大鱗副泥鰍蛋白ACE抑制肽的分離純化與鑒定

董婧琪 何澤賀 田桂芳 邵娟娟 吳小禾

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北 滄州 061000；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；3. 中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 中山 528436)

高血壓是腦血管病的重要表現(xiàn)特征之一，也是治療腦血管病的重要指標(biāo)[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)因破壞腎素—血管緊張素系統(tǒng)與激肽釋放酶—激肽系統(tǒng)之間的平衡而直接引起機(jī)體的高損傷[2]，在血壓的調(diào)控中起到重要作用[3]。降低ACE活性可以有效降低血壓，但是現(xiàn)階段的降壓藥物大多是合成類的ACE抑制劑，如卡托普利、阿克拉普利和依那普利等抑制劑。而使用合成類降壓藥后可能出現(xiàn)咳嗽、皮疹和頭痛等不良反應(yīng)，所以目前合成類降血壓藥物的使用受到限制[4]。此外，已證實(shí)從食物中獲得的抗高血壓肽對(duì)高血壓病人具有降壓效果，而且沒有毒副作用[5]。

大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)為重要的淡水型魚類之一[6]，屬高蛋白低脂肪食品。大鱗副泥鰍蛋白有多種生物活性，ACE抑制活性是其主要活性之一。目前ACE抑制肽的制取方法主要是酶法，而單一的酶類通常具有一定的局限性。何澤賀等[7]對(duì)于復(fù)合酶法提取泥鰍中ACE抑制肽進(jìn)行了研究，但未進(jìn)一步進(jìn)行分離純化與鑒定的研究。研究擬采用脯氨酸蛋白酶和堿性蛋白酶的復(fù)合酶酶解法制取大鱗副泥鰍制備ACE抑制肽，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化與鑒定，旨在為大鱗副泥鰍的ACE抑制肽開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鱗副泥鰍：單只重量約35～45 g，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)市場；

堿性蛋白酶：1萬U/g，美國Sigma公司；

脯氨酸蛋白酶：25 U/g，夏盛(北京)生物科技開發(fā)有限公司；

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶：1 000 U/g，美國Sigma公司；

三羥甲基氨基甲烷(純度≥99.8%)、三(羥甲基)甲基甘氨酸(純度≥99.0%)：分析純，美國Sigma公司；

氫氧化鈉(純度≥96.0%)、鹽酸(36.0%～38.0%)、氯化鈉(純度≥99.5%)：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

絞肉機(jī)：JYL-C020E型，九陽股份有限公司；

冷凍干燥機(jī)：Beta1-8 LD plus型，德國Marin Christ公司；

水浴恒溫振蕩器：SHA-B型，江蘇正基儀器有限公司；

冷凍離心機(jī)：5418 R型，德國艾本德公司；

渦旋混勻儀：MIX1000型，廣東佛衡儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV752N型，上海元析儀器有限公司；

超濾：80EL005型，密理博(中國)有限公司；

恒流泵：HL-2型，上海青浦滬西儀器廠；

反向高效液相色譜儀：1260型，安捷倫科技有限公司；

質(zhì)譜儀：Orbitrap Elite型，賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大鱗副泥鰍蛋白酶解液的制備 大鱗副泥鰍清洗后，熱燙約30 s去除黏液，經(jīng)處理后得泥鰍肉糜，-20 ℃冷凍貯藏。將常溫解凍的肉糜與磷酸緩沖溶液(pH 7.0，0.1 mol/L)制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的勻漿[8]，并使用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)。然后用堿性蛋白酶(1 000 U/g)與脯氨酸蛋白酶(5 U/g)在40 ℃條件下[9]，同步酶解大鱗副泥鰍蛋白3 h，沸水浴10 min，10 000 r/min離心20 min，取上清即得到大鱗副泥鰍的酶解物(PDH)。然后對(duì)PDH進(jìn)行凍干(冷阱溫度-55 ℃，抽氣速率5 L/s)處理，在干燥器中貯藏備用。

