基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討金匱腎氣丸治療良性前列腺增生癥的潛在作用機(jī)制

邵 波，田 申，萬 水*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院專業(yè)學(xué)位碩士研究生培養(yǎng)基地，安徽 蕪湖 241002；2.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院/蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院 泌尿外科，安徽 蕪湖 241002）

良性前列腺增生（BPH）相當(dāng)于中醫(yī)“精癃”的范疇，又稱癃閉，以小便排出困難為主癥，小便滴瀝量少而能出者稱之為“癃”，小便完全閉塞、少許亦不能出者稱之為“閉”。目前西醫(yī)治療BPH 包括隨訪觀察、口服藥物緩解和手術(shù)治療等方式，而大多數(shù)輕癥患者都會逐漸發(fā)展至必須手術(shù)治療[1]，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)大，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。中醫(yī)認(rèn)為其病機(jī)以“濕熱蘊(yùn)結(jié)下焦，腎與膀胱氣化不利”為主，病理因素本在腎虛、標(biāo)在濕熱。金匱腎氣丸出自漢代醫(yī)家張仲景之手，見于《金匱要略》，由熟地黃、淮山藥、山茱萸、牡丹皮、茯苓、澤瀉、附子、桂枝8 味中藥組成，被譽(yù)為“補(bǔ)腎諸方之祖”[2]，具有溫補(bǔ)腎陽腎氣、行氣利水的功效，與BPH 腎氣虧虛為本的病機(jī)相適應(yīng)。目前，臨床運(yùn)用此方治療BPH 較為普遍，取得了較好的臨床效果，隨訪觀察復(fù)發(fā)率亦低，但具體作用機(jī)制認(rèn)識尚淺。本研究將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，闡明其藥物作用的潛在機(jī)制，以期為金匱腎氣丸治療BPH 的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物相關(guān)成分和靶點(diǎn)篩選

通 過TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）搜集金匱腎氣丸藥之“熟地黃、淮山藥、山茱萸、牡丹皮、茯苓、澤瀉、附子、桂枝”8 味中藥的有效化學(xué)成分，按照口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 進(jìn)行篩選。利用篩選出的化學(xué)成分確定相對應(yīng)的中藥靶點(diǎn)基因。

1.2 BPH 相關(guān)靶點(diǎn)基因篩選

以“Benign prostatic hyperplasia”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）5 個(gè)數(shù)據(jù)庫中搜索疾病相關(guān)基因，將所得基因合并，刪除重復(fù)值后得到交集基因，通過ClusterProfile R package 繪制Venn 圖。

1.3 中藥成分靶基因與BPH 相關(guān)基因合并

將“1.1”“1.2”步驟中所得的中藥靶基因和疾病相關(guān)基因?qū)隒lusterProfile R package 之中，得到交集基因，并繪制Venn 圖。

1.4 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

將“1.3”中所得交集基因整理，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，繪制中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，即“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。將交集基因?qū)朐诰€網(wǎng)絡(luò)平臺STRING11，分析藥物靶點(diǎn)和基因之間是否存在相互作用的關(guān)系，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），將所得蛋白互作關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件之中，由ClusterProfile R package 進(jìn)行兩次篩選，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.5 GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析

將“1.3”中得到的中藥成分和疾病的交集基因，導(dǎo)入ClusterProfile R package進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，繪制相應(yīng)的柱狀圖和氣泡圖。

1.6 蛋白與分子對接

選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中Degree 值排名前三的基因及其所對應(yīng)的有效成分進(jìn)行分子對接，具體步驟如下：①構(gòu)建小分子配體：在PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載小分子配體2D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入ChemBio3D 軟件中轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)，設(shè)置最小自由能優(yōu)化。②蛋白受體準(zhǔn)備：將核心基因在uniprot 數(shù)據(jù)庫對應(yīng)的ID 輸入PDB 數(shù)據(jù)庫中，得到蛋白受體的3D 結(jié)構(gòu)。③PTBQT 文件準(zhǔn)備及確定活性口袋：將蛋白受體和小分子配體的3D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDockTool 軟件中，蛋白分子去除水分子并加氫，3D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為2D 結(jié)構(gòu)并去線條，調(diào)整參數(shù)利用活性口袋將受體分子實(shí)行全覆蓋后導(dǎo)出。④分子對接：配體、受體及其活性口袋的相關(guān)參數(shù)導(dǎo)入Vina軟件中，分子對接后導(dǎo)出，利用PyMOL 軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 金匱腎氣丸有效成分和靶點(diǎn)基因篩選

TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索篩選后得到金匱腎氣丸有效化學(xué)成分共102 種，包含熟地黃2 種、山藥16 種、山茱萸20 種、牡丹皮11 種、茯苓15 種、澤瀉10 種、附子21 種、桂枝7 種。有效化學(xué)成分對應(yīng)基因靶點(diǎn)688 個(gè)。

2.2 BPH 的基因靶點(diǎn)篩選

通過5 個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索、合并刪除重復(fù)值，得到疾病相關(guān)基因3 404 個(gè)，其中交集基因135 個(gè)，見圖1。

圖1 疾病相關(guān)基因Venn 圖Fig. 1 Venn diagram of disease-related genes

2.3 中藥靶基因與BPH 疾病基因合并

將中藥成分靶基因與疾病相關(guān)基因合并，得到交集基因共155 個(gè)，見圖2。

圖2 藥物成分靶點(diǎn)與疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)交集Venn 圖Fig. 2 Venn diagram of genes of intersections of target genes of active components of Jinkui Shenqi pills and BPH-related genes

2.4 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示，有效核心成分共48 種，β-谷甾醇、槲皮素、水黃皮素、山柰酚、常春藤對應(yīng)靶點(diǎn)基因共155 種，有效成分中評分較高的是苷、豆固烯醇等，分值較高靶點(diǎn)有PTGS1、PTGS2、NCOA2、ESR1、ADRA1B、HSP90AB1、PGR等，見圖3。PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中含有11 個(gè)節(jié)點(diǎn)和90 條互作邊，見圖4。11 個(gè)核心基因按照Degree 值從高到低排列依次為：JUN、ESR1、MYC、RELA、HIF1A、TP53、MAPK1、FOS、CCND1、NR3C1、AKT1，見圖5。

圖3 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 Regulatory network of Jinkui Shenqi Pills

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Protein-protein interaction（PPI）network

圖5 PPI 最終網(wǎng)絡(luò)核心圖Fig. 5 Final core of PPI network

2.5 GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析

GO 功能注釋顯示，靶點(diǎn)基因參與了組織氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、脂筏、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等過程，見圖6。KEGG 富集分析顯示這些反應(yīng)過程可通過PI3K-Akt 通路、化學(xué)致癌通路、血脂與動(dòng)脈粥樣硬化通路等通路發(fā)生，見圖7。

圖6 GO 功能注釋氣泡圖Fig. 6 Bubble chart of GO functional annotation analysis

圖7 KEGG 富集通路柱狀圖Fig. 7 Bar chart of KEGG signaling pathway enrichment analysis

2.6 分子對接結(jié)果

按照Degree 值排名前三的核心基因及所對應(yīng)的有效成分完成分子對接，核心基因是JUN、ESR1、MYC，對應(yīng)的有效成分是β-谷甾醇、水黃皮素、槲皮素。結(jié)果顯示，核心基因與有效成分均能自由有效結(jié)合，JUN與β-谷甾醇、ESR1與水黃皮素、MYC與槲皮素結(jié)合的最小自由能分別為-13.7 kcal/mol、-8.2 kcal/mol、-5.7 kcal/mol，最佳對接結(jié)果見圖8。

圖8 JUN 與β-谷甾醇(A)、ESR1 與水黃皮素(B)、MYC 與槲皮素(C)分子對接結(jié)果Fig. 8 Molecular Docking Results of JUN with β-sitosterol ( A ), ESR1 with xanthatin ( B ), MYC with quercetin ( C )

3 討論

現(xiàn)代研究表明，金匱腎氣丸具有抗腫瘤、強(qiáng)免疫、促凋亡作用[3-4]。本研究通過PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行核心基因篩選，得到金匱腎氣丸治療BPH 的核心靶點(diǎn)，靶點(diǎn)基因參與細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用機(jī)制過程。JUN是位于1 號染色體的遺傳基因，由C-JUN蛋白、JUNB和JUND 等亞基因組成的基因大家族[5]，與FOS 原癌基因產(chǎn)物組成激活蛋白-1（AP-1）對人體細(xì)胞正常的增殖調(diào)控、分化調(diào)節(jié)及細(xì)胞凋亡起著十分重要的作用[6]。ESR1即雌激素受體α（ESRα）,具有多態(tài)性特征，最常見的多態(tài)性存在于Xbal 和PvuⅡ兩個(gè)位點(diǎn)，該位點(diǎn)可促使中老年男性前列腺組織增生，有癌變風(fēng)險(xiǎn)[7]。MYC是染色體8q24 上的調(diào)控基因，屬于原癌基因，MYC基因參與細(xì)胞增長分化、代謝凋亡等多個(gè)生理病理過程[8]，研究得出，腫瘤細(xì)胞MYC的表達(dá)水平較正常組織明顯升高，MYC編碼的蛋白質(zhì)借助與DNA 結(jié)合，允許通過RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成rRNA、C-MYC mRNA 和蛋白的生物量增多，從而使凋亡和新生平衡失調(diào)，導(dǎo)致BPH 發(fā)生[9]。

