Klotho、ET-1 在新生血管性青光眼患者中表達及臨床意義

郭九春，呂靜

新生血管性青光眼（neovascular glaucoma，NVG）是房角纖維血管增生引起小梁網(wǎng)阻塞，進而導(dǎo)致虹膜粘連、房角關(guān)閉、房水循環(huán)障礙和眼內(nèi)壓升高，降眼壓藥物治療效果差，往往需要手術(shù)治療[1]。NVG 發(fā)病機制尚不清楚，可能與炎性反應(yīng)、新生血管因子生成、細胞外基質(zhì)作用、氧化應(yīng)激等有關(guān)[2]。新生血管形成是NVG 發(fā)病的主要病理機制之一，探討與新生血管相關(guān)的分子機制有助于早期診斷、指導(dǎo)臨床治療、評估病情進展。Klotho 是一種抗衰老相關(guān)蛋白，其表達缺失與動脈粥樣硬化、器官萎縮、骨質(zhì)疏松、認知功能障礙等老年性疾病有關(guān)，近年來研究發(fā)現(xiàn)Klotho 對維持血管正常功能有重要作用[3]。內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）是參與炎癥反應(yīng)過程的血管活性物質(zhì)，具有收縮血管、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞生成、分化和遷移作用[4]。Klotho、ET-1 是否參與NVG 發(fā)病和疾病進展過程尚不清楚，其機制尚待探討，本研究檢測NVG 患者房水、血清中Klotho、ET-1 水平，分析其與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、炎性因子和疾病進展的關(guān)系，旨在為臨床治療、病情評估提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016 年8 月—2019 年10 月濱州市第二人民醫(yī)院眼科住院病房收治的NVG 患者（NVG 組）62 例（62 只眼）。另選擇同期眼科收治的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者51 例（51 只眼）為對照組。NVG 組：男34 例，女28 例，年齡48～59 歲，平均（53.26±4.12）歲，左眼25 例，右眼37 例。Teich 分級：Ⅱ級13 例，Ⅲ級25 例，Ⅳ級24 例。原發(fā)病分布：視網(wǎng)膜靜脈阻塞20 例，糖尿病性視網(wǎng)膜病變15 例，原發(fā)性青光眼9 例，視網(wǎng)膜母細胞瘤8 例，眼外傷6 例，其它4 例，其中視網(wǎng)膜靜脈阻塞合并高血壓病16 例，糖尿病性視網(wǎng)膜病變合并高血壓病7 例，原發(fā)性青光眼合并高血壓病5 例。手術(shù)治療方式：全視網(wǎng)膜光凝手術(shù)24 例，青光眼濾過手術(shù)29 例，全視網(wǎng)膜光凝手術(shù)聯(lián)合抗VEGF 藥物治療5 例，青光眼濾過手術(shù)聯(lián)合抗VEGF 藥物治療4 例。對照組：男28 例，女23 例，年齡46～60 歲，平均（54.02±4.37）歲，左眼21 例，右眼30 例。2 組年齡、性別、患眼分布比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準（2018-12-045）。

1.2 診斷標準、納入標準和排除標準

診斷標準：（1）有原發(fā)病的病史或體征；（2）眼壓＞21 mmHg（1 mm Hg=0.133 kPa），多數(shù)伴有眼痛、畏光、視力下降等癥狀；（3）虹膜表面及前房角可見到新生血管，瞳孔散大，瞳孔緣色素外翻[5]。

根據(jù)虹膜新生血管Teich 分級標準[6]分為，Ⅰ級：虹膜瞳孔緣新生血管0～1 個象限；Ⅱ級：虹膜瞳孔緣新生血管＞2 個象限；Ⅲ級：虹膜瞳孔緣及睫狀體存在新生血管和/或葡萄膜外翻1～3 個象限；Ⅳ級：虹膜瞳孔緣及睫狀體存在新生血管和/或葡萄膜外翻＞3 個象限。

納入標準：（1）符合NVG 診斷標準；（2）單眼患NVG；（3）對照組經(jīng)系統(tǒng)檢查排除眼底疾病、青光眼、眼內(nèi)感染、眼內(nèi)腫瘤等疾病，亦無全身系統(tǒng)性疾病；（4）患者及其家屬均知情同意并簽署同意書。