1.3.2 超濾 將凍干的PDH溶解在蒸餾水中，并使用超濾進(jìn)行分級(jí)分離，該系統(tǒng)的截留分子量膜范圍為10，5，3，1 kDa。首先使用10 kDa超濾膜對(duì)PDH進(jìn)行超濾，以生成截留液(PDH-Ⅰ)和滲透液。將10 kDa的滲透液在5 kDa的超濾膜上進(jìn)一步分離，獲得5 kDa截留液(PDH-Ⅱ)和滲余液。然后將5 kDa滲透液在3 kDa 超濾膜上分離得到截留液(PDH-Ⅲ)和滲透液，將3 kDa滲透液在1 kDa的超濾膜上分離，獲得1 kDa的截留液(PDH-Ⅳ)和滲透液(PDH-Ⅴ)。分別收集所得的PDH-Ⅰ(>10 kDa)、PDH-Ⅱ(10～5 kDa)、PDH-Ⅲ(5～3 kDa)、PDH-Ⅳ(3～1 kDa)和PDH-Ⅴ(<1 kDa)組分并凍干，備用。

1.3.3 葡聚糖凝膠過濾層析 利用Sephadex G-15層析柱(1.6 cm×80 cm)對(duì)所獲得的PDH-Ⅰ、PDH-Ⅱ、PDH-Ⅲ、PDH-Ⅳ和PDH-Ⅴ組分中ACE抑制活性最高的組分進(jìn)行純化。上樣液質(zhì)量濃度為30 mg/mL，以0.5 mL/min流量用蒸餾水洗脫，收集洗脫液(3 mL/管)，并利用在280 nm處測量的吸光度進(jìn)行監(jiān)測。收集各級(jí)分，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)各級(jí)分進(jìn)行濃縮，并冷凍干燥，備用。

1.3.4 制備型高效液相色譜分離純化 使用安捷倫XSelect?petide CSHTMC18色譜柱(19 mm×150 mm)進(jìn)行純化。A相：體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA純乙腈；B相：體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA水溶液。洗脫條件：A，0～10%，持續(xù)20 min，上樣量800 μL，柱溫30 ℃，流量17 mL/min，檢測波長280 nm。多次上樣并收集不同級(jí)分，進(jìn)行濃縮處理，通過冷凍干燥后保存，并測定其ACE抑制活性。使用與上述相同的條件對(duì)活性最高的組分進(jìn)行第二次RP-HPLC純化。所得純化的肽用于質(zhì)譜分析。

1.3.5 ACE抑制肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜測定 將1.3.4制得的樣品利用Orbitrap Elite質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)進(jìn)行檢測，色譜柱為Thermo Scientific的C18散裝材料填充柱(100 μm×2 cm)和C18分離毛細(xì)管柱(75 μm×15 cm)。將肽重懸于緩沖液A(體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的水溶液)中，裝到預(yù)柱上，用分離柱分離，線性梯度為7%～35%緩沖液B(含有體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈)，然后進(jìn)行LC-MS/MS分析。離子化方式：ESI；電壓2 200 V；以數(shù)據(jù)依賴模式進(jìn)行采集，在FT模式下以120 000的分辨率進(jìn)行全面MS掃描(m/z300～1 700)，然后對(duì)15個(gè)最豐富的離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)MS/MS掃描。自動(dòng)增益控制(AGC)目標(biāo)對(duì)于Orbitrap掃描為1e6離子，對(duì)于MS/MS掃描為5e4離子。動(dòng)態(tài)排除參數(shù)：隔離窗口，m/z2，重復(fù)計(jì)數(shù)1，重復(fù)持續(xù)時(shí)間25 s，排除時(shí)間25 s。

1.3.6 ACE抑制模式鑒定 分別將0.000，0.025，0.050，0.075 mg/mL 的ACE抑制肽添加到0.5，1.0，2.0 mg/mL的 FAPGG底物的反應(yīng)混合物中與ACE反應(yīng)，然后測定ACE的抑制活性。通過Lineweaver-Burk圖研究抑制劑存在下的ACE抑制模式，Lineweaver-Burk圖基于反應(yīng)速率(1/V)和底物濃度(1/S)關(guān)系的倒數(shù)圖。

