君子蘭胚搶救及葉片再生體系建立研究

吳海紅李 丹趙興華

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所,遼寧 沈陽 110161)

君子蘭(Cliviaminiata),別名劍葉石蒜、大葉石蒜,是石蒜科君子蘭屬多年生草本觀賞盆花,原產(chǎn)于南非南部,它的原種從發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在只有200年左右的歷史[1]。君子蘭在世界各地廣為栽培,是全球最重要的盆栽花卉之一,因其寬厚光亮的葉、艷麗的花簇和鮮紅或橙黃的果實而深受人們的喜愛[2]。20世紀初經(jīng)日本和德國兩個途徑傳入我國,經(jīng)我國君子蘭愛好者的多年培育,20世紀80年代成為我國較為名貴的盆栽花卉之一?；ù笊G、花期長,葉片也具有較高的觀賞價值,一季觀花、二季觀果、四季觀葉。

國內(nèi)君子蘭繁殖都是民間各自進行,現(xiàn)有品種仍然是一家一戶的手工作坊式繁殖。遼寧鞍山君子蘭產(chǎn)業(yè)占地達240 hm2,年產(chǎn)1.6億株,年收入4.2億元,總產(chǎn)量占全國君子蘭份額50% 以上,位列全國第一。但由于君子蘭基因型高度雜合,現(xiàn)有的繁殖方法播種和分株繁殖法,繁殖速度慢、后代性狀分離嚴重,種苗性狀不一致,不利于規(guī)?；a(chǎn)[3]。在市場競爭日趨激烈情況下,供給側(cè)改革對生產(chǎn)方提出了更高的要求,必須從源頭創(chuàng)新,改變君子蘭原有的繁育技術(shù)體系,采用組織培養(yǎng)方法進行快繁是最行之有效的技術(shù)手段。方法是選用君子蘭未完全成熟的種子,此時胚乳的木質(zhì)化程度低,便于剝離幼胚,對胚進行人工搶救培養(yǎng),利用胚搶救獲得的君子蘭無菌試管苗的葉片開展試驗研究[4]。君子蘭試管苗的葉片相比較于成品株葉片組織幼嫩,細胞活性強,材料本身無菌。本試驗在遼寧省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所組培實驗室中進行。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和途徑

選擇君子蘭未完全成熟的果實,剝離種胚,以胚搶救方法獲得的試管苗葉片為外植體,通過外植體葉片→誘導愈傷組織(或者不定芽)→不定芽誘導→葉片誘導→生根培養(yǎng)的途徑開展研究。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體材料的選擇選擇優(yōu)良的君子蘭當年授粉未完全成熟果實,分別選取授粉后60 d、90 d、120 d和150 d的果實。

1.2.2 外植體材料的無菌處理及接種方法1:在超凈工作臺上將果實先用75%醫(yī)用酒精浸泡1 min,然后用0.1%的升汞溶液浸泡處理1、3、5 min,最后用無菌水沖洗3～5次,無菌濾紙吸干表面水分備用。

方法2:在超凈工作臺上將果實先用75%醫(yī)用酒精浸泡1 min,然后在接種盤內(nèi)剝離果皮,將種子浸入75%醫(yī)用酒精,殺菌3 min,然后用無菌水沖洗3～5次,無菌濾紙吸干表面水分備用。

方法3:在超凈工作臺上先用75%醫(yī)用酒精對果實浸泡1 min,然后將果實在酒精燈火焰上迅速的燎燒1遍,放入接種盤備用。

將處理完的君子蘭果實或種子在接種盤內(nèi)剝離果皮,分離胚珠,對種胚進行接種(圖1～3)。

圖1 果實

1.2.3 君子蘭不同發(fā)育時期胚誘導胚性愈傷組織將授粉后60 d、90 d、120 d和150 d的君子蘭果實表面殺菌處理后,在接種盤內(nèi)剝離果皮,剝出種子,去除胚乳,將不同發(fā)育時期的種胚接種到胚誘導培養(yǎng)基中。

1.2.4 君子蘭胚性愈傷組織誘導和叢生芽誘導培養(yǎng)基激素組合基本培養(yǎng)基選擇Ms,搭配不同激素濃度組合,同時添加蔗糖30 g/L,瓊脂粉5 g/L,pH 5.8。各組培養(yǎng)基試驗均采用正交實驗設(shè)計,各因素水平設(shè)計16個處理,每個處理接種10個外植體材料。

