菠蘿AcPLD2基因多克隆抗體制備及其在果實(shí)黑心病發(fā)生中的表達(dá)分析

洪克前　谷會(huì)　陳 麗　姚全勝

摘? 要：菠蘿是中國(guó)最具有特色和競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的熱帶水果之一，但采后菠蘿果實(shí)不耐貯藏，極易發(fā)生黑心病，嚴(yán)重影響果實(shí)品質(zhì)和商品率，而且威脅菠蘿產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此減少采后菠蘿損失直接關(guān)系到熱區(qū)農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。黑心病是采后菠蘿果實(shí)一種常見的生理性病害，由于該病的生理機(jī)制尚不清楚，所以國(guó)內(nèi)外尚未有完全控制黑心病發(fā)生的方法。目前關(guān)于菠蘿黑心病的研究主要集中于黑心病生理過程描述和采后實(shí)用處理技術(shù)領(lǐng)域，而對(duì)其機(jī)理認(rèn)識(shí)不足，嚴(yán)重制約了對(duì)黑心病問題的根本解決。前期的研究表明，菠蘿果實(shí)基因可能參與了黑心病發(fā)生，但對(duì)其生理功能尚未解析。為了探究基因在采后菠蘿果實(shí)黑心病中作用，制備了基因多克隆抗體?；蛉L(zhǎng)為2439個(gè)核苷酸，編碼813個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量約為91?kDa，選取一個(gè)親水性較高的片段即全長(zhǎng)中N端第1～333個(gè)氨基酸序列，分子量大約57?kDa;將該序列片段插入到原核表達(dá)載體pET-30a（+）多克隆位點(diǎn)HⅠ和RⅠ之間，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-AcPLD2，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)菌體蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果表明重組蛋白成功獲得了高效表達(dá)，分子量約為57?kDa。重組蛋白經(jīng)純化后免疫新西蘭兔，獲得了多克隆抗血清，采用Protein A/G純化法對(duì)抗血清進(jìn)行了純化。將純化后的抗血清通過間接酶聯(lián)免疫分析，測(cè)定其效價(jià)比可達(dá)1∶1?600?000，表明所制備的抗體具有很好的靈敏性。進(jìn)一步采用不同黑心病癥狀的菠蘿果實(shí)組織總蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在分子量91 kDa左右處出現(xiàn)特異的蛋白質(zhì)條帶，表明所制備的抗體可與菠蘿AcPLD2蛋白特異性結(jié)合，且具有良好的特異性，暗示AcPLD2蛋白可能參與菠蘿果實(shí)黑心病有一定的關(guān)系該研究結(jié)果擴(kuò)展了基因功能的認(rèn)識(shí)，有利于進(jìn)一步闡明采后菠蘿果實(shí)黑心病的發(fā)生機(jī)制。

關(guān)鍵詞：菠蘿;基因;原核表達(dá);多克隆抗體;黑心病

中圖分類號(hào)：S311??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Preparation of the Polyclonal Antibody and Expression Profiles of Gene in Internal Browning of Pineapple Fruits

