兩種霍亂弧菌檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用研究

鞏西玲

霍亂是由霍亂弧菌感染引發(fā)的一種流行廣泛的甲類傳染病。而霍亂弧菌是腸道傳染病霍亂的病原體，被感染者可表現(xiàn)為劇烈嘔吐、腹瀉、脫水，甚至導(dǎo)致死亡［1］。該病的發(fā)病率及病死率很高，曾在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)過(guò)多次大流行，對(duì)于霍亂的防治的關(guān)鍵在于對(duì)霍亂疫區(qū)的外環(huán)境標(biāo)本進(jìn)行及時(shí)監(jiān)測(cè)。對(duì)霍亂弧菌做出快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)是對(duì)霍亂預(yù)防、控制的主要方法。但其檢測(cè)一直是困擾微生物檢驗(yàn)工作的一個(gè)難題，尤其是外環(huán)境水質(zhì)和食品中霍亂弧菌的檢測(cè)，根據(jù)國(guó)內(nèi)、外大量學(xué)者的研究，建立了許多有效的檢測(cè)方法，并已作為目前臨床的常用檢測(cè)手段廣泛應(yīng)用。但霍亂弧菌在自然生存狀態(tài)下的帶菌量很少，常由于機(jī)制不清晰，同時(shí)，外環(huán)境標(biāo)本摻雜大量其他菌群，從而導(dǎo)致霍亂弧菌的分離鑒定比較困難。常規(guī)培養(yǎng)法無(wú)法檢出霍亂弧菌，為了有效提高外環(huán)境中霍亂弧菌的檢出率，避免漏檢的發(fā)生，我們采用熒光定量PCR檢測(cè)方法，不僅提高了常規(guī)檢測(cè)方法的靈敏度，而且可以有效避免聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法帶來(lái)的假陽(yáng)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 樣品來(lái)源 根據(jù)我市的霍亂病監(jiān)測(cè)規(guī)定，將批發(fā)市場(chǎng)，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，餐廳暫養(yǎng)，銷售的海、水產(chǎn)品共100份進(jìn)行標(biāo)本采集。

1.1.2 樣品種類 所采集的標(biāo)本100份共分5大類:包括魚(yú)類 (20份):帶魚(yú)、黃瓜魚(yú)、金錢魚(yú)、鱔魚(yú)、鱸魚(yú)、鯽魚(yú)、鯧魚(yú)等;貝殼類 (20份):鮑魚(yú)、牡蠣、蟶子、鐵釘螺等;甲殼類 (20份):螃蟹、草蝦、河蝦等;蛙類 (20份):牛蛙、青蛙;水母類動(dòng)物 (15份);甲魚(yú) (5份)。

1.1.3 試劑 堿性胨水和四號(hào)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋生物試劑有限公司的半成品粉劑，霍亂診斷血清購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，所有產(chǎn)品都在有效期內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)分離鑒定法 霍亂弧菌屬需氧或兼性厭氧菌，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求也不高，通常采用濃縮堿性胨水作為選擇性增菌培養(yǎng)基。具體方法:海產(chǎn)品20g加225ml堿性胨水;將pH值調(diào)至9.0，其增菌10h，取上層培養(yǎng)物接種到10ml堿性胨水中，做二次增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)8h，兩次均劃四號(hào)瓊脂平板進(jìn)行分離培養(yǎng)，每個(gè)平板挑取略帶灰色，8～18個(gè)高度懷疑的圓潤(rùn)透明如水滴樣可疑菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。

1.2.2 PCR檢測(cè)法 檢測(cè)霍亂毒素基因ctxA和菌毛基因tcpA，取二代堿性胨水增菌液1.5ml，離心6min，棄上清液，加DNA裂解液，離心1min。取上清液做PCR模板，凝膠成儀觀察結(jié)果。出現(xiàn)308bp條帶為ctxA基因陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

