2020—2021年冬春季銅仁市家禽高致病性禽流感專項(xiàng)監(jiān)測(cè)

王明周， 敖芳芳， 陶沿竹， 猛 洪， 白 明， 郭義軍， 陸安法， 賴 婧， 龍立書

(貴州省銅仁市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 銅仁 554300)

禽流感是由 A 型流感病毒引起的禽類傳染性疾病，按病原體類型可分為高致病性、低致病性、非致病性3大類。非致病性和低致病性禽流感的致死率較低[1]。高致病性禽流感由A型流感病毒的H5或H7亞型引起，占我國(guó)禽流感發(fā)病數(shù)的90%以上，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類動(dòng)物疫病[2]。近年來，銅仁市養(yǎng)殖家禽時(shí)有高致病性禽流感發(fā)生，嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和人民群眾的生命健康。為掌握全市高致病性禽流感病毒的感染情況，切實(shí)做好高致病性禽流感預(yù)警預(yù)報(bào)工作，及時(shí)防范疫情，保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，2020年12月至2021年3月分別在全市10個(gè)縣(區(qū))采集家禽咽肛拭子和養(yǎng)殖場(chǎng)、交易市場(chǎng)環(huán)境拭子進(jìn)行禽流感病毒(H5、H7亞型)監(jiān)測(cè)分析，現(xiàn)將監(jiān)測(cè)情況報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來源按照《貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心關(guān)于印發(fā)〈今冬明春高致病性禽流感專項(xiàng)監(jiān)測(cè)工作方案〉的通知》要求，每個(gè)縣(區(qū))隨機(jī)抽檢1個(gè)規(guī)模場(chǎng)(或種禽場(chǎng))，每個(gè)場(chǎng)采集雙棉咽肛拭子樣品30份；隨機(jī)抽檢1個(gè)活禽交易市場(chǎng)(或屠宰場(chǎng)點(diǎn))，每個(gè)場(chǎng)(點(diǎn))采集咽肛雙棉拭子樣品30份及環(huán)境樣品30份。全市10個(gè)縣(區(qū))共抽檢13個(gè)規(guī)模場(chǎng)(種禽場(chǎng))和9個(gè)活禽交易市場(chǎng)(屠宰場(chǎng)點(diǎn))，共計(jì)890份樣品。

1.2 樣品采集與保存樣品類型為咽肛拭子和環(huán)境拭子。在采集樣品的過程中，采樣人員全程穿戴一次性無菌防護(hù)服、口罩和手套，采用無菌干棉拭子和1.5 mL離心管采集雞咽喉和肛門的分泌液。采集完成的樣品4 ℃冷藏運(yùn)輸，于12 h內(nèi)送至市中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冷凍保存。每管拭子樣品加入含有5 000 IU/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素1 mL的PBS液，浸泡2 h，3 000 r/min離心15～20 s，備用。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 主要試劑禽流感病毒H5亞型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒(北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：Q02-003-201106)、禽流感病毒H7亞型qRT-PCR檢測(cè)試劑盒(北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：Q02-004-201019)、病毒DNA/RNA提取試劑盒(西安天隆科技有限公司，批號(hào)：20160810T036)。

1.3.2 主要儀器核酸全自動(dòng)提取儀(西安天隆科技有限公司，型號(hào)：NP968-C)、熒光定量PCR儀(德國(guó)IBA公司，型號(hào)：7500)。

1.3.3 病毒RNA提取按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書方法提取各樣品總RNA。

1.3.4 樣品檢測(cè)與結(jié)果判定反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法進(jìn)行。

1.3.4.1 禽流感病毒H5亞型擴(kuò)增程序(1)按照每個(gè)反應(yīng)體系：qRT-PCR反應(yīng)液20 mL加酶混合物1 mL，計(jì)算樣品總數(shù)，對(duì)應(yīng)樣品總數(shù)分別分裝20 mL到相應(yīng)的八連管中，然后添加模板RNA溶液5 mL，總反應(yīng)體系25 mL。(2)將加樣后的八連管放入熒光定量PCR檢測(cè)儀內(nèi)，設(shè)置反應(yīng)參數(shù)：第1階段反轉(zhuǎn)錄42 ℃ 15 min；第2階段預(yù)變性94 ℃ 3 min；第3階段94 ℃ 15 s，53 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。在第3階段每次循環(huán)的60 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。(3)結(jié)果判定：Ct值≥40且無特異性擴(kuò)增曲線，判為陰性；Ct值≤30且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判為陽性；3030則判為陽性，否則為陰性。

1.3.4.2 禽流感病毒H7亞型擴(kuò)增程序(1)按照每個(gè)反應(yīng)體系：qRT-PCR反應(yīng)液15 mL加酶混合物1 mL，計(jì)算好各試劑的使用量，加入1個(gè)適當(dāng)體積的無酶離心管中，充分混勻，每管15 mL分裝八連管中，然后分別加入檢測(cè)樣品、陰性和陽性對(duì)照RNA溶液10 mL，總反應(yīng)體系25 mL。(2)設(shè)置反應(yīng)參數(shù)：第1階段反轉(zhuǎn)錄42 ℃ 30 min；第2階段預(yù)變性92 ℃ 2 min；第3階段92 ℃ 10 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共5個(gè)循環(huán)；第4階段92 ℃ 15 s，53 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。在第4階段每次循環(huán)的60 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。(3)結(jié)果判定：Ct值≥40且無特異性擴(kuò)增曲線，判為陰性；Ct值≤30且出現(xiàn)典型S形曲線，判為陽性；30