HONG Keqian GU Hui ?CHEN Li YAO Quansheng

South Subtropical Crops Research Institutes， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products of Hainan Province， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Pineapples are one of the fruits with the most characteristic and competitive edge in China. Postharvest pineapple fruits are susceptible to internal browning （IB）， which seriously affects fruit quality and commodity rate and further threatens the healthy development of pineapple industry. Therefore， it is important that declining the loss the postharvest pineapple fruits which is directly related to economic income of farmers in thermal region. IB which is a complex physiological disorder during postharvest storage periods， causes the considerable losses to pineapple producing countries. An effective method that can eliminate IB occurrence is unavailable to date. Nowadays， the study on IB is focused on description of physiological process and practical treatment technology of IB. Lack of understanding of IB mechanism restricts the utterly resolution of the disorder. We have reported that in pineapple fruits is putatively involved in IB of pineapple during postharvest storage previously. However， the physiological function of gene in IB has not been analyzed till now. To investigate the role of gene in IB of the postharvest pineapple fruits， its polyclonal antibody was prepared. The Full-length of gene includes 2439 nucleotides and encodes 813 amino acids （AAs）， with the predicted molecular weights of 91 kDa， of which the N terminal amino acid starting from one AA to 333 AA and an about 57 kDa with high hydrophilicity fragment was selected. The fragment of gene was inserted into the polyclone sites between H I and R I of the prokaryotic expression vector pET-30a（+） for constructing the recombinant plasmid pET-AcPLD2. The recombinant plasmid was transformed into BL21 （DE3） cells to induce the protein expression. The expression product was identified with high efficiency and an about 57 kDa by SDS-PAGE. The fusion protein was obtained using Protein A/G purification method， then the purified fusion protein was used as the antigen to prepare the polyclonal antiserum in rabbits. Indirect ELISA test indicated that the purified antiserum had good sensitivity with a titer of 1∶1?600?000. Further western blot assay showed that a 91 kDa peptide was specifically detected in the total proteins of different IB pineapple fruits with anti-AcPLD2 polyclonal antibody， indicating that the antibody could react to the total proteins expressed in pineapple specifically， suggesting that AcPLD2 protein may be involved in regulating in IB of pineapple fruits. Data from the present study will expand the knowledge of gene， which throws more light on the reasons for IB in the postharvest pineapple fruits.

pineapple; gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody; internal browning

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.003

磷脂酶D（PLD; EC3.1.4.4）是一類植物組織中普遍存在，催化細(xì)胞膜的主要組分磷脂類物質(zhì)水解，產(chǎn)生磷脂酸和親水性的膽堿等的酶類，目前已在多種植物如水稻、玉米、擬南芥、甘藍(lán)、煙草、番茄、草莓、龍眼和菠蘿等獲得基因cDNA全長(zhǎng)序列。植物PLD除了具有水解酶功能外，還參與細(xì)胞的一系列代謝活動(dòng)，如生長(zhǎng)發(fā)育，多種激素信號(hào)途徑，包括脫落酸、水楊酸和生長(zhǎng)素等，環(huán)境脅迫包括干旱、低溫、磷饑餓、抗病、脂質(zhì)信號(hào)調(diào)控、次生代謝、油脂代謝和免疫反應(yīng)等一系列生理活動(dòng)。因此，深入研究植物基因?qū)δ婢车姆磻?yīng)及其生理功能，對(duì)篩選抗逆相關(guān)基因以及提高作物的抗逆性有重要的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值。

采后菠蘿（ L.）果實(shí)貯藏期間極易遭受黑心?。ㄒ环N復(fù)雜的生理性紊亂）侵襲，從而限制了其貯藏期并導(dǎo)致品質(zhì)劣變，損失巨大。本研究從菠蘿果實(shí)中分離到10個(gè)基因家族成員，命名為～;實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果表明基因表達(dá)與采后菠蘿果實(shí)黑心病密切相關(guān)。為了進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平上研究基因功能，本研究中根據(jù)基因序列，選擇其親水性較高的序列插入到原核表達(dá)載體pET-30a（+）中，構(gòu)建pET-AcPLD2原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化目的蛋白，并制備了基因多克隆抗體，并采用采后菠蘿果實(shí)貯藏過程中不同黑心病癥狀樣品進(jìn)行Western blot分析，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況，旨在為進(jìn)一步研究基因的生理功能奠定基礎(chǔ)。

? 材料與方法

? 材料

1.1.1? 植物材料? 供試的菠蘿品種為‘巴厘’（ L. cv. ‘Comte de Paris’），果實(shí)于2018年8月采自廣東省徐聞縣一菠蘿果園（2034￠ N;11017￠ E），采收成熟度為綠熟，即果眼較平且果皮的綠色面積占比達(dá)90%以上。

1.1.2? 主要試劑? 質(zhì)粒pET-30a（+），DH5α，BL21（DE3）均由Abmart公司提供。限制性內(nèi)切酶HⅠ、R I購自諾唯贊生物有限公司;T DNA連接酶、載體pMD18-T、膠回收試劑盒、DNA marker購自大連寶生物工程有限公司;脫脂奶粉、Ni-NTA瓊脂糖凝膠樹脂、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PVDF膜蛋白質(zhì)、Marker購自Bio-Rad公司;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自Promega公司;化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（ECL）購自Thermo Scientific公司;其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