觀察外植體的生長發(fā)育變化,統(tǒng)計各個階段誘導率,從而確定最適合的培養(yǎng)基。

1.2.5 君子蘭葉片誘導培養(yǎng)基設(shè)計利用君子蘭試管苗的幼嫩葉片作為外植體,將葉片橫切為葉尖、葉間和葉基3部分,分別接種到葉片誘導培養(yǎng)基,培養(yǎng)基不同激素處理設(shè)計9個組合,觀察其誘導情況。

1.3 培養(yǎng)條件

置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng),培養(yǎng)溫度(25±2)℃,光照時間12 h/d,光照強度2 000～2 500 lux。

圖2 種胚

圖3 種胚接種

表1 誘導胚性愈傷組織不同濃度6-BA和2,4-D組合

表2 君子蘭葉片誘導培養(yǎng)基不同激素處理組合

2 試驗結(jié)果

2.1 不同表面消毒方法

君子蘭果實的3種表面殺菌法都實現(xiàn)完全無污染。

方法1是傳統(tǒng)的滅菌方法,升汞處理1、3、5 min效果相同,所以最佳滅菌時間選擇1～3 min即可;對于果皮有破損暴露空氣中的種子必須采取此方法。方法2是相對簡單和環(huán)保的滅菌方法,效果不一定最佳,但對于君子蘭果實75%酒精浸泡3 min完全可以。方法3是最環(huán)保的滅菌方法,對材料存在一定的風險,對君子蘭果實可行。

2.2 不同發(fā)育時期胚對誘導胚性愈傷組織的影響

授粉后60d有的無胚,有的胚只有1mm,胚乳水狀、透明,愈傷組織誘導成功率僅有10%;授粉后90 d的胚有3 mm,胚乳果凍狀、透明,愈傷組織誘導成功率30%;授粉后120 d的胚有5 mm,胚乳固態(tài)、半透明,愈傷組織誘導成功率60%(圖4)。授粉后150 d以上的胚大小如種子直徑,胚乳乳白色、不透明,愈傷組織誘導成功率80%以上(圖5)。

圖4 不同發(fā)育時期胚(分別為授粉后60 d、90 d和120 d的胚)

圖5 胚性愈傷組織誘導芽

2.3 不同激素組合對胚性愈傷組織誘導的影響

由試驗可知,6-BA和2,4-D對君子蘭胚培養(yǎng)都有作用,2,4-D的作用要強于6-BA,二者協(xié)同作用效果更好。如表3所示,隨著2,4-D濃度的增加愈傷組織的誘導率增加,6-BA濃度的增加對愈傷組織的誘導沒有遞增趨勢;6-BA與2,4-D共同作用效果更好。最佳組合為8、11、12、15和16號處理(表3)。

表3 不同濃度6-BA和2,4-D組合對胚性愈傷組織誘導的影響

2.4 君子蘭試管苗葉片不同部位誘導效果

葉片不同部位對誘導成功的影響起決定性作用,試驗表明:君子蘭幼嫩葉片各個部位均能誘導出愈傷組織(圖6),基部最易誘導出芽體(圖7)。

圖6 葉片誘導愈傷組織

圖7 葉片誘導芽

2.5 不同激素組合對君子蘭葉片誘導愈傷組織和不定芽的影響

由表4可知,9個不同處理除對照外都能誘導出不定芽,但總體誘導率不高;ZT和2,4-D組合對誘導影響比較大,當ZT為0時,隨著BA和2,4-D濃度升高誘導率升高;由處理3可知,BA為0 mg/L時對誘導率沒有影響;由處理4和處理7可知,當ZT為1 mg/L,隨著2,4-D濃度的增加誘導率增加;由處理3、處理5、處理7可知,當2,4-D一定時,添加ZT和未添加ZT對葉片誘導愈傷組織和叢生芽率影響顯著。

表4 不同濃度激素組合對君子蘭葉片誘導的影響

3 結(jié)論

本試驗可知君子蘭外植體種胚最佳采摘時間為授粉后120～150 d;最佳葉片誘導部位為基部;君子蘭芽苗獲得途徑一是通過胚性愈傷組織誘導,二是通過試管苗葉片基部誘導。最佳胚誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1～2 mg/L + 2,4-D 1～2 mg/L,胚性愈傷組織平均誘導率達到 80%;最佳葉片誘導愈傷組織和不定芽培養(yǎng)基為 MS+2,4-D 1.0 mg/L + ZT 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L。