通過GO 功能注釋結(jié)果顯示，金匱腎氣丸參與調(diào)控的分子功能主要富集在細(xì)胞化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、脂筏反應(yīng)等過程之中。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，金匱腎氣丸主要對血脂與動(dòng)脈粥樣硬化通路、PI3K-Akt 通路、人巨細(xì)胞病毒感染通路、化學(xué)物致癌作用通路等起調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，血脂偏高、血壓偏高等因素可直接引起血管內(nèi)皮的損傷，從而加速、促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與進(jìn)展[10]，動(dòng)脈硬化致使骨盆區(qū)域血流減少，前列腺組織缺血缺氧，誘導(dǎo)HIF-1α 等分子表達(dá)，刺激前列腺間質(zhì)細(xì)胞和組織生長，導(dǎo)致前列腺增生。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路是自噬類信號通路的重要途徑，大量研究結(jié)果顯示，該信號通路被激活時(shí)，處于通路上游的PI3K 會首先進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，磷脂酰肌醇磷酸化為磷脂酰肌醇三磷酸后，結(jié)合3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 去磷酸化下游的AKT,進(jìn)一步磷酸化啟動(dòng)mTOR，mTOR 可通過抑制磷酸化Unc-51 自噬激活激酶1（ULK1）的功能,抑制ULK1 對自噬過程的啟動(dòng)，從而限制了細(xì)胞凋亡，引起組織的增生[11]。當(dāng)人體遭受HCMV 感染侵襲時(shí)，抑制因子占優(yōu)勢地位，人體自然殺傷細(xì)胞對機(jī)體衰老細(xì)胞的殺傷效應(yīng)減弱,產(chǎn)生免疫逃逸、凋亡減少、促進(jìn)細(xì)胞衰老等結(jié)果[12]。由以上通路可以推測，金匱腎氣丸可能是通過多條信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)免疫效應(yīng)、抑制動(dòng)脈硬化、減少組織缺血等機(jī)制來治療BPH。

由分子對接結(jié)果可知，金匱腎氣丸核心成分β-谷甾醇、水黃皮素、槲皮素等與靶點(diǎn)基因JUN、ESR1、MYC最小自由能均小于0，具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，其中以JUN與β-谷甾醇的結(jié)合能力最強(qiáng)。β-谷甾醇屬于植物甾醇家族中的一員，具有調(diào)控分裂增殖、細(xì)胞生長周期、細(xì)胞凋亡、抗炎等作用[13]，通過研究富含β-谷甾醇的鋸棕櫚油（VISPO）對BPH 實(shí)驗(yàn)鼠前列腺體積的影響中，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可顯著降低前列腺的體積和質(zhì)量，更有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，其通過影響異常增殖細(xì)胞的生存周期，氧化應(yīng)激激活細(xì)胞線粒體凋亡，抑制組織增生[14]。水黃皮素產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少前列腺體積。槲皮素可降低抗凋亡蛋白Bcl-2 合成、增加促凋亡蛋白BAX 表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。山柰酚作用于ESR1、SRC等靶點(diǎn)，調(diào)控內(nèi)分泌抵抗通路，促進(jìn)前列腺增殖細(xì)胞凋亡。常春藤苷可抑制前列腺組織細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，發(fā)生機(jī)制與調(diào)控PI3K/Akt 通路有關(guān)[15]。豆固烯醇主要作用于TP53、HSP90AA1等靶點(diǎn)，可上調(diào)促凋亡p53 表達(dá)、下調(diào)抗凋亡BCL-2 表達(dá)，影響細(xì)胞酶結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚活性等生物進(jìn)程，調(diào)節(jié)機(jī)體凋亡及新生平衡。

4 結(jié)論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，簡要分析了金匱腎氣丸治療BPH 的作用機(jī)制及通路，研究結(jié)果表明該組方治療BPH 具有多基因、多靶點(diǎn)、多通路的特征，對闡明金匱腎氣丸治療BPH 機(jī)制具有一定意義，后期仍需開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)對結(jié)果加以驗(yàn)證。