2 結(jié)果

由表1可見：本次禽流感病毒(H5、H7亞型)專項(xiàng)監(jiān)測(cè)共檢測(cè)13個(gè)家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)(種禽場(chǎng))、9個(gè)活禽交易市場(chǎng)(屠宰場(chǎng)點(diǎn))，檢測(cè)樣品共計(jì)890份，基本覆蓋了全市所有縣(區(qū))，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

表1 2020—2021年冬春季銅仁市高致病性禽流感病毒(H5、H7亞型)檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

2020—2021年冬春季銅仁市10個(gè)縣(區(qū))的13個(gè)家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)(種禽場(chǎng))、9個(gè)活禽交易市場(chǎng)(屠宰場(chǎng)點(diǎn))高致病禽流感病毒(H5、H7亞型)監(jiān)測(cè)結(jié)果均為陰性，發(fā)生高致病性禽流感疫情的風(fēng)險(xiǎn)較低。

4 分析與討論

4.1防控動(dòng)物疫病主要是做好3大環(huán)節(jié)的處置，即消滅傳染源、切斷傳播途徑、保護(hù)易感動(dòng)物。動(dòng)物調(diào)運(yùn)監(jiān)管在切斷疫病傳播途徑方面具有重要意義。近年來，銅仁市不斷加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物尤其是家禽的調(diào)運(yùn)監(jiān)管力度。按照新修訂的《貴州省動(dòng)物防疫條例》(2018年1月1日起施行)規(guī)定，我市要求屠宰、經(jīng)營(yíng)、運(yùn)輸前的家禽必須在所在地縣級(jí)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)申報(bào)檢疫，檢疫合格后需附有動(dòng)物檢疫合格證明，對(duì)于引種或宰殺銷售的家禽必須出具高致病性禽流感等動(dòng)物疫病檢測(cè)合格報(bào)告，到達(dá)所在目的地后，需轉(zhuǎn)運(yùn)、分銷的家禽必須在所在地動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)申報(bào)動(dòng)物檢疫合格證。上述家禽調(diào)運(yùn)監(jiān)管措施在一定程度上防止了高致病性禽流感等重大動(dòng)物疫病在我市的傳播。

4.2鄒聯(lián)斌等[3]調(diào)查研究表明，為防止外環(huán)境中高致病性禽流感的發(fā)生，必須要提高生物安全措施、做好免疫接種、加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查工作、提高獸醫(yī)機(jī)構(gòu)效能。近年來，我市動(dòng)物疫控中心每年的春秋兩防監(jiān)督檢查發(fā)現(xiàn)，各縣(區(qū))絕大多數(shù)肉雞或蛋雞規(guī)模場(chǎng)、中小養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)高致病性禽流感病毒(H5、H7亞型)免疫存在過度接種的現(xiàn)象，大多1年接種4～5次。在保護(hù)易感動(dòng)物方面，免疫接種是預(yù)防高致病性禽流感最有效的1種措施。本次監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，免疫接種能夠有效保護(hù)家禽對(duì)禽流感病毒的侵襲，但合理的接種次數(shù)還需進(jìn)一步探索和優(yōu)化。在消滅傳染源方面，對(duì)飼養(yǎng)場(chǎng)地及活禽交易市場(chǎng)環(huán)境多頻次消毒是1種有效措施。近年來，我市對(duì)活禽交易市場(chǎng)加強(qiáng)了消毒管理，對(duì)全市范圍內(nèi)的活禽交易市場(chǎng)施行“1110”管理制度，即“一天一清洗、一天一消毒、一周一掃除、每天零存欄”，多種消毒藥品交替使用，如氯制劑、戊二醛類消毒藥能夠有效殺滅禽流感病毒。本次針對(duì)活禽交易市場(chǎng)的檢測(cè)結(jié)果均為陰性也提示了多頻次消毒能夠有效消滅病原。

4.3趙婉莎、王喜云等[4，5]研究表明，活禽交易市場(chǎng)中家禽宰殺案板、籠具部位的高致病性禽流感病毒含量最高。本次監(jiān)測(cè)按方案要求沒有對(duì)宰殺案板、籠具進(jìn)行采樣，以后的監(jiān)測(cè)方案可考慮增加此2項(xiàng)內(nèi)容。盡管本次對(duì)環(huán)境的監(jiān)測(cè)結(jié)果均為陰性，但由于冬春季是禽流感高發(fā)季節(jié)，加上部分養(yǎng)殖場(chǎng)需要補(bǔ)欄出苗，對(duì)高致病性禽流感的防控仍不能掉以輕心，應(yīng)持續(xù)加大排查力度，及時(shí)做好免疫監(jiān)測(cè)，做到“應(yīng)免盡免，不足補(bǔ)免”。