選取100份海、水產(chǎn)品同時(shí)用兩種方法進(jìn)行增菌培養(yǎng)，通過(guò)采用常規(guī)分離鑒定法，檢測(cè)到霍亂弧菌呈陽(yáng)性6份 (6%)，通過(guò)PCR檢測(cè)法檢測(cè)出霍亂弧菌呈陽(yáng)性9份 (9%)。兩組檢測(cè)方法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表1)。

表1 兩種檢測(cè)方法比較 (份)Table 1 Comparison of two detection methods

3 討論

霍亂弧菌的主要致病因子是霍亂腸毒素，霍亂腸毒素的檢出對(duì)霍亂弧菌的確定，是否能引起流行，具有較高的流行病學(xué)意義。截至目前為止，細(xì)菌培養(yǎng)、生化檢查以及血清學(xué)鑒定均仍然作為霍亂弧菌實(shí)驗(yàn)室診斷的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”［2］。海、水產(chǎn)品的樣品采集方法直接影響著霍亂弧菌的陽(yáng)性率，在過(guò)去的幾年里，我們大多采用常規(guī)分離鑒定法對(duì)所采集的所有標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，檢疫人員只要熟練掌握培養(yǎng)分離的條件和方法，就能從標(biāo)本中篩離霍亂弧菌的病原菌。因此，該方法在過(guò)去的幾年里，一直被列入《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》和《霍亂防治手冊(cè)》的推廣應(yīng)用中。但伴隨著衛(wèi)生檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，可以發(fā)現(xiàn)，該方法在進(jìn)行增菌培養(yǎng)期間，由于分解代謝的產(chǎn)物不利霍亂弧菌的增殖，有的還會(huì)影響致病菌的生長(zhǎng)，從而阻礙檢出結(jié)果的準(zhǔn)確性。霍亂弧菌在堿性蛋白胨水中生長(zhǎng)迅速，通常檢疫人員會(huì)將標(biāo)本置于37℃的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6～8h后，在取上層培養(yǎng)物做弧菌分離。該菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂和堿性瓊脂上可見(jiàn)，表面無(wú)色，呈圓形，色澤透明，質(zhì)感光滑，濕潤(rùn)，扁平或稍凸起，邊緣整齊。為了方便檢出，近年來(lái)，衛(wèi)生部在《霍亂防治手冊(cè)》中逐步推出海、水產(chǎn)品采用PCR檢測(cè)法。本文就對(duì)五大類海水產(chǎn)品霍亂弧菌污染狀況進(jìn)行調(diào)查，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，100份海、水產(chǎn)品同時(shí)用兩種方法進(jìn)行增菌培養(yǎng)，兩種檢測(cè)方法的靈敏度雖然一致，但對(duì)于含菌量少的標(biāo)本，在檢測(cè)上PCR檢測(cè)法更具優(yōu)勢(shì)。由于在不同的選擇性培養(yǎng)基上，霍亂弧菌會(huì)產(chǎn)生不同的菌落特征，因此，其培養(yǎng)基大多含有膽鹽、十二烷基磺酸鈉、亞硝酸鉀、慶大霉素、多黏菌素等抑菌劑。通過(guò)采用常規(guī)分離鑒定法，檢測(cè)到霍亂弧菌呈陽(yáng)性6例，通過(guò)PCR檢測(cè)法檢測(cè)出霍亂弧菌呈陽(yáng)性9例。即PCR檢測(cè)法比常規(guī)分離鑒定法在霍亂弧菌含量較少的標(biāo)本上，其檢出率高，具有較好的敏感度和特異性。