排除標準：（1）合并葡萄膜炎、玻璃體炎、眼內(nèi)腫瘤等眼科疾??；（2）妊娠期NVG 患者；（3）合并急慢性感染、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤者；（4）合并有精神系統(tǒng)疾患或未成年患者。

1.3 方法

1.3.1 標本采集方法 入院后第2 d 清晨采集空腹靜脈血標本5 ml，經(jīng)離心（4℃，3，000 r/min，離心時間15 min，離心半徑10 cm），取血清保存于-80℃超低溫冰箱（Thermo Fisher 公司）待檢。房水采集方法：開瞼，常規(guī)消毒結(jié)膜囊，生理鹽水沖洗后無菌紗布拭干，于眼球切口前采用1 ml 無菌注射器抽取約0.15 ml房水，注入無菌試管中-80℃保存待檢。

1.3.2 Klotho、ET-1、炎性細胞因子指標檢測 ALISEI 全自動酶標儀（意大利SEAC 公司）采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清、房水中Klotho、ET-1、VEGF、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，試劑為美國Epitope Diagnostics 公司。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)的處理和分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）進行描述，Student t 檢驗或One-Way 方差分析組間差異。計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗。采用Pearson 相關(guān)系數(shù)（r）描述Klotho、ET-1 與炎性因子、VEGF 之間相關(guān)性，采用Spearman 秩相關(guān)系數(shù)（r）描述Klotho、ET-1 與Teich 分級之間相關(guān)性，所有統(tǒng)計均采用雙側(cè)檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清、房水中Klotho、ET-1 水平比較

NVG 組房水、血清中Klotho 水平低于對照組，t房水=14.486，t血清=10.000，均P=0.000。ET-1 水平高于對照組，t房水=42.086，t血清=30.066，均P=0.000，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 2 組血清、房水中Klotho、ET-1 水平差異（）

表1 2 組血清、房水中Klotho、ET-1 水平差異（）

注：* 與對照組同亞組比較，P＜0.05。ET-1 內(nèi)皮素-1；NVG 新生血管性青光眼

2.2 患者血清、房水中VEGF 及炎性細胞因子比較

VEGF：NVG 組房水、血清中VEGF 水平高于對照組，t房水=78.161，t血清=34.949，均P=0.000，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

IL-6：NVG 組房水、血清中IL-6 水平高于對照組，t房水=56.977，t血清=18.686，均P=0.000，均有統(tǒng)計學意義（表2）。

IL-8：NVG 組房水、血清中IL-8 水平高于對照組，t房水=44.505，t血清=23.069，均P=0.000，均有統(tǒng)計學意義（表2）。

TNF-α：NVG 組房水、血清中TNF-α 水平高于對照組，t房水=15.659，t血清=11.096，均P=0.000，均有統(tǒng)計學意義（表2）。

表2 2 組血清、房水中VEGF、IL-6、IL-8、TNF-α 水平差異()

表2 2 組血清、房水中VEGF、IL-6、IL-8、TNF-α 水平差異()

注：* 與對照組同亞組比較，P＜0.05。NVG 新生血管性青光眼；VEGF 血管內(nèi)皮生長因子；IL-6 白細胞介素6；IL-8 白細胞介素8；TNF-α 腫瘤壞死因子α

2.3 不同Teich 分級患者血清、房水Klotho、ET-1水平比較

NVG 患者血清、房水Klotho 水平隨著Teich 分級的增加而降低（F房水=16.352，F(xiàn)血清=8.569，均P=0.000），ET-1 水平隨著Teich 分級的增加而升高（F房水=23.651，F(xiàn)血清=12.351，均P=0.000），各亞組間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。

表3 不同Teich 分級患者血清、房水中Klotho、ET-1水平差異（）

表3 不同Teich 分級患者血清、房水中Klotho、ET-1水平差異（）

注：a 與Ⅱ級組同亞組比較，P＜0.05；b 與Ⅲ級組同亞組比較，P＜0.05。ET-1 內(nèi)皮素-1

2.4 不同Teich 分級血清、房水VEGF 及炎性細胞因子比較

VEGF：NVG 組房水、血清中VEGF 水平隨著Teich 分級的增加而升高，F(xiàn)房水=23.165，F(xiàn)血清=19.354，均P=0.000，均有統(tǒng)計學意義（表4）。

