堿異構(gòu)化花生油制備共軛亞油酸工藝優(yōu)化

申秋云 彭清凈

(吉首大學(xué)食藥兩用資源研究與高值化利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000)

共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是含有順式或反式共軛雙鍵的十八碳二烯酸，與亞油酸是位置和構(gòu)象上的異構(gòu)體，其中c9,t11-CLA和t10,c12-CLA具有多種生物學(xué)功能，如降脂、抗氧化、抗癌、促進(jìn)骨骼健康、提高免疫力、防治糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化等[1]。但是，天然CLA只少量的存在于反芻動(dòng)物或植物油脂中，遠(yuǎn)不能滿足需求。

CLA的合成方法主要有生物法和化學(xué)法[2-3]。生物法是利用微生物或亞油酸異構(gòu)酶將非共軛多烯酸轉(zhuǎn)化為共軛多烯酸，如趙微等[4]用植物乳桿菌P-8將亞油酸轉(zhuǎn)化為CLA，Lian等[5]利用固定化的突變脂肪酶 MAS1-H108A 高效合成CLA，但是生物法存在微生物及酶的活性受底物抑制而致轉(zhuǎn)化率較低的缺點(diǎn)，目前尚無(wú)法工業(yè)化生產(chǎn)。從天然不飽和脂肪酸改性合成CLA的化學(xué)法是目前的主流方法，包括Ⅷ族金屬催化共軛法、亞油酸堿催化異構(gòu)化法等。Ⅷ族金屬催化共軛法存在反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜、反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、反應(yīng)條件苛刻、產(chǎn)物中反式結(jié)構(gòu)所占比例較大、過(guò)渡金屬催化劑價(jià)格昂貴且有較大毒性等問(wèn)題[6]。盡管亞油酸堿催化異構(gòu)化法還存在產(chǎn)物提純困難、提取成本較高等不足，但該法過(guò)程簡(jiǎn)單、催化劑易得且無(wú)需特別處理、CLA轉(zhuǎn)化率較高，是目前最有希望工業(yè)化的方法，科研人員對(duì)其開展了大量研究[7-10]。但是，目前亞油酸堿催化異構(gòu)化法主要是以純亞油酸為底物，底物成本較高，需尋找能夠大量廉價(jià)制取CLA的原料資源。山茶油、芝麻油、菜籽油、花生油、葵花籽油等食用油中廣泛存在亞油酸[11]。已有以葵花油[12]、辣椒籽油[13]等植物油為原料經(jīng)堿異構(gòu)化方法制備CLA的研究。相比其他食用油，花生油具有亞油酸含量較高、產(chǎn)量大、價(jià)格相對(duì)低廉的優(yōu)點(diǎn)，且目前尚未有以花生油為原料開展堿異構(gòu)化制備CLA的報(bào)道。研究擬采用花生油制備CLA，分析堿異構(gòu)法制備花生油共軛亞油酸的主要影響因素，探討各試驗(yàn)因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化花生油CLA轉(zhuǎn)化條件，以期為CLA的工業(yè)化開發(fā)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生油：實(shí)驗(yàn)室自制；

亞油酸、CLA標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；

KOH、1, 2-丙二醇、BF3、CH3OH、HCl、Na2SO4、NaCl、正庚烷、正己烷等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓反應(yīng)釜：NSC100-P5-T3-SS1-SV型，安徽科冪機(jī)械科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52CS型，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHK-ⅢS型，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子分析天平：ALB-124型，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC-MS TQ8050型，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 CLA制備方法 將1.0 g亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品置于高壓反應(yīng)釜中，加入20 mL 1,2-丙二醇(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的KOH)，充入氮?dú)馀趴崭锌諝?，然后密閉系統(tǒng)，加熱到180 ℃反應(yīng)3 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，移入燒杯，加HCl調(diào)pH至2～3，用正己烷萃取2次，水洗至中性，加Na2SO4，用玻璃棒攪拌至溶液澄清，靜置2 min，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除多余溶劑，得到產(chǎn)品用于CLA含量分析。