?方法

1.2.1? 材料處理? 菠蘿果實(shí)采收后3?h內(nèi)運(yùn)至南亞熱帶作物研究所實(shí)驗(yàn)室，立即挑選大小相近、無機(jī)械損傷和無病蟲害的果實(shí)，采用0.05%（/）施保功浸泡2?min進(jìn)行表面殺菌，然后用無菌水沖洗干凈后，置于常溫下晾干備用。用聚乙烯薄膜袋包裝放入25℃恒溫箱中貯藏。分別在貯藏第0、3、6天時(shí)取樣。取樣時(shí)將菠蘿果實(shí)中部橫切，選取距離果心約15?mm范圍內(nèi)的果肉部分用液氮速凍并儲(chǔ)存于?80℃?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20個(gè)果實(shí)，共180個(gè)果實(shí)。

1.2.2 ?基因片段的擴(kuò)增? 根據(jù)已克隆的基因（登錄號(hào)：Aco018572.1）全長(zhǎng)（813個(gè)氨基酸）中N端第1～333個(gè)氨基酸之間的cDNA序列，引入R I和HⅠ酶切位點(diǎn)。正向引物：5￠-GGAATTCCATGGCTACAGAGG ATTCT-3￠，反向引物：5￠-CGCGCTCCGTC CCGACCTCG-3￠（下劃線為酶切位點(diǎn)）。以綠熟階段的菠蘿果肉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，回收并純化目的DNA片段，與pMD19-T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD- AcPLD2。經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切2種方法檢測(cè)確認(rèn)已插入正確的質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序，確認(rèn)陽性克隆提取質(zhì)粒DNA。

1.2.3? pET-AcPLD2原核表達(dá)載體的構(gòu)建 ?使用質(zhì)粒提取試劑盒提取測(cè)序正確包含基因的T載體重組質(zhì)粒，用R I和HⅠ進(jìn)行雙酶切，回收特定的基因片段，與經(jīng)R I和HⅠ雙酶切的pET-30a（+）載體，利用T DNA連接酶在16℃下進(jìn)行定向連接，獲得原核表達(dá)載體pET-，預(yù)測(cè)重組蛋白的分子量約為57?kDa。經(jīng)PCR和酶切鑒定后選取正確的質(zhì)粒DNA，重組蛋白pET-轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。

1.2.4? pET-AcPLD2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)? 分別挑取陽性重組質(zhì)粒pET-和空白載體pET-30a（+）的 BL21，接種至2?mL含有卡那霉素（Kan，50?μg/mL）的液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)8 h。從中取500?mL，按1∶100的比例接種于相同的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，放置于37℃振蕩培養(yǎng)至為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0?mmol/L后，置于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4?h。收集2 L菌液，12?000×離心1?min，棄上清液，收集沉淀，用100?μL 2×SDS凝膠加樣緩沖液重懸，盡量使菌塊全部懸起，混勻后沸水浴5?min，12?000×離心1?min。取上清液進(jìn)行SDS-PAGE（3%濃縮膠，12%分離膠）電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.5? pET-AcPLD2重組蛋白的純化? 按照高寧等的方法進(jìn)行，將重組蛋白pET-AcPLD2的菌體誘導(dǎo)4?h后，裂解液破碎重組蛋白的菌體，12?000×離心10?min，收集上清液，0.45?μm濾膜過濾去除雜質(zhì)后，進(jìn)一步采用Protein A/G純化蛋白。將純化的蛋白用12% SDS-PAGE進(jìn)行分離，將電泳后的凝膠用蒸餾水淋洗干凈，在預(yù)冷的0.25?mol/L KCl中浸泡染色2～5?min后即可顯色，顯色后從凝膠上切下目的條帶，然后用12% SDS- PAGE檢測(cè)所分離的重組蛋白產(chǎn)物濃度。

1.2.6? 多克隆抗體制備、效價(jià)測(cè)定? 取純化的AcPLD2融合蛋白（約600?μg）作為抗原，免疫接種成年新西蘭雄性兔2只，2周后加強(qiáng)免疫1次，免疫5次后從頸動(dòng)脈插管收集全血，分離血清，?20℃保存。用Protein A/G純化抗血清后獲得AcPLD2多克隆抗體?？贵w效價(jià)測(cè)定采用間接ELISA法。