PCR檢測(cè)方法可分為多重PCR與常規(guī)PCR兩種方法，所謂多重PCR檢測(cè)法，主要是指一次反應(yīng)可檢測(cè)出多種基因，這樣不但大大節(jié)約了所需時(shí)間及成本，還有效提高了檢測(cè)效率。并能克服由于某種外因?qū)е碌臋z測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。并且，多重PCR可快速鑒定其菌屬是否為產(chǎn)毒株，還能從腹瀉患者的糞便標(biāo)本中檢測(cè)到霍亂弧菌的腸道致病菌。從而有效提高感染性腹瀉病原學(xué)診斷的水平，為多種致病菌的快速診斷提供了新的方法。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法由于所用周期長(zhǎng)、工作量大，并且，受環(huán)境、培養(yǎng)條件以及主觀因素影響，不能滿足疾病預(yù)防和控制的需求，不利于實(shí)驗(yàn)室的快速診斷。近年來(lái)，伴隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，檢測(cè)儀器的不斷更新，探針的設(shè)計(jì)顯得尤為精確，通過(guò)采用多通道熒光PCR儀的廣泛使用，多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)也顯得尤為成熟，并且，具有高通量、低成本、高效率等多重優(yōu)勢(shì)，被研究學(xué)者廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌等多種病原體的快速檢測(cè)，成為熱點(diǎn)檢測(cè)方法。建立了四重?zé)晒舛縋CR體系，從分子水平詳細(xì)闡述了霍亂的發(fā)生、發(fā)展、分布等規(guī)律，為霍亂弧菌的研究提供了更多的思路，有效降低了單重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)毒力基因特異度不高造成結(jié)果假陽(yáng)性的弊端，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本，逐漸成為未來(lái)檢測(cè)技術(shù)的新的發(fā)展趨勢(shì)。并且，在進(jìn)行標(biāo)本采集時(shí)，需要注意樣品從采集、運(yùn)送、保存直至檢測(cè)等環(huán)節(jié)均必須嚴(yán)格按照質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的要求。同時(shí)，按照參照《中國(guó)霍亂監(jiān)測(cè)方案》的技術(shù)規(guī)定進(jìn)行操作，每份樣品均需要采集足夠的數(shù)量，確保樣品的代表性及有效性。值得注意的是，從1820年至今，我國(guó)的霍亂流行，都是由國(guó)外傳人引起的，我國(guó)不是霍亂的疫源地圈。

有關(guān)部門必須加強(qiáng)海、水產(chǎn)品的監(jiān)測(cè)，在進(jìn)行海、水產(chǎn)品霍亂弧菌的檢測(cè)中，由于霍亂弧菌菌型復(fù)雜，尤其是甲魚(yú)，一旦受到霍亂弧菌污染，霍亂弧菌可能在其體內(nèi)存活時(shí)間較長(zhǎng)，并污染水體。同時(shí)，可能將霍亂弧菌傳染給消費(fèi)者，導(dǎo)致疾病。通過(guò)本文研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類、貝殼類、甲殼類、蛙類、水母類以及甲魚(yú)均檢出毒力基因?yàn)楫a(chǎn)毒株，具有流行性和致病性的可能。因此，做好霍亂預(yù)防工作，海、水產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況對(duì)食品衛(wèi)生和消費(fèi)健康關(guān)系密切，加強(qiáng)飲食衛(wèi)生監(jiān)督管理，同時(shí)，加強(qiáng)全民健康教育，改善居民的不良飲食習(xí)慣，提醒人們盡量少生食海、水產(chǎn)品以防霍亂弧菌的傳播流行，提高霍亂防治知識(shí)和意識(shí)，切斷傳播途徑，防止霍亂疫情爆發(fā)。對(duì)保障我國(guó)國(guó)際旅行人員健康，保障正常國(guó)際交往和國(guó)際貿(mào)易均有非常積極的意義。綜上所述，兩種方法雖然各有優(yōu)勢(shì)，但PCR檢測(cè)法用于霍亂弧菌的檢測(cè)，能最大限度降低漏檢的可能性，對(duì)臨床檢驗(yàn)及衛(wèi)生檢測(cè)有較高的指導(dǎo)意義。

1 吳以華，徐景野，李岳良，等.微量培養(yǎng)板不同保存時(shí)間對(duì)霍亂弧菌培養(yǎng)效果的觀察［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，27(4):629－630.

2 姚美琳，周發(fā)珍，王榕峰，等.2003—2007年廈門市海倉(cāng)區(qū)外環(huán)境巾霍亂弧菌監(jiān)測(cè)結(jié)果分析 ［J］.預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2008，14(10):924－925.