1.3.2 花生油轉(zhuǎn)化單因素試驗(yàn) 將1.0 g花生油置于高壓反應(yīng)釜中，按1.3.1中方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。設(shè)定單因素試驗(yàn)中的常規(guī)量為：反應(yīng)時(shí)間3 h，反應(yīng)溫度180 ℃，醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)20∶1，KOH用量6%。依次考察醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸分別為10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1)、KOH用量(4%，5%，6%，7%，8%)、反應(yīng)時(shí)間(1，2，3，4，5 h)、反應(yīng)溫度(120，150，180，210，240 ℃)對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響。

CLA轉(zhuǎn)化率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

R——CLA轉(zhuǎn)化率，%；

YCLA——異構(gòu)化后花生油中CLA的相對(duì)含量，%；

Z——異構(gòu)前花生油中亞油酸的相對(duì)含量，%。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件，以CLA轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，通過(guò)四因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化反應(yīng)條件。

1.3.4 脂肪酸組成及相對(duì)含量測(cè)定 按GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》中的歸一化法執(zhí)行。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法 所有試驗(yàn)重復(fù)3次，用Design-Expert 8.0.6軟件分析Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果，SPSS 23.0軟件進(jìn)行ANOVA多重比較分析(Turkey法，顯著性水平為0.05)，Origin 2019b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生油主要脂肪酸含量

試驗(yàn)所用花生油主要脂肪酸相對(duì)含量組成：棕櫚酸(11.87±0.47)%，亞油酸(27.85±0.53)%，油酸(59.64±0.57)%。因產(chǎn)地、榨油工藝等不同，花生的亞油酸含量會(huì)有所差異，有研究[14]發(fā)現(xiàn)，花生油中的亞油酸含量最高可達(dá)41.66%，說(shuō)明花生油中亞油酸含量較高，具有作為原料開發(fā)CLA的前景。

2.2 亞油酸異構(gòu)化前后CLA含量變化

對(duì)亞油酸進(jìn)行堿異構(gòu)化處理后，生成的CLA百分含量達(dá)到了65.87%。說(shuō)明試驗(yàn)所用的堿催化異構(gòu)化方法能將亞油酸轉(zhuǎn)化成CLA。

2.3 花生油轉(zhuǎn)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 醇油比對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響 圖1顯示，隨醇油比不斷增大，CLA轉(zhuǎn)化率增大，當(dāng)醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)為20∶1時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值。繼續(xù)增大醇油比，CLA轉(zhuǎn)化率開始減小。這是因?yàn)槿軇┝窟^(guò)少，反應(yīng)體系的黏度過(guò)大，產(chǎn)生的泡沫過(guò)多，反應(yīng)在不均一體系中進(jìn)行，體系傳質(zhì)阻力過(guò)大，導(dǎo)致共軛化不完全，共軛化速度相對(duì)較低；而溶劑過(guò)多，催化劑濃度降低，分子間的有效碰撞機(jī)會(huì)減少，間隔雙鍵生成共軛雙鍵的機(jī)率降低，共軛化效率也相應(yīng)降低[15]，同時(shí)增大了后期溶劑回收處理的難度與能耗。因此，醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)控制在20∶1左右為宜。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3.2 KOH用量對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響 圖2顯示，隨KOH用量不斷增加，CLA轉(zhuǎn)化率增大。當(dāng)KOH用量達(dá)到6%時(shí)，CLA轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，此后繼續(xù)增加KOH，對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率影響不大。這是由于在強(qiáng)堿的作用下，僅碳原子上的氫容易失去，生成碳負(fù)離子中間體，該碳負(fù)離子的負(fù)電荷在2個(gè)C═C雙鍵間離域，增大了體系分子的有效碰撞，有利于共軛化進(jìn)行[16]。但催化劑用量到達(dá)一定量后，與反應(yīng)分子有效碰撞的機(jī)會(huì)基本不再發(fā)生變化，同時(shí)會(huì)使反應(yīng)體系中泡沫過(guò)多，造成分離困難及隨之而來(lái)的CLA損失，產(chǎn)物的顏色也明顯加深。因此，KOH用量控制在6%左右為宜。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響 圖3顯示，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，CLA轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢(shì)，在3 h時(shí)，轉(zhuǎn)化率進(jìn)入平臺(tái)期，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，轉(zhuǎn)化率增加不大，到達(dá)5 h 時(shí)，轉(zhuǎn)化率下降。這是因?yàn)檠娱L(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，各物質(zhì)充分接觸，有利于亞油酸共軛化，但CLA不穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間的高溫反應(yīng)容易發(fā)生降解或其他副反應(yīng)，使得轉(zhuǎn)化率降低，與之前相關(guān)研究[8-9]結(jié)果一致。雖然適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間會(huì)提高CLA轉(zhuǎn)化率，但會(huì)極大地增大設(shè)備的運(yùn)行成本和設(shè)備損耗，因此以2.0，2.5，3.0 h的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3.4 反應(yīng)溫度對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響 圖4顯示，隨反應(yīng)溫度升高，CLA轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在210 ℃達(dá)到最大值，之后轉(zhuǎn)化率小幅度減少。主要是因?yàn)樯郎剡^(guò)高，亞油酸容易發(fā)生聚合、分解以及環(huán)化反應(yīng)，不利于CLA的生成，同時(shí)導(dǎo)致副產(chǎn)物增多[17]。并且丙二醇的沸程為186～188 ℃，溫度過(guò)高易引起溶劑的揮發(fā)或達(dá)到沸程不利于操作，故反應(yīng)溫度選180 ℃左右較適宜。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 試驗(yàn)結(jié)果與分析 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果(表2)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到關(guān)于CLA轉(zhuǎn)化率(Y)影響因素的多元二次回歸方程：

