了AAPH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,GSH含量高于AAPH組,SOD酶活性與對(duì)照組無明顯差異說明 PF能直接清除自由基,并以此緩解自由基引起的氧化損傷。PF中美鼠李苷和2-O-咖啡?;芄諡榭寡趸钚晕镔|(zhì),具有清除自由基的能力,在AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血的模型中,推測(cè)可以緩解 GSH為主的非酶促抗氧化體系氧化應(yīng)激,減少氧化應(yīng)激自由基的產(chǎn)生。水蘇堿與甜菜堿兩種生物堿在PF中的含量較低,推測(cè)在模型中起到提升酶促體系中GSH-Px酶活的作用,從而緩解氧化應(yīng)激。

    3 結(jié)論

    本研究以金柚幼果為對(duì)象,采用制備液相收集黃酮類物質(zhì)PF,并使用ESI-LC-MS在PF中鑒定多種活性物質(zhì)。通過構(gòu)建AAPH誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血模型,研究了實(shí)驗(yàn)組不同濃度PF處理后溶血抑制率的變化,測(cè)定了細(xì)胞內(nèi)抗氧化體系中的關(guān)鍵指標(biāo),從而推斷PF的抗氧化作用機(jī)理。PF具有一定的自由基清除能力,可以緩解AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化應(yīng)激,且主要通過非酶促抗氧化體系清除自由基。黃酮提取物中具有抗氧化活性的主要成分為美鼠李苷和 2-O-咖啡?;芄?。該研究為金柚幼果中抗氧化性物質(zhì)綜合利用提供新思路,為天然產(chǎn)物開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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