1.2.7? Western blot檢測(cè)? 參考王卓等的方法提取菠蘿果肉組織總蛋白，采用Bio-Rad公司的Quick Start Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)定所提取的蛋白含量，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考洪克前等的方法進(jìn)行Western blot分析：取50?μg菠蘿果肉組織總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，通過電轉(zhuǎn)移法將菠蘿組織總蛋白轉(zhuǎn)印至0.2?μm PVDF膜上。電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)后的PVDF膜放入3%的脫脂奶粉中封閉3?h。以本實(shí)驗(yàn)制備的AcPLD2多克隆抗體為一抗（1∶3000），室溫下在搖床上輕搖反應(yīng)3?h，然后用TBST（TBS+0.05% Tween-20）洗膜3次，每次8?min。用TBST把HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG按照1∶3000的比例進(jìn)行稀釋，室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次8?min。把洗好的膜用化學(xué)發(fā)光劑ECL孵育膜3?min，在暗室用X光膠片曝光檢測(cè)。

?結(jié)果與分析

2.1? 基因片段的分離

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到長(zhǎng)度約為1000 bp DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。將此片段連接到pMD19-T載體上，選擇陽性克隆測(cè)序，經(jīng)菌液PCR及測(cè)序驗(yàn)證顯示核苷酸序列與原序列完全一致（圖1）。表明已成功分離到菠蘿基因片段cDNA序列，具有正確編碼框和酶切位點(diǎn)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

原核表達(dá)載體的鑒定

pET-30a（+）為5.9?kb左右的具有多克隆位點(diǎn)的原核表達(dá)載體。將測(cè)序正確的包含基因的T載體重組質(zhì)粒酶切，然后將基因片段插入到同樣經(jīng)雙酶切的原核表達(dá)載體pET-30a（+）上，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α受體細(xì)胞，37℃、100?r/min培養(yǎng)8?h，挑取單克隆并對(duì)構(gòu)建的pET-質(zhì)粒進(jìn)行HⅠ和R I雙酶切，產(chǎn)物呈現(xiàn)出清晰的2條帶，分別為pET-30a（+）（5900?bp）和（999?bp）（圖2），表明目的基因與載體連接成功，并將測(cè)序正確的陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中。

重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將含有pET-原核表達(dá)載體的大腸桿菌菌液和空載體pET-30a（+）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4?h后，通過SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量。重組菌體誘導(dǎo)后超聲波破碎、離心，收集上清，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，該重組蛋白以可溶性形式表達(dá);含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生大量分子量約57 kDa的表達(dá)產(chǎn)物，與預(yù)期目的蛋白大小一致，而空載體和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒沒有出現(xiàn)目標(biāo)蛋白，表明目的基因在該表達(dá)系統(tǒng)中獲得了正確表達(dá)。AcPLD2融合蛋白經(jīng)大量誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)所獲得的重組蛋白用Protein A/G純化后，進(jìn)一步經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)得到了57?kDa的目的條帶（圖3），表明純化效果較好，可用作抗原免疫新西蘭白兔。

多克隆抗體制備及效價(jià)分析

將純化后的AcPLD2融合蛋白作為抗原免疫新西蘭兔，得到抗血清，進(jìn)一步經(jīng)Protein A/G純化獲得多克隆抗體。以AcPLD2純化蛋白包被96孔板（每孔濃度皆為0.1?μg/mL），以未免疫的正常兔血清為對(duì)照，以常規(guī)間接ELASA法測(cè)定抗體效價(jià)。由圖4可看出，當(dāng)抗體的稀釋倍數(shù)達(dá)1?600?000時(shí)，值為0.5，即認(rèn)為該稀釋度為抗體的效價(jià)，利用這一濃度可有效地檢測(cè)到抗原，表明本研究制備的抗體具有很高的檢測(cè)靈敏度，可用于后續(xù)研究。