Y=83.92+8.19A+6.13B+3.65C+6.06D-1.3AB+0.034AC+0.15AD+5.91BC-2.58BD-1.12CD-8.58A2-12.28B2-4.88C2+1.89D2。

(2)

由回歸方程可知，因素重要性為反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>KOH用量>醇油比，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。根據(jù)P值判斷，CLA轉(zhuǎn)化率的回歸模型方程達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，失擬項(xiàng)P值不顯著(P>0.05)，擬合度R2=0.945 4，CV%=7.31%，信噪比S/N=12.724(S/N>4)，表明該模型響應(yīng)效果良好，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值能夠很好地?cái)M合，試驗(yàn)結(jié)果可靠。同時(shí)，由表4 可知，方程一次項(xiàng)中A、B、D和二次項(xiàng)中A2、B2均極顯著(P<0.01)，而一次項(xiàng)C和交互項(xiàng)BC均顯著(P<0.05)，表明反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、KOH用量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，而醇油比的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析?

2.4.2 因素間交互作用 將兩個(gè)因素固定在0水平，其余兩因素間的交互作用對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響見圖5。圖5(d)的響應(yīng)面坡度較陡，說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間與醇油比之間交互作用明顯，與之前相關(guān)研究[18]結(jié)果一致。而其他圖的響應(yīng)面坡度較小，即反應(yīng)溫度與其他因素之間、KOH用量與其他因素之間的交互作用不明顯。

2.4.3 工藝優(yōu)化及驗(yàn)證 由Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化得出最優(yōu)反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度200.00 ℃，反應(yīng)時(shí)間2.59 h，醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)21.87∶1，KOH用量7.00%。在此條件下，轉(zhuǎn)化率預(yù)測(cè)值為92.3%。為方便操作，將最優(yōu)條件調(diào)整確定為：反應(yīng)溫度200 ℃，反應(yīng)時(shí)間2.6 h，醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)22∶1，KOH用量7%，在此條件下開展3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化率實(shí)測(cè)值為(89.81±1.64)%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化該工藝條件可行。

圖5 因素交互作用對(duì)CLA轉(zhuǎn)化率的影響

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，花生油中亞油酸相對(duì)含量為27.85%，具有利用其開發(fā)共軛亞油酸的前景。堿異構(gòu)化花生油制備共軛亞油酸的最優(yōu)工藝條件為：反應(yīng)溫度200 ℃，反應(yīng)時(shí)間2.6 h，醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)22∶1，KOH用量7%。在該條件下，共軛亞油酸轉(zhuǎn)化率為89.81%。由于堿異構(gòu)化方法還會(huì)有約5%～10%的其他異構(gòu)體生成，因此堿異構(gòu)化后具有生理活性共軛亞油酸的提純工藝及其他非生理活性成分的安全性還有待研究。