IL-6：NVG 組房水、血清中IL-6 水平隨著Teich分級的增加而升高，F(xiàn)房水=18.241，F(xiàn)血清=21.054，均P=0.000，均有統(tǒng)計學意義（表4）。

IL-8：NVG 組房水、血清中IL-8 水平隨著Teich分級的增加而升高，F(xiàn)房水=13.264，F(xiàn)血清=16.342，均P=0.000，均有統(tǒng)計學意義（表4）。

TNF-α：NVG 組房水、血清中TNF-α 水平隨著Teich 分級的增加而升高，F(xiàn)房水=14.243，F(xiàn)血清=16.351，均P=0.000，均有統(tǒng)計學意義（表4）。

表4 不同Teich 分級患者血清、房水中VEGF、IL-6、IL-8、TNF-α 水平差異（）

表4 不同Teich 分級患者血清、房水中VEGF、IL-6、IL-8、TNF-α 水平差異（）

注：a 與Ⅱ級組同亞組比較，P＜0.05；b 與Ⅲ級組同亞組比較，P＜0.05。VEGF 血管內(nèi)皮生長因子；IL-6 白細胞介素6；IL-8 白細胞介素8；TNF-α 腫瘤壞死因子α

2.5 NVG 患者Klotho、ET-1 水平與炎性細胞因子、VEGF、Teich 分級相關(guān)性

NVG 患 者Klotho 水 平 與VEGF、IL-6、IL-8、TNF-α、Teich 分級均呈負相關(guān)（P＜0.05），ET-1 與VEGF、IL-6、IL-8、TNF-α、Teich分級均呈正相關(guān)（P＜0.05）（表5）。

表5 NVG 患者Klotho、ET-1 水平與炎性細胞因子、VEGF、Teich 分級相關(guān)系數(shù)

3 討論

NVG 是以虹膜、角膜新生血管形成引起的眼壓升高為特征的眼內(nèi)疾病，該病主要發(fā)病機制是視網(wǎng)膜毛細血管網(wǎng)閉塞造成的視網(wǎng)膜缺血缺氧，進而誘導(dǎo)新生血管生長相關(guān)細胞因子釋放，導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管[7]。VEGF 是作用較強的促內(nèi)皮細胞增殖和血管生成的細胞因子，正常人視網(wǎng)膜色素上皮細胞低度表達VEGF，發(fā)揮維持視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)穩(wěn)定性和正常功能作用[8]。VEGF 通過與其受體結(jié)合激活磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C 和蛋白酶C，促使內(nèi)皮細胞增生、遷移，血管通透性增加，促使新生血管形成[9]。本研究NVG 組房水、血清VEGF 水平均高于對照組，這與多數(shù)研究結(jié)果一致[10-11]，提示VEGF 過表達可能是導(dǎo)致NVG 發(fā)病和病情進展的主要機制之一。VEGF 合成、表達受多種炎性細胞因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子等細胞因子調(diào)節(jié)，上述因子共同作用下促使了NVG 新生血管形成[12]。探討與VEGF 密切相關(guān)的生物學指標有助于明確NVG 發(fā)病機制，為臨床治療提供參考。

Klotho 是由5 個外顯子和4 個內(nèi)含子組成的膜結(jié)合或可溶性抗衰老基因，在腎、腦、血管、上皮組織、視網(wǎng)膜、神經(jīng)組織等有廣泛的分布，具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝、保護心血管系統(tǒng)、抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等作用[13]。Klotho 缺乏可導(dǎo)致血管鈣化、內(nèi)皮功能損害，血管正常功能異常[14]。Klotho 是否參與NVG 新生血管形成尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)NVG 患者房水、血清中Klotho 水平均低于對照組，Klotho 水平隨著虹膜新生血管分級的增加而降低，Klotho 水平與Teich 分級呈負相關(guān)，說明Klotho 缺失可能是NVG發(fā)病和病情進展的主要因素，檢測血清Klotho 水平可為臨床NVG 病情嚴重程度判斷提供參考。推測Klotho 參與NVG 的發(fā)病和病情進展的可能機制為：Klotho 基因表達缺失狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細胞凋亡增加，血管完整性受損，收縮功能障礙[15]，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血流灌注不足，局部組織在缺血缺氧刺激下進一步誘導(dǎo)VEGF 表達，進而促使新生血管形成。Klotho 合成越少，新生血管生成越多，NVG 患者Teich 分級越高，Klotho 可作為NVG 病情評估的輔助生物學指標。本研究相關(guān)性分析顯示Klotho 水平與VEGF 呈負相關(guān)，說明Klotho 在NVG 新生血管形成中可能與VEGF 存在相互調(diào)節(jié)、抑制作用，Klotho 缺失，VEGF 過表達可能促使了新生血管形成，加重病情進展。