1.3.7 肽得率的測定 按體積比1∶1將5%的三氯乙酸與蛋白酶水解液混勻，6 000 r/min離心10 min，采用考馬斯亮藍(lán)法，對(duì)上清液中可溶性蛋白含量進(jìn)行測定，按式(1)計(jì)算短肽得率[10]。

(1)

式中：

NSI,TCA——三氯乙酸可溶性氮得率，%；

N1——在5% TCA中的可溶性蛋白質(zhì)量，mg；

N2——PDH中的可溶性蛋白質(zhì)量，mg。

1.3.8 ACE抑制率測定 向微孔板的微孔中分別加入10 μL的ACE溶液和10 μL蛋白水解液，再添加150 μL底物(1.0 mmol/L FAPGG與50 mmol/L的Tris-HCl混勻，NaCl濃度為0.3 mol/L)，然后立刻將微孔板放入預(yù)熱到37 ℃的酶標(biāo)儀中，在340 nm下測定20次吸光值，每次間隔1 min。作為空白對(duì)照，以吸光值(A340 nm)為橫坐標(biāo)，時(shí)間為縱坐標(biāo)作曲線，計(jì)算斜率，通常取10～20 min的斜率來計(jì)算。按式(2)計(jì)算ACE抑制率。

(2)

式中：

ACE,I——ACE抑制率，%；

ΔAI——添加抑制劑時(shí)的斜率；

ΔAB——空白對(duì)照的斜率。

IC50為抑制50% ACE活性時(shí)所需酶解樣品的質(zhì)量濃度。IC50定義為ACE抑制率達(dá)50%時(shí)的多肽質(zhì)量濃度(mg/mL)，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件的概率單位法(probit)計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Means±SD表示試驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件做方差分析(ANOVA)，并進(jìn)行Duncan的新的多范圍測試，以確定其顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDH的超濾分離

在40 ℃下，用堿性蛋白酶和脯氨酸蛋白酶同步酶解大鱗副泥鰍蛋白3 h后，所得酶解產(chǎn)物具有最高ACE抑制活性。大鱗副泥鰍蛋白酶解產(chǎn)物(PDH)IC50為(491.45±15.11) μg/mL。而IC50值越低，ACE抑制活性越高。

采用10，5，3，1 kDa的超濾膜對(duì)PDH進(jìn)行分離，如圖1所示，5種組分中，分子量<1 kDa的PDH-Ⅴ表現(xiàn)出最高的ACE抑制活性，IC50值為(154.70±7.35) μg/mL；而分子量>10 kDa的PDH-Ⅰ的活性最低，IC50值為(533.45±12.89) μg/mL，與Li等[11]研究結(jié)果相符合。分析目前國內(nèi)外對(duì)于食源性ACE的研究，大部分ACE抑制肽的氨基酸個(gè)數(shù)低于10，分子量小，這是分子量<1 kDa的超濾膜分離所得的ACE抑制肽活性最高的原因之一。此外，還有可能由于酶解過程中引入大分子雜質(zhì)，從而影響ACE抑制肽與ACE的結(jié)合，在使用較大分子量超濾膜時(shí)不能充分將其濾去，造成所得組分表現(xiàn)的ACE抑制活性有所降低。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

由此可得，PDH的ACE抑制活性主要取決于其分子量，其ACE抑制活性隨PDH分子量的降低而增加。而超濾是去除大分子、實(shí)現(xiàn)含有<1 kDa分子量肽分級(jí)及提高ACE抑制活性的有效手段。此外，肽得率隨分子量的減小而減小，PDH-Ⅴ的肽得率為3.4%，所以大鱗副泥鰍蛋白并未酶解完全，仍然存在大部分大分子蛋白。因此，后續(xù)將繼續(xù)對(duì)PDH-Ⅴ進(jìn)行純化。

