特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和肺動(dòng)脈壓力的關(guān)系研究

張 韓，李彥明，萬琪琳，程冠昌，洪 巖，陳君柱

肺動(dòng)脈高壓 (pulmonary artery hypertension，PAH)是一種臨床綜合征，可由許多心、肺和肺血管疾病引起。特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓 (idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH)是PAH的一種，典型的病理改變?yōu)楹笮?dòng)脈中膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞呈向心性單克隆性叢樣增生［1］。其發(fā)生機(jī)制不是十分清楚，最近的研究認(rèn)為和內(nèi)皮系統(tǒng)的失衡有關(guān)，也是本文的研究對象，內(nèi)皮祖細(xì)胞 (endothelial progenitor cells，EPCs)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，參與血管形成內(nèi)皮損傷后的修復(fù)，對于內(nèi)皮平衡的保持起到一定的作用［2］。本文通過觀察28例IPAH患者外周血EPCs數(shù)量，分析EPCs與平均肺動(dòng)脈壓力之間的關(guān)系，為探討PAH新的治療方法提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年1月—2010年6月住院的28例IPAH患者為IPAH組，均參照世界衛(wèi)生組織2003年的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男10例，女18例;平均年齡 (33.1±10.4)歲，右心飄浮導(dǎo)管測定肺動(dòng)脈壓力［3］。選擇同期健康志愿者20例為對照組，其中男8例，女12例;平均年齡 (2.1±10.1)歲。兩組患者均排除糖尿病、腎病、腫瘤、骨折及近期外傷病史者，兩組患者性別、年齡具有均衡性。

1.2 方法

1.2.1 肺動(dòng)脈壓力的測定 右心漂浮導(dǎo)管由本院心導(dǎo)管室完成。

1.2.2 EPCs的培養(yǎng) 無菌采集空腹外周血20ml，離心后獲取單個(gè)核細(xì)胞，接種在人培養(yǎng)板上，培養(yǎng)板由連接蛋白 (fibronectin)包被，4d后換液繼續(xù)培養(yǎng)，7d后進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)分析。采用激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-Ⅰ和 DiI-acLDL雙染色陽性細(xì)胞，認(rèn)為是正在分化的EPCs，用倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)EPCs數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，以α=0.05(雙側(cè))作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。相關(guān)性分析采用雙變量相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 外周血EPCs的鑒定 以梭形黏附細(xì)胞作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)4d可出現(xiàn)梭形細(xì)胞，7d后梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞數(shù)較前增加。通過共聚焦顯微鏡鑒定UEA-Ⅰ和DiLDL雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs(見圖1)，在倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)3個(gè)隨機(jī)選擇視野 (×200)的EPCs，IPAH組細(xì)胞較對照組明顯減少。

圖1 正在分化的EPCsFigure 1 EPCs of the differentiation

2.2 兩組外周血 EPCs數(shù)量比較 對照組外周血 EPCs為(34.7±7.6) 個(gè)，IPAH 組外周血 EPCs為 (61.6 ±10.4) 個(gè)，兩組外周血EPCs數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

2.3 平均肺動(dòng)脈壓力及EPCs水平的相關(guān)性分析 28例IPAH患者經(jīng)右心漂浮導(dǎo)管檢查，平均肺動(dòng)脈壓力和外周血EPC數(shù)量做相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)二者呈負(fù)相關(guān) (r=-0.625，P＜0.001)。

3 討論

IPAH的典型病理改變?yōu)榉窝苄?dòng)脈中膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞呈向心性單克隆從狀增生，內(nèi)皮細(xì)胞增殖紊亂，平滑肌細(xì)胞無限增殖，但平滑肌凋亡減少，導(dǎo)致血管中膜增厚，管腔狹窄，肺毛細(xì)血管叢狀增生，毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷和修復(fù)不平衡，導(dǎo)致肺毛細(xì)血管阻力增加，進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力升高，最終引起右心功能不全，導(dǎo)致死亡［4］。

在1997年Asahara等［5］首次發(fā)現(xiàn)了EPCs，其特征是表面CD+34或VEGFR-2+陽性，并且在體外能增殖、轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。目前，鑒定EPCs的方法主要有兩種［6］:(1)流式方法檢測:CD34、Flk-1、vWF和CD133等表面標(biāo)志陽性的細(xì)胞;(2)熒光顯微鏡雙染色鑒定。本研究采用的熒光雙染色鑒定EPCs的方法被證實(shí)是可靠的，已廣泛應(yīng)用于EPCs的鑒定［7］。

本研究表明，IPAH患者循環(huán)血中EPCs數(shù)量降低和肺動(dòng)脈壓力呈負(fù)相關(guān)，提示EPCs數(shù)量降低可能減弱EPCs修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，EPCs在PAH形成過程中起一定的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，IPAH確診時(shí)肺動(dòng)脈平均壓力80%都 ＞40mmHg(1mmHg=0.133kPa)，屬于3級PAH階段，可能在發(fā)病早期，由于患者癥狀輕及醫(yī)護(hù)人員的認(rèn)識不足導(dǎo)致延誤診斷。因此，尋找一些簡單的客觀指標(biāo)顯得特別重要，本研究結(jié)果提示外周血EPCs數(shù)量可能對診斷IPAH有一定的幫助。

1 Cool CD，Stewart JS，Werahera P，et al.Three-dimensional reconstruction of pulmonary arteries in plexiform pulmonary hypertension using cell-specific marlcer:evidence for a dynamic and heterogeneous process of pulmonary endothelial cell growth ［J］.Am J Pathol，1999，155:411-419.

2 Suzuki T，Nishida M，F(xiàn)utami S，et al.Neoendothelialization after peripheral blood stem cell transplantation in humans.A case report of a Tokaimura nuclear accident victim ［J］.Cardiovasc Res，2003，58:487-492.

3 Teichert-Kuliszewska K，Kutryk MJ，Kuliszewski MA，et al.Bone morphogenetic protein receptor-2 signaling promotes pulmonary arterial endothelial cell survival:implications for loss-of-function mutations in the pathogenesis of pulmonary hypertension ［J］.Circ Res，2006，98:209-217.

4 Rhodes CJ，Howard LS，Busbridge M，et al.Iron deficiency and raised hepcidin in idiopathic pulmonary arterial hypertension:clinical prevalence，outcomes，and mechanistic insights［J］.Am Coll Cardiol，2011，58(3):300-309.

5 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative endothelial progenitor cells for angiogenesis ［J］.Science，1997，275(5302):964-967.

6 Heilmann C，Beyersdorf F，Lutter G.Collateral growth:cells arrive at the construction site ［J］.Cardiovasc Surg，2002，10(6):570-578.

7 Evis H，Bu DX，Barry IH，et al.Vascular and inflammatory stresses mediateatherosclerosis via RAGE and its ligands in apoE-/-mice［J］.J Clin Invest，2008，118(1):183-194.