ET-1 是具有強烈收縮血管和促血管平滑肌細胞增殖作用的血管活性物質(zhì)，由內(nèi)皮素前體在內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶作用下轉(zhuǎn)化而成，在血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、虹膜、睫狀體非色素上皮細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞均有廣泛的表達。ET-1 具有多種生物學活性，參與炎性疾病、高血壓病、動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展[16]。近年來研究[17]發(fā)現(xiàn)ET-1 具有誘導(dǎo)血管生成、分化作用，高水平ET-1 可能誘導(dǎo)眼球后血流動力學異常，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管血流灌注減少，與青光眼發(fā)病密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示NVG 患者房水、血清中ET-1 水平高于對照組，ET-1 水平與Teich 分級呈正相關(guān)，提示ET-1 高表達可能促使了NVG 的發(fā)病和進展。ET-1 參與NVG 發(fā)病和病情進展的可能機制為：首先，ET-1 高表達可直接提高內(nèi)皮細胞增殖、遷移、侵襲能力，誘導(dǎo)血管新生[17]。其次，ET-1過度表達可導(dǎo)致小梁細胞氧化損傷，引起血流灌注不足和組織缺血缺氧[18]，并刺激中性粒細胞過氧化物產(chǎn)生介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]，促使新生血管形成。本研究中ET-1 水平與VEGF 呈高度正相關(guān)，提示ET-1 與VEGF 相互作用參與NVG 新生血管形成過程，ET-1 作為一種促血管生成因子參與了NVG 新生血管形成的各個階段。相關(guān)報道[20]指出瘢痕組織中ET-1 呈高度表達，ET-1 與VEGF 發(fā)揮協(xié)同作用機制共同促使新生血管形成。因此，ET-1 水平能反映NVG 患者病情嚴重程度，可為臨床病情評估提供參考。

IL-6 是前炎性細胞因子，通過誘導(dǎo)T 細胞、B 細胞增殖、刺激免疫球蛋白分泌參與免疫調(diào)節(jié)過程[21]。IL-8 是促炎細胞因子，其表達升高可破壞視網(wǎng)膜血管屏障，導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細血管損傷過程[22]。TNF-α 可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞連接，破壞血-視網(wǎng)膜屏障，促使視網(wǎng)膜從非增殖狀態(tài)向新生血管轉(zhuǎn)變[23]。本研究發(fā)現(xiàn)房水、血清中Klotho 水平均與IL-6、IL-8、TNF-α 呈負相關(guān)，ET-1 與IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關(guān)，提示Klotho、ET-1 可能通過參與調(diào)控炎癥反應(yīng)參與NVG 發(fā)病和病情進展。Klotho可調(diào)節(jié)組織炎癥反應(yīng)，抑制NLRP3 炎癥小體，降低TNF-α、IL-1β、IL-18 等炎性細胞因子水平[24]。ET-1是重要的促炎性介質(zhì)，能促使TNF-α、IL-6 等炎性細胞因子釋放，細胞黏附分子表達[25]，因此Klotho 低表達，ET-1 高表達可能導(dǎo)致NVG 局部炎癥反應(yīng)擴大，進而誘導(dǎo)VEGF 表達，促使新生血管形成。

綜上，NVG 患者房水、血清中Klotho 水平降低，ET-1 水平增高，Klotho 缺失、ET-1 過度表達可能誘導(dǎo)VEGF 表達，進而刺激房角、虹膜等局部組織新生血管形成。Klotho、ET-1 可能通過調(diào)節(jié)局部炎性反應(yīng)參與NVG 新生血管形成過程。Klotho、ET-1 可為NVG 發(fā)生和病情進展評估提供有效信息。