2.2 凝膠過濾層析進(jìn)行純化

將凍干的 PDH-Ⅴ組分用蒸餾水溶解，使用 Sephadex G-15(1.6 cm×80 cm)上通過凝膠過濾層析進(jìn)行純化。凝膠過濾是一種可以分離具有不同分子尺寸的物質(zhì)的方法，并且已被用于從低分子量物質(zhì)中脫鹽蛋白質(zhì)溶液，分離蛋白質(zhì)和其他膠體。由圖2所知，純化得到3個(gè)組分F1、F2和F3，這3個(gè)組分的IC50值分別為(148.45±7.83)，(98.52±5.67)，(172.87±9.78) μg/mL。

圖2 樣品Ⅴ的Sephadex G-15凝膠滲透色譜

通過研究測定表明F2具有最強(qiáng)的ACE抑制活性，與PDH相比，活性提高了4.99倍(表1)。收集F2合并凍干以待進(jìn)一步純化。

2.3 RP-HPLC分離純化

將來自凝膠色譜的組分通過半制備型RP-HPLC進(jìn)一步分離純化。如圖3(a)所示，收集到的5個(gè)組分中，保留時(shí)間為2.07 min的F2-2表現(xiàn)出最強(qiáng)的ACE抑制活性，其IC50值為(17.89±3.28) μg/mL。此外經(jīng)色譜柱分離后所得的色譜圖中出現(xiàn)一些小分子肽的混合物，根據(jù)石杰等[12]的研究進(jìn)行分析可得，可能是由于在進(jìn)行洗脫的過程中，F(xiàn)2中所含的親水性鹽類對(duì)分離造成影響，從而導(dǎo)致部分小分子肽的出現(xiàn)。

圖3 F2組分的反相高效液相色譜圖及各組分的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性值

使用反相高效液相色譜儀進(jìn)行二次分離以獲得純度更高的F2-2組分。由圖4可知，組分F2-2呈現(xiàn)明顯的單一峰，可得肽段較純從而可以用于肽表征。但在特征峰后仍存在含量較低的肽段，為提高F2-2組分純度通過重復(fù)注射在相同的保留時(shí)間收集F2-2級(jí)分并凍干。將級(jí)分重新溶解，用于HPLC-MS/MS分析與肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列測定。

圖4 F2-2組分的反相高效液相色譜圖

2.4 ACE抑制肽的分離純化

純化獲得組分的IC50值和純化倍數(shù)見表1。使用超濾、Sephadex G-15過濾層析、RP-HPLC純化程序從PDH純化ACE抑制肽，純化倍數(shù)達(dá)到27.47倍，得到的目的肽段IC50為(17.89±3.28) μg/mL。

表1 大鱗副泥鰍蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的純化?

2.5 采用質(zhì)譜法測定ACE抑制肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)

利用質(zhì)譜儀對(duì)組分F2-2進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜(MS)與二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)交替處理，而各組分的結(jié)構(gòu)利用分析軟件預(yù)測。其過程為選擇一級(jí)質(zhì)譜所產(chǎn)生的肽段中的母離子(質(zhì)子化分子)，使其進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜，并使其發(fā)生碰撞誘導(dǎo)解離(CID)反應(yīng)分解形成一定量的碎裂離子。由于各個(gè)肽段的質(zhì)量數(shù)不同，而肽序列可利用其間存在的差值進(jìn)行推定，并利用儀器中所含軟件對(duì)肽序列進(jìn)行解析。

如圖5所示，豐度值最高的母離子為m/z345.208，即可得出該目標(biāo)肽段的分子量為321.208 Da。再用m/z345.208 的母離子在二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)中進(jìn)行分析處理。由于氨基酸殘基通過肽鍵連結(jié)形成肽與蛋白質(zhì)，而沿肽骨架斷裂所獲得的是主要的碎裂峰組。在發(fā)生電離反應(yīng)與飛行進(jìn)程中，待測分子產(chǎn)生亞穩(wěn)離子，由于相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量存在差值，而肽的序列測定正是通過分析質(zhì)量差，進(jìn)而識(shí)別相應(yīng)氨基酸殘基。