?菠蘿組織黑心病進(jìn)程中蛋白的表達(dá)分析

為進(jìn)一步了解AcPLD2蛋白在菠蘿黑心病中作用，選取不同黑心病癥狀的菠蘿果實(shí)進(jìn)行Western blot表達(dá)分析。剛剛采收的菠蘿于25℃貯藏，第0天時(shí)，果肉中沒有黑心病癥狀;貯藏至第3天時(shí)，肉眼可分辨黑心病癥狀，黑心指數(shù)約為0.2;貯藏至第6天時(shí)，其黑心病指數(shù)達(dá)0.9（圖5）。采用Western blot技術(shù)分析上述不同菠蘿果實(shí)不同黑心病癥狀的AcPLD2蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，25℃貯藏第0～3天時(shí)，果肉中AcPLD2蛋白沒有表達(dá)，貯藏至第6天時(shí)，果肉中檢測(cè)到AcPLD2

蛋白的表達(dá)，分子量約為91?kDa。同時(shí)，AcPLD2重組蛋白表達(dá)清晰，分子量約為57?kDa（圖6），進(jìn)一步證實(shí)了本研究制備的抗體具有良好的特異性。上述結(jié)果表明，菠蘿黑心病發(fā)生至第6天時(shí)，AcPLD2蛋白在菠蘿果肉中顯著表達(dá)。

討論

采后菠蘿果實(shí)極易發(fā)生黑心病，導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)劣變，損失巨大。菠蘿黑心病分子機(jī)制尚不清楚，因此，揭示黑心病分子機(jī)制不僅能提高果實(shí)貯藏品質(zhì)和潛力，而且對(duì)于菠蘿育種意義重大。目前，利用各種載體在各種表達(dá)系統(tǒng)獲得融合蛋白是分子生物學(xué)常用技術(shù)，尤其是原核表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此原核表達(dá)重組蛋白免疫動(dòng)物來制備抗體已成為研究蛋白質(zhì)性質(zhì)與功能的一種行之有效的方法。

本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)，將基因親水性較高的片段克隆到pET-30a（+）原核表達(dá)載體上，利用純化的重組蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，其ELISA效價(jià)比可達(dá)1∶1?600?000;Western blot表達(dá)顯示，該抗體不僅能識(shí)別在大腸桿菌原核表達(dá)的AcPLD2融合蛋白，而且還可特異識(shí)別菠蘿組織總蛋白中的AcPLD2蛋白，這些結(jié)果表明所制備的抗體效價(jià)高、靈敏度高和特異性好。

植物中PLD是一類重要的信號(hào)酶，參與多種逆境信號(hào)脅迫。自1994年在蓖麻中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)PLD基因以來，植物中越來越多的PLD基因被注釋。此外，目前對(duì)PLD所開展的調(diào)控機(jī)制的研究主要針對(duì)擬南芥和水稻等模式植物，對(duì)于重要的經(jīng)濟(jì)作物如果實(shí)等非模式植物這方面所開展的研究報(bào)道比較少。另外，植物中PLD功能研究多集中在生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境脅迫方面，而PLD參與調(diào)控采后果實(shí)品質(zhì)仍然了解較少，尤其針對(duì)菠蘿PLD的研究尚未見報(bào)道。本研究中，利用制備的AcPLD2多克隆抗體初步研究發(fā)現(xiàn)，菠蘿果實(shí)在25℃貯藏6?d時(shí)，隨著黑心指數(shù)的增加，AcPLD2蛋白表達(dá)明顯可見，暗示AcPLD2蛋白參與黑心病進(jìn)程，進(jìn)而推測(cè)AcPLD2蛋白與采后菠蘿果實(shí)的黑心病有一定的關(guān)聯(lián)。有關(guān)AcPLD2蛋白參與菠蘿果實(shí)黑心病的機(jī)制，將有待進(jìn)一步研究。

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15. 收稿日期 2021-03-29;修回日期 2021-09-10

    基金項(xiàng)目 海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 320MS087）;中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)——中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院院

    級(jí)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No. 1630062017032，No. 1630062017031）。

    作者簡(jiǎn)介 洪克前（1968—），男，博士，副研究員，研究方向：熱帶果蔬采后貯藏與保鮮。*通信作者（Corresponding author）：

    姚全勝（YAO Quansheng），E-mail：yqsh1028@163.com。