圖5 組分F2-2的質(zhì)譜圖

肽段在質(zhì)譜分析中的碎裂具有一定規(guī)律，碎片離子主要分為兩類：從N端開始以a、b、c表示，從C端開始以x、y、z表示，在肽鏈中與其他鍵相比，酞胺鍵較易斷裂，因此 b和y系列離子具有相對(duì)較大的出現(xiàn)概率。母離子(345.208)進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜，在譜圖中其相應(yīng)碎片具有標(biāo)注，利用肽的b離子和y離子互補(bǔ)的方法推斷組分的序列為Glu-Gly-His，分子量為345.2 Da。從大鱗副泥鰍蛋白中分離所得ACE抑制肽的氨基酸序列中甘氨酸屬于疏水性氨基酸，石杰等[12]研究表明疏水性氨基酸的存在促進(jìn)ACE抑制肽的抑制活性。組氨酸屬于正電荷氨基酸，Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)正電荷氨基酸可使ACE抑制肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制活性，由此可得此肽段具有較高的ACE抑制活性。

2.6 ACE抑制肽的抑制動(dòng)力學(xué)研究

ACE抑制肽以競爭性、非競爭性和混合型方式抑制ACE的活性[15]，其中多為競爭性抑制，而競爭性抑制劑一般與底物結(jié)構(gòu)較為相似，競爭性抑制劑可與活性位點(diǎn)結(jié)合，阻斷底物和酶之間的相互作用或改變酶的構(gòu)象，從而使底物無法接近活性位點(diǎn)[16-18]。其中底物濃度、抑制劑濃度、底物以及抑制劑與酶的親和能力是影響競爭性抑制的主要因素[19]。

圖6 主成分質(zhì)子數(shù)與電荷數(shù)比為345.208的串聯(lián)質(zhì)譜圖

使用Lineweaver-Burk作圖研究來自PDH肽的ACE抑制模式，測定了存在和不存在抑制劑的酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)[20]。圖7結(jié)果表明，Vmax不會(huì)隨大鱗副泥鰍ACE抑制肽濃度的變化而發(fā)生明顯差異，但Km(反應(yīng)速度為1/2Vmax時(shí)底物濃度的數(shù)值)隨肽濃度的增加而有所提高，表明這種肽是ACE的競爭性抑制劑，可以結(jié)合到肽的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致底物無法與活性位點(diǎn)結(jié)合，從而起到抑制性作用。綜上，PDH水解肽為競爭性抑制肽，具有顯著的ACE抑制活性，作為功能性食品成分或天然降高血壓劑具有良好的市場前景。

圖7 大鱗副泥鰍血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制Lineweaver-Burk模型

3 結(jié)論

研究采用超濾、凝膠過濾層析和半制備RP-HPLC多級(jí)分離技術(shù)構(gòu)建了一種活性高、純度高的大鱗副泥鰍蛋白ACE抑制肽的提取純化方法。所得目標(biāo)肽段的IC50值為(17.89±3.28) μg/mL，與大鱗副泥鰍的初始酶解物相比，ACE抑制活性顯著提高，純化倍數(shù)27.47，其氨基酸序列為Glu-Gly-His，分子量345.2 Da。ACE抑制動(dòng)力學(xué)研究分析表明大鱗副泥鰍抑制肽對(duì)于底物ACE是一種競爭性抑制。由此可得，研究所得的大鱗副泥鰍蛋白ACE抑制肽具有明顯的降壓效果，且原料價(jià)格低廉，來源廣泛，可作為良好的食源性ACE抑制肽來源。但大鱗副泥鰍蛋白ACE抑制肽的體外試驗(yàn)無法確定其在體內(nèi)的降壓效果，仍需進(jìn)行進(jìn)一步的動(dòng)物性試驗(yàn)來